Изменения суточной освещенности являются серьезным фактором, с которым сталкиваются люди, прибывающие в арктическую и субарктическую зону. В период полярного лета, для которого характерны высокий уровень постоянной световой нагрузки на глаза вследствие солнечной освещенности и повышенная ультрафиолетовая нагрузка из-за большой степени рассеяния атмосферы и отражений от снега и льда, создаются экстремальные фототические условия [1, 2]. И если у некоторых видов животных, постоянно живущих в полярных широтах, эволюционно выработались адаптационные физиологические и поведенческие механизмы, защищающие глаза от повреждения светом и/или ультрафиолетовыми волнами, то у людей, временно находящихся в Арктике, нет устойчивой адаптации к подобным воздействиям, в связи с чем арктические и субарктические условия могут вызывать разнообразные расстройства, например, сезонная фотофобия [3], метаболические нарушения [4], нарушения сна [5, 6].

Считается, что прямое физиологическое действие света на организм опосредуют зрительные фоторецепторы сетчатки глаза, которые играют важную роль в запуске и поддержании циркадных ритмов, а следовательно, зависимых от них физиологических процессов, в самой сетчатке, в супрахиазматическом ядре и в организме в целом [7—9]. Роль света как регулятора ритмических процессов в организме продемонстрирована при их изучении в условиях трансмеридианных перелетов, при ночной работе, длительно пониженном освещении, полной слепоте [10, 11].

Молекулярные механизмы взаимосвязи фоторецепции изучаются. Выяснено, что в функционировании сетчатки важное значение имеет гомеодоменный белок CRX, который является специфическим фактором транскрипции фоторецепторов и регулирует функцию эпифиза [12—15]. На модели животных показано, что ген CRX, кодирующий колбочко-палочковый гомеобокс CRX, индуцирует специфическую для эпифиза экспрессию гена Aanat, которая имеет выраженный циркадный ритм, обусловленный ночным высвобождением норадреналина из симпатических нервных окончаний, локализованных в эпифизе, и тем самым способствует циркадному ритму выработки мелатонина [16]. При мутациях в гене CRX (модель CRX null mice) выявляется снижение специфической экспрессии так называемых эпифиз-специфичных генов и ослабление циркадной зависимости [17]. Так, после удаления фрагмента гена CRX, кодирующего гомеодомен, не было выявлено никаких серьезных морфологических отклонений в сетчатке мышей CRX^-/- и они оставались жизнеспособными и плодородными. Однако экспрессия генов, кодирующих синтез родопсина, α-субъединицы трансдуцина, арестина, вовлеченных в цикл регуляции фототрансдукции, у мышей CRX^-/- была снижена. По данным электроретинографии, функция колбочек была снижена примерно на 90%. На срезах сетчатки CRX^-/- обнаруживалось отсутствие наружных сегментов палочек и колбочек за счет уменьшения фоторецептор-специфичных молекул, включая родопсин и опсин. Экспрессия гена, кодирующего зеленый/красный опсины, у CRX^-/--мышей отсутствовала. В то же время отклонений функции эпифиза у этих мышей не было и экспрессия эпифиз-зависимого гена Aanat, ключевого в синтезе мелатонина, оставалась достаточно высокой.

Из сказанного следует, что для понимания сенсорной адаптации человека к длительному пребыванию в условиях полярного дня, характеризующегося высокой световой нагрузкой на фоторецепторы, требуются всесторонние знания об экспрессии генов сетчатки глаза — как, собственно, циркадных (Clock, Bmal1, Cry1, Cry2, Per1 и т. д.), так и Crx, Otx5 Aanat, Hiomt и других генов, связанных с ее циркадными ритмами.

Цель исследования — определить, есть ли динамика уровня экспрессии гена CRX у человека после длительного временного пребывания в условиях полярного дня.

Материал и методы

Участники исследования и условия выполнения перелета. В этом исследовании приняли участие 6 пилотов (мужчины в возрасте от 39 до 69 лет, средний возраст — 56 лет), которые совершили первый кругосветный арктический авиаперелет на самолетах-амфибиях. Визуальные функции, цветовое и контрастное зрение у всех участников были удовлетворительными.

Перелет был осуществлен в период полярного лета, с 03 июля по 14 августа 2018 г. Общая продолжительность — 43 дня. Движение осуществлялось в направлении с запада на восток: с 62° с.ш. 74° в.д. до 72° с.ш. 114° в.д. Средняя высота — 3000 м. Протяженность маршрута составила более 21 тыс. км, он проходил в том числе вдоль побережья Северного Ледовитого океана, через Тихий и Атлантический океаны. Около 700 км пройдено над льдами и 6000 км — над водой.

Этическая экспертиза. Исследование проводилось в соответствии с принципами, изложенными в международных актах о юридических и этических принципах проведения научных работ с участием человека, и было одобрено этическим комитетом ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» (протокол №3 от 21.06.18). Участники исследования подписали информированное согласие на сбор образцов и информации.

Сбор данных. Забор образцов цельной периферической крови для получения РНК выполняли стандартно при венепункции (BD Vacutainer lavender-top EDTA tubes) перед стартом (Р0) и после финиша (Р+43) полета в дневное время. Полученные образцы крови сразу замораживали в жидком азоте.

Выделение нуклеиновых кислот и синтез комплементарной ДНК (кДНК). Выделение РНК проводили непосредственно из замороженной крови, растворяя часть образца в реагенте — QIAzol (Qiagen GmbH, Германия). После гомогенизации образца выделение проводили согласно протоколу компании-производителя [https://www.qiagen.com/kr/resources/resourcedetail?id=61c3ddbd-69c1-4b68-ab89-a428f14a9245&lang=en]. Концентрация выделенной РНК была измерена с помощью прибора NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США), соотношение 260/280 составило 1,8—2,0. Также был проведен контроль качества выделенной РНК, используя прибор TapeStaton 4200 (Agilent, США). RIN для всех образцов был больше 5. Полученную РНК растворяли в деионизированной воде и обрабатывали ДНКазой I (Thermo Fisher Scientific, США), для синтеза использовали кДНК с помощью обратной транскриптазы Mu-MLV Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Полученную кДНК использовали как матрицу для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.

Олигонуклеотидные праймеры. Подбор олигонуклеотидных праймеров (табл. 1) осуществляли с использованием открытого программного обеспечения Ugene [https://ugene.net/ru/]. Дополнительно уточняли температуру отжига и проводили проверку на предмет отсутствия образования димеров и внутримолекулярных устойчивых структур в программе PerlPrimer [https://perlprimer.sourceforge.net/download.html]. Специфичность праймеров внутри генома человека оценивали с помощью веб-сервиса Primer-BLAST [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi]. Олигонуклеотиды были синтезированы в компании «Евроген» (Россия) [https://evrogen.ru/], используя прибор Applied Biosystems ABI 3900 (Applied Biosystems, Inc., США).

Таблица 1. Праймеры, использованные в работе, и расчетная температура отжига

Примечание. Tm for — температура плавления прямого праймера, Tm rev — температура плавления обратного праймера.

Количественную ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием готовой ПЦР-системы iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, США) с добавлением праймеров (см. табл. 1) по 5 пмоль каждого, а также образцов кДНК в количестве 10 нг на одну реакцию. ПЦР проводили при помощи амплификатора «ДТ-Прайм» («ДНК-технология», Россия) [https://dna-technology.ru/dnaproducts/equipments/rtamplificators/dt96] при следующих условиях: 1) 95 °C, 5 мин; 2) 90 °C, 10 с; 3) 64 °C, 15 с; 4) 72 °C, 20 с (45 циклов 2-->4). Детекцию флюоресценции проводили при 72 °C в конце каждого цикла. Для каждого из образцов также были выполнены три технических повтора ПЦР. Результаты представляют собой среднее всех повторных измерений с определенными стандартными отклонениями. В процессе синтеза кДНК были выровнены концентрации РНК, и в дальнейшем все реакции (синтез кДНК и ПЦР) были проведены с эквивалентными количествами изначальной РНК. Нормализацию выполняли по гену b2M (считали его уровень матричной РНК — мРНК — и приводили к нему соответствующие значения пороговых циклов других генов).

Статистический анализ изменений уровней мРНК. В расчетах использовали сравнительный дельта Ct метод [18]. Экспрессию генов рассчитывали как среднее значение ± стандартное отклонение по данным, полученным в результате трех технических повторов. Уровень мРНК (log2 или значение цикла, на котором детектируется продукт), определенный до полета, сравнивали с уровнем мРНК для образцов, полученных после финиша. Кроме того, результаты были представлены в виде Z-баллов. Расчет Z-score для всех образцов проводили по следующей формуле:

Z=(datapoint(Ct) – среднее(Ct))/SD,

где Ct — пороговый цикл, SD (standard deviation) — стандартное отклонение.

Большее абсолютное значение Z-балла принимали за большее доказательство того, что транскрипционный фактор играет регулирующую роль в различении состояний.

Для определения значимости изменения использовался t-тест. P-value определяли с помощью веб-сервиса Google Docs, применяя парный t-тест Стьюдента для двух независимых выборок. Гены с p-value <0,05 считались значимо меняющими экспрессию.

Результаты

Средние значения уровня мРНК по данным RT-PCR гена CRX и референтных генов b2M, TBP (housekeeping genes) в образцах, взятых на старте и на финише, приведены в табл. 2. Как видно из данной таблицы, после полета в группе обследованных наблюдается экспрессия гена CRX (p<0,01). Общий уровень мРНК увеличился примерно в 3 раза до нормализации и примерно в 7 раз после нормализации по гену b2M по всем биологическим повторам.

Таблица 2. Оценка средних значений экспрессии генов CRX, b2M, TBP в периферической крови в группе до и после перелета

На следующем этапе анализа данных для оценки закономерности динамики экспрессии гена CRX и кластеризации был рассчитан Z-score для всех образцов как на старте, так и после финиша. Графическое отображение изменений экспрессии генов представлено на рис. 1. Профиль экспрессии гена CRX у пилотов на старте и после финиша различен, но вместе с этим была очевидна схожесть направленности изменений (рис. 2). Так, индивидуальный прирост уровень экспрессии продемонстрировал разную величину в диапазоне от –1,53 до –3,07. При этом обращает на себя внимание то, что экспрессия гена CRX возросла после перелета у всех пилотов, кроме одного, у которого уровень экспрессии гена CRX был наиболее высоким на старте и незначительно снизился к окончанию перелета.

Рис. 1. Тепловая карта для значений Z-score (для генов CRX, b2M, TBP).

Диапазон Z-score: от -3 до 3 (объяснение в тексте).

Рис. 2. Точечная диаграмма значений Z-score (представлены данные только для гена CRX) для исследуемых образцов на старте и финише.

У пяти пилотов до перелета Z-score был меньше нуля, в то время как после перелета — больше нуля. Наименьшее значение Z-score было равно –1,81. Вместе с тем, как отмечено, у одного пилота наблюдалась обратная картина: до перелета Z-score был больше нуля, но после перелета — меньше нуля (рис. 3).

Рис. 3. Кластеризация Z-score гена CRX (координата по оси абсцисс — значение Z-score образца на старте, координата по оси ординат — значение Z-score образца на финише).

Образец 1 не попадает в кластер из пяти других образцов, занимая другую (противоположную) координатную четверть.

Обсуждение

В настоящем исследовании впервые проведен анализ экспрессии гена CRX у людей после временного продолжительного пребывания в условиях полярного дня. Сорокатрехдневный арктический перелет был выполнен в широтах, где длительность летнего светового дня составляет от 20 до 24 ч: например, в июле в Kulusuk (Гренландия) — около 20 ч, в Певеке (Россия) или Inuvik (Канада) — 24 ч (незаходящее солнце). При работе в таких условиях (естественный солнечный свет вне помещения и вместе с этим освещение в помещениях зданий, где пилоты находились во время отдыха) возникает повышенное световое воздействие на сетчатку, на ее фоторецепторы. В связи с этим встает вопрос о молекулярных механизмах стабильной физиологической адаптации глаза к световой среде при пребывании человека в арктических условиях в летнее время.

На основании предположения, что длинный фотопериод с измененной в сторону увеличения световой нагрузкой потенциально может вызывать повреждение сетчатки, был поставлен вопрос: как у участников перелета изменяется экспрессия гена CRX, который задействован в механизмах фоторецепции и поддержания функционирования зрительных клеток [13, 14]. Для ответа на него нами сопоставлена дневная экспрессия гена CRX у пилотов до и после совершенного арктического перелета.

Полученные результаты показывают, что у большинства пилотов описанный перелет привел к умеренной экспрессии гена CRX в образцах периферической крови. По значению Z-score пять пилотов из шести сформировали один кластер. При этом уровень мРНК CRX продемонстрировал рост на различную величину. Но, наряду с этим, у одного пилота уровень экспрессии незначительно снизился, и он кластеризовался в другую — противоположную — координатную четверть (см. рис. 3).

Отсутствие экспрессии гена, наблюдаемое у одного из пилотов, трудно объяснить. Поэтому дополнительно были проанализированы индивидуальные факторы, которые могут потенциально снижать или повышать нагрузку на сетчатку глаза. Как оказалось, этот пилот был единственным в составе команды, у кого были имплантированные в оба глазных яблока искусственные хрусталики, которые представляют собой акриловые линзы с ультрафиолетовыми фильтрами и фильтрами синего спектра света (от 400 до 475 нм) со снижением коэффициента пропускания волн синего света от 62%. Кроме того, он же в течение светового дня на протяжении всего перелета, т.е. постоянно, пользовался солнцезащитными очками с многослойным антирефлексным покрытием HCAR, затемнением 70% и защитой от ультрафиолетового излучения. Другие же участники перелета использовали солнцезащитные очки эпизодически, в основном при пилотировании самолета. То, что искусственные хрусталики и ношение специальных очков являются причиной отсутствия экспрессии гена CRX, — лишь предположение, не исключающее возможности влияния других нераспознанных факторов.

Таким образом, выявленные различные уровни экспрессии гена, так же как и отсутствие таковой, свидетельствуют о разных индивидуальных адаптационных возможностях при пребывании в абсолютно одинаковых средовых условиях, в которых находились все пилоты, участвовавшие в этом кругосветном перелете.

Как установлено ранее, гомеодоменный белок CRX является эссенциальным фактором для поддержания нормальных функций фоторецепторов сетчатки [16]. Мутации в гене CRX ассоциированы с нарушениями дифференцировки фоторецепторных клеток, дистрофией колбочек, фоторецепторной дегенерацией, нарушениями фототрансдукции и развитием ретинопатий различной степени тяжести, амавроза Лебера 7-го типа [17]. Кроме того, ряд генов фоторецепторов подавляются в отсутствие CRX [15]. Вместе с этим при сверх(овер)экспрессии CRX, специфичной для фоторецепторного клеточного слоя сетчатки, определяется увеличение числа фоторецепторов палочек, содержащих родопсин. При этом CRX действует синергически с другими факторами транкрипции, такими как NRL, RORB и RAX, для регуляции транскрипции генов, специфичных для фоторецепторных клеток.

Исходя из этого, можно предполагать, что в условиях полярного дня при совокупно избыточной фотостимуляции существует повышенная потребность в транскрипции CRX и экспрессия гена CRX является механизмом световой адаптации, направленным на обеспечение достаточного функционирования возбуждаемых фоторецепторов.

Заключение

Таким образом, полученные результаты подтверждают гипотезу об экспрессии гена CRX после длительного временного пребывания в условиях летнего полярного дня и обнаруживают различную индивидуальную динамику уровня экспрессии в ответ на измененную, одинаково высокую световую нагрузку на фоторецепторы сетчатки глаза, что отражает различия в сенсорной адаптации человека. При этом обращает на себя внимание следующее обстоятельство: наряду с типичным приростом уровня экспрессии, экспрессия гена CRX может отсутствовать, что наблюдалось у одного из пилотов. Этот феномен требует дальнейших целенаправленных исследований.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.Г., О.А., А.Г.

Участник перелета: О.А.

Сбор материала: С.Г., И.А., М.П., М.К.

Обработка материала и статистическая обработка данных: А.Г.

Написание текста: С.Г., О.Ю., А.Г.

Редактирование: С.Г., О.А., Э.Г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.