Пролиферативная витреоретинопатия (ПВР) — сложное гетерогенное заболевание, которое является наиболее частым осложнением при витреальной хирургии отслойки сетчатки и характеризуется разрастанием на ее внутренней и наружней поверхности фиброзных мембран, отличающихся контрактильными свойствами и приводящих к тракционной отслойке сетчатки [1—4].

Патогенез ПВР, несмотря на многочисленные исследования ученых, до сих пор остается недостаточно понятным. Ведущая роль при изучении патогенеза ПВР принадлежит экспериментальному моделированию. Экспериментальные модели ПВР не только позволили выяснить патогенетические механизмы, но и оценить эффективность терапевтического воздействия антипролиферативных лекарственных препаратов.

За последние 25—30 лет было показано, что в формировании эпиретинальных и субретинальных мембран основную роль играют клетки ретинального пигментного эпителия (РПЭ), клетки глии, макрофаги из сосудов хориоидеи, т. е. клетки внутриглазных структур [5, 6]. Характерной особенностью этих клеточных элементов в процессе формирования мембран было постепенное превращение в фибробластоподобные клетки в результате их трансдифференцировки, конечным продуктом которой являлось появление фиброзной клеточной популяции с активной секрецией экстраклеточного матрикса, состоящего преимущественно из коллагена I типа. Наиболее ярко выраженные процессы трансдифференцировки отмечались в РПЭ, в котором при ПВР было показано изменение фенотипа клеток, превращение эпителиальной клетки в фибробластоподобную, обладающую специфической функцией: способностью к активной пролиферации и секреции экстраклеточного матрикса [7]. В этой связи вполне адекватной экспериментальной моделью для изучения ПВР была модель с применением культуры фибробластов. В подобных моделях, помимо более быстрого формирования фиброзных эпиретинальных мембран, была отмечена специфическая ультраструктура, характерная для фибробластов, объясняющая появление контрактильных особенностей в новообразованных мембранах [8]. Исследование растущих фибробластов после их имплантации в стекловидное тело показало закономерное присутствие в их цитоплазме так называемых «стресс-фибрилл», характерных для тканей с сократительными свойствами. Подобные фибробласты с сократительной функцией были названы миофибробластами, так как эти фибриллы активно экспрессировали мышечный белок — альфа-мышечный актин. В процессе формирования эпиретинальных мембран (ЭРМ) из пролиферирующих фибробластов отмечалось появление складок сетчатки, развитие очаговой отслойки сетчатки, что подтверждало контрактильные свойства новообразованных ЭРМ.

Таким образом, фибробластная модель отражает исход пролиферативного процесса, наблюдаемого при ПВР в результате сложных иммунобиологических преобразований мигрирующих клеток, возникающих после травмы, регматогенной отслойки сетчатки, осложненных воспалительной реакцией. И если при изучении патогенеза эта модель не включает все многообразие механизмов свойственных ПВР, то для оценки эффективности применения антипролиферативных препаратов она представляет весьма ценный материал, демонстрирующий объективные данные о лечебном эффекте таких препаратов, как 5-фторурацил, митомицин, даунорубицин, кортикостероиды [5, 9].

Вместе с тем морфологические исследования показали, что в характеристике фибробластной модели большое значение имеет активность фибробластных клеток, имеющих аутологичное, гомо- и ксеногенное (гетерологичное) происхождения. Достаточно подробно изучены аутологичные кожные фибробласты, гетерологичные фибробласты не исследованы. Изучение изменений внутриглазных структур при моделировании гетероглогичными фибробластами не проводилось.

Цель данной работы — исследовать патологические изменения в тканях глаза кроликов при интравитреальном введении гетерологичных фибробластов кожи человека, акцентируя внимание не только на образовании ЭРМ, но и на характере реактивных изменений в сетчатке и увеальном тракте и возможном участии их в пролиферативном процессе. Подобный анализ позволит более основательно изучить эффективность местного воздействия антипролиферативной терапии.

Материал и методы

Культура клеток фибробластов кожи человека была получена из коллекции клеточных культур Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Материалом для исследования послужили 6 глаз кроликов породы шиншилла (3 кролика) массой 2,5—3 кг, содержавшихся в стандартных условиях вивария НИИ глазных болезней им. Гельмгольца. Животным после инстилляции 0,5% раствора Alcaini («Alcon») через плоскую часть цилиарного тела в оба глаза инсулиновой иглой 32G интравитреально вводили 0,1 мл культуры клеток — 200 000 клеток в 0,1 мл фосфатного буфера. Животных наблюдали в течение 1 мес с использованием методов офтальмологического исследования: биомикроскопии и офтальмоскопии. После вывода животных из эксперимента глаза энуклеировали, фиксировали в 10% забуференном формалине и подвергали стандартной гистологической обработке. Микроскопическое исследование проводили с помощью микроскопической системы «Leica» с встроенной цифровой камерой при увеличении 200—600.

Результаты

После интравитреального введения культуры фибробластов кожи человека в глаза кроликов в 5 из 6 опытных глаз развилась картина ПВР. Морфологические изменения в экспериментальных глазах при развитии ПВР включали 4 основных компонента: 1) воспалительный процесс; 2) формирование эпиретинальных мембран; 3) изменения РПЭ; 4) изменения в сетчатке.

1. Воспалительный процесс

В тканях глаза при имплантации в стекловидное тело гетерологичных фибробластов появлялись воспалительные изменения, локализация которых имела определенные закономерности, преобладая преимущественно в зоне цилиарного тела и в воронке диска зрительного нерва (ДЗН). В цилиарном теле отмечались скопления лимфоидных клеток в виде округлых инфильтратов. В воронке ДЗН наряду с клетками воспалительной инфильтрации отмечались скопления культуры фибробластов на разных стадиях развития, включая зрелые фибробласты с характерной вытянутой формой и многочисленными отростками. В хориоидее выраженность воспалительной инфильтрации была разной, отмечалась тенденция к образованию лимфоидных узелков. Среди клеточных элементов воспалительного инфильтрата встречались многочисленные плазматические клетки, присутствие которых, видимо, отражало иммунологические процессы в ответ на антигенное воздействие гетерологичных фибробластов.

Постоянным компонентом было появление в полости стекловидного тела трансвитреальных мембран, простирающихся от pars plana цилиарного тела до воронки ДЗН (рис. 1). В этих мембранах отмечались пролиферирующие культуральные фибробласты, окруженные коллагеновыми волокнами и лимфоидными клетками воспалительной инфильтрации. Отмечались также очаги некротического детрита. Подобные мембраны могли имитировать при макроскопическом исследовании отслойку сетчатки.

2. Формирование эпиретинальных мембран

При интравитреальном введении культуры фибробластов закономерным было их распространение вдоль внутренней поверхности сетчатки с образованием ЭРМ от ora serrata до ДЗН (рис. 2). Преобладали в основном 3 варианта мембран.

Вариант 1 (рис. 3). Фиброзные мембраны, состоявшие из зрелых фибробластов удлиненной формы, окруженных коллагеновыми волокнами; эти мембраны вызывали складчатость сетчатки.

Вариант 2 (рис. 4). Клеточные мембраны, состоявшие из пролиферирующих фибробластов с признаками начальной секреции коллагена в виде нежных тонких коллагеновых фибрилл. Распространяясь по плоскости внутренней поверхности сетчатки, эти мембраны не вызывали складчатости сетчатки. Внутренняя пограничная мембрана (ВПМ) под подобными мембранами визуализировалась.

Вариант 3 (рис. 5). Глиальные мембраны, состоявшие из пролиферирующих глиальных элементов. Эти мембраны имели рыхлую ячеистую тонковолокнистую структуру и были интимно спаяны с сетчаткой. В зоне расположения глиальных мембран ВПМ не визуализировалась. Со стороны стекловидного тела мембраны были прикрыты тонкой пленкой из пролиферирующих фибробластов, сопровождавшихся тонкими коллагеновыми фибриллами.

Таким образом, распространение культуры фибробластов по всей внутренней поверхности сетчатки через 1 мес сопровождалось формированием фиброзных мембран в сочетании с клеточной инфильтрацией, в которой определялись культуральные фибробласты, клетки воспалительного характера и мигрирующие клетки РПЭ. Следует подчеркнуть, что наряду с плоскостным характером роста ЭРМ отмечалось появление складок сетчатки, обусловленных тракционными свойствами ЭРМ. В 2 глазах из 5 отмечалась тракционная отслойка сетчатки в виде «столба» (рис. 6). Особенностью этой отслойки было ее формирование около ДЗН вследствие активного процесса ПВР в центральных отделах сетчатки. В результате этого патологического процесса возникала воронкообразная отслойка сетчатки.

3. Патология ретинального пигментного эпителия

Отмечалась распространенная диссоциация клеток РПЭ с потерей гексагональной формы, превращением в более округлые клетки (рис. 7). Нарушение адгезивных свойств РПЭ сопровождалось выходом их из пласта и скоплением в субретинальном пространстве (рис. 8). Вышедшие из пласта клетки теряли пигмент, а в цитоплазматической мембране появлялись многочисленные отростки, что связано с появлением у клеток РПЭ способности к движению и новой функции — миграционной. В результате активных миграционных процессов наблюдалось скопление клеток РПЭ на внутренней поверхности сетчатки. Среди этих клеточных скоплений наблюдались различные переходные формы, напоминающие фибробластоподобные клетки с начальной секрецией экстраклеточного матрикса, что можно расценить как явление трансдифференцировки РПЭ, связанное с изменениями эпителиального фенотипа клеток РПЭ в сторону мезенхимального.

4. Патология сетчатки

Изменения в сетчатке зависели от выраженности пролиферативно-воспалительных процессов при формировании ЭРМ. Отмечались исчезновение наружных сегментов фоторецепторов, истончение наружного и внутреннего ядерных слоев, исчезновение наружного плексиформного слоя. Более выраженные изменения происходили в зонах складчатости сетчатки, где атрофические процессы были более заметными (рис. 9). Подобные изменения были обусловлены развившейся ишемией сетчатки, связанной, видимо, как с патологией РПЭ, его диссоциацией, так и с появлением складок и отслойки сетчатки. Следует отметить активное участие глиальных элементов внутренних слоев сетчатки в формировании ЭРМ (глиальные мембраны).

Обсуждение

Как показали наши экспериментальные данные, введение в полость стекловидного тела культуры клеток фибробластов вызвало характерное их распространение вдоль плотной основы-подложки, которой являлась сетчатка. Осевшие на ее внутренней поверхности культуральные фибробласты, пролиферируя, моделировали ЭРМ. Такая закономерность расположения ЭРМ дает возможность подчеркнуть доминирующую роль сетчатки как основы-подложки в развитии ЭРМ, а не стекловидного тела, хотя в нем также выявлялись пласты фиброзных мембран. В структуре ЭРМ выявлено в основном три клеточных подтипа, которые отражают динамику фибробластического процесса. ЭРМ отличались не только плоскостным расположением клеточно-волокнистых структур, но и появлением складок сетчатки в результате контрактильных свойств, появляющихся в зрелых фиброзных мембранах, и тракционной отслойки сетчатки. Подобное осложнение связано с контрактильным свойством фибробластов, в цитоплазме которых появляется специфический контрактильный аппарат в виде миофиламентов, экспрессирующих альфа-мышечный актин, способный реагировать на внешние стимулы [8], в отличие от прежних представлений, в которых основой контракции фиброзных мембран были коллагеновые формации [10]. Исследования [8] показали, что основой мембранной контракции является клеточный фактор, который в сочетании с экстраклеточным фактором оказывает регулирующее воздействие на контрактивные механизмы мембран. Таким образом, формирующиеся ЭРМ после интравитреальной трансплантации фибробластов характеризуются плоскостным ростом с появлением контрактильных свойств по мере секреции экстраклеточного матрикса в виде складок сетчатки и ограниченной тракционной отслойки сетчатки.

Наряду с основным патологическим процессом, связанным с формированием ЭРМ, выявлены другие изменения в тканях глаза, которые включали воспалительную реакцию, изменения РПЭ и сетчатки. Особенность воспалительной реакции заключалась в появлении элементов иммунного воспаления, об-условленного влиянием гетерологичных фибробластов: узелковый характер воспалительной инфильтрации, плазмацитарная инфильтрация, очаги лизиса. По выраженности воспалительные процессы в основном были сходны с воспалительным процессом при трансплантации аутоиммунных фибробластов [10].

Наиболее выраженные изменения наблюдались в сетчатке. Отмечалась очаговая пролиферация глиальных клеток на внутренней поверхности сетчатки в зоне разрушенной ВПМ, что подтверждало репаративный характер процесса. Данная пролиферация рассматривалась как результат воздействия литических ферментов при гибели инкубированных фибробластов. Однако в процессе пролиферации глиальных клеток не происходило их трансдифференцировки, они сохраняли присущие глиальным тканям свойства, несмотря на изменение формы. Аналогичные изменения формы астроцитов сетчатки наблюдались в культуре клеток астроцитомы [11]. В то же время способность глиальных клеток в процессе репарации к миграции остается недостаточно понятной. Также остается дискуссионным вопрос об участии мюллеровых клеток в формировании ЭРМ [12].

Активная стимуляция миграционных процессов в РПЭ была закономерным явлением при интравитреальной инъекции гетерологичных фибробластов. Работы R. Machemer [13, 14] и последующие исследования показали возможность мигрирующих клеток РПЭ подвергаться процессу трансдифференцировки, в результате чего происходило изменение клеточного фенотипа. Таким образом, в формировании экспериментальной ЭРМ, помимо инкубированных гетерологичных фибробластов, принимают активное участие интраокулярные структуры: глиальные элементы сетчатки (фиброзные астроциты) и мигрирующие клетки РПЭ. Поэтому можно полагать, что в основе действия гетерогенных фибробластов при интравитреальном их введении лежали процессы как стимуляционного, так и воспалительно-репаративного характера, направленные на формирование ЭРМ.

Выводы

1. Интравитреальное введение гетерологичных фибробластов кожи человека вызывало развитие ПВР, которое характеризовалось закономерным плоскостным ростом фибробластов на внутренней поверхности сетчатки как на подложке с формированием ЭРМ. Контрактильные свойства образованной ЭРМ определяли появление складок сетчатки и ограниченной ее отслойки.

2. Введение в стекловидное тело кролика гетерологичных фибробластов сопровождалось развитием вторичных реактивных изменений в тканевых структурах глаза, способствующих проявлению более активного процесса ПВР.

3. При эндовитреальном введении гетерологичных фибробластов отмечались:

— поражение сетчатки: пролиферация глиальных элементов в формировании ЭРМ, а также атрофические изменения фоторецепторных и нейрональных структур;

— поражение РПЭ: диссоциация и выход из пласта, формирование пула мигрирующих клеток с признаками трансдифференцировки с участием в формации ЭРМ;

— воспалительные процессы в увеальном тракте отражали иммунные механизмы трансплантационного иммунитета и, возможно, активировали патологию сетчатки и РПЭ.

4. Экспериментальная фибробластная модель отражала заключительную фиброзную, стадию ПВР и может быть использована для более объективной оценки эффективности антипролиферативных препаратов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: И. Х-М.

Сбор и обработка материала: Н.Л., И. Х-М.

Написание текста: И. Х-М., Н.Л., Е.В.

Редактирование: И. Х-М., А.В.