Анализ функционального значения GWAS-значимого для первичной открытоугольной глаукомы полиморфизма гена CDKN2B-AS1 (in silico исследование)

Читать метаданные

Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) — самая распространенная форма глаукомы, в развитии которой значимую роль играют генетические факторы. По данным полногеномных исследований (Genome Wide Association Studies, GWAS), с ПОУГ ассоциирован ген CDKN2B-AS1.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить in silico функциональное значение GWAS-значимого для первичной открытоугольной глаукомы полиморфизма гена CDKN2B-AS1.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для анализа in silico на основе данных GWAS-каталога были отобраны пять полиморфных локусов гена CDKN2B-AS1 (rs1063192, rs7865618, rs2157719, rs944800, rs4977756), ассоциированных с ПОУГ. Изучены регуляторный потенциал, связь с экспрессией и альтернативным сплайсингом генов полиморфизма гена CDKN2B-AS1. В работе использовались мировые базы данных по функциональной геномике — HaploReg и GTExportal.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выявлено важное функциональное значение полиморфных локусов rs1063192, rs7865618, rs2157719, rs944800, rs4977756 гена CDKN2B-AS1. Данные локусы находятся в области гистонов, маркирующих энхансеры в регионе гиперчувствительности к ДНКазе I более чем в десяти различных органах и тканях, в области регуляторных мотивов ДНК к пяти факторам транскрипции (AIRE, GATA, Tgif1, Pou2f2 и Zfp187), ассоциированы с экспрессией трех генов (CDKN2B-AS1, CDKN2B, CDKN2A) и альтернативным сплайсингом транскриптов двух генов (CDKN2B-AS1 и RP11-149I2.4) в патогенетически значимых для формирования глаукомы культурах клеток, органах, тканях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полиморфизм гена CDKN2B-AS1 (rs1063192, rs7865618, rs2157719, rs944800, rs4977756) имеет важное функциональное значение — связан с экспрессией и альтернативным сплайсингом генов, имеет значимый регуляторный потенциал, что может лежать в основе его ассоциации с ПОУГ.

Ключевые слова:

первичная открытоугольная глаукома

CDKN2B-AS1

полиморфизм

функциональное значение

Авторы:

Елисеева Н.В.

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Пономаренко И.В.

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки России

ORCID: 0000-0002-5652-0166

Чурносов М.И.

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки России

ORCID: 0000-0003-1254-6134

Дата поступления:

24.02.2021

Дата принятия в печать:

13.04.2021

Список литературы:

Егоров Е.А. Национальное руководство по глаукоме: для практикующих врачей. Под ред. Егорова Е.А., Астахова Ю.С., Еричева В.П. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2015.
Starikova D, Ponomarenko I, Reshetnikov E, Dvornyk V, Churnosov M. Novel data about association of the functionally significant polymorphisms of the MMP-9 gene with exfoliation glaucoma in the Caucasian population of Central Russia. Ophthalmic Res. [published online ahead of print, 2020 Oct 23]. https://doi.org/10.1159/000512507
Кириленко М.Ю., Тикунова Е.В., Сиротина С.С., Полоников А.В., Бушуева О.Ю., Чурносов М.И. Изучение ассоциаций генетических полиморфизмов факторов роста с развитием первичной открытоугольной глаукомы. Вестник офтальмологии. 2017;133(3):9-15. https://doi.org/10.17116/oftalma201713339-15
Tikunova E, Ovtcharova V, Reshetnikov E, et al. Genes of tumor necrosis factors and their receptors and the primary open angle glaucoma in the population of central Russia. Int J Ophthalmol. 2017;10(10):1490-1494.
Shiga Y, Akiyama M, Nishiguchi KM, et al. Genome-wide association study identifies seven novel susceptibility loci for primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 2018;27(8):1486-149. https://doi.org/10.1093/hmg/ddy053
Eliseeva N, Ponomarenko I, Reshetnikov E, Dvornyk V, Churnosov M. The LOXL1 gene polymorphisms candidate for exfoliation glaucoma are also associated with a risk for primary open-angle glaucoma in a Caucasian population of Central Russia. Mol Vis. 2021.
Свинарева Д.И. Вклад ген-генных взаимодействий полиморфных локусов матриксных металлопротеиназ в подверженность к первичной открытоугольной глаукоме у мужчин. Научные результаты биомедицинских исследований. 2020;6(1):63-77. https://doi.org/10.18413/2658-6533-2020-6-1-0-6
Елисеева Н.В., Чурносов М.И. Полногеномные исследования первичной открытоугольной глаукомы. Вестник офтальмологии. 2020;136(5): 129-135. https://doi.org/10.17116/oftalma2020136051129
Osman W, Low SK, Takahashi A, Kubo M, Nakamura Y. A genome-wide association study in the Japanese population confirms 9p21 and 14q23 as susceptibility loci for primary open angle glaucoma. Hum Mol Genet. 2012;21(12):2836-2842. https://doi.org/10.1093/hmg/dds103
Ramdas WD, van Koolwijk LM, Ikram MK, et al. A genome-wide association study of optic disc parameters. PLoS Genet. 2010;6(6):e1000978. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000978
Nakano M, Ikeda Y, Tokuda Y, et al. Common variants in CDKN2B-AS1 associated with optic-nerve vulnerability of glaucoma identified by genome-wide association studies in Japanese. PLoS One. 2012;7(3):e33389. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033389
Springelkamp H, Höhn R, Mishra A, et al. Meta-analysis of genome-wide association studies identifies novel loci that influence cupping and the glaucomatous process. Nat Commun. 2014;5:4883.
Springelkamp H, Mishra A, Hysi PG, et al. Meta-analysis of Genome-Wide Association Studies Identifies Novel Loci Associated With Optic Disc Morphology. Genet Epidemiol. 2015;39(3):207-216. https://doi.org/10.1002/gepi.21886
Wiggs JL, Yaspan DL, Hauser MA, et al. Common variants at 9p21 and 8q22 are associated with increased susceptibility to optic nerve degeneration in glaucoma. PLoS. Genet. 2012;8(4):e1002654. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002654
Li Z, Allingham RR, Nakano M, et al. A common variant near TGFBR3 is associated with primary open angle glaucoma. Hum Mol Genet. 2015;24(13): 3880-3892. https://doi.org/10.1093/hmg/ddv128
Springelkamp H, Iglesias AI, Mishra A, et al. New insights into the genetics of primary open-angle glaucoma based on meta-analyses of intraocular pressure and optic disc characteristics. Hum Mol Genet. 2017;26:438-453.
Burdon KP, Macgregor S, Hewitt AW, et al. Genome-wide association study identifies susceptibility loci for open angle glaucoma at TMCO1 and CDKN2B-AS1. Nat Genet. 2011;43:574-578.
Charahkhani P, Burdon RK, Fogarty R, et al. Common variants near ABCA1,AFAP1 and GMDS confer risk of primary open-angle glaucoma. Nat Genet. 2014;(10):1120-112. https://doi.org/10.1038/ng.3079
Ponomarenko I, Reshetnikov E, Altuchova O, et al. Association of genetic polymorphisms with age at menarche in Russian women. Gene. 2019;(686): 228-236.
Ward LD, Kellis M. HaploReg v4: systematic mining of putative causal variants, cell types, regulators and target genes for human complex traits and disease. Nucleic Acids Res. 2016;44(D1):877-881.
GTEx Consortium. The GTEx Consortium atlas of genetic regulatory effects across human tissues. Science. 2020;369(6509):1318-1330. https://doi.org/10.1126/science.aaz1776
Пономаренко И.В., Полоников А.В., Чурносов М.И. Полиморфные локусы гена LHCGR, ассоциированные с развитием миомы матки. Акушерство и гинекология. 2018;(10):86-91. https://doi.org/doi.orgaig.2018.10.86-91
Пономаренко И.В., Решетников Е.А., Полоников А.В., Чурносов М.И. Полиморфный локус rs314276 гена LIN28B ассоциирован с возрастом менархе у женщин Центрального Черноземья России. Акушерство и гинекология. 2019;(2):98-104.
Ponomarenko I, Reshetnikov E, Polonikov A, et al. Candidate genes for age at menarche are associated with endometrial hyperplasia. Gene. 2020;757: 144933. https://doi.org/10.1016/j.gene.2020.144933
Ponomarenko I, Reshetnikov E, Polonikov A, et al. Candidate genes for age at menarche are associated with endometriosis. Reprod Biomed Online. 2020; 41(5):943-956. https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2020.04.016
Ponomarenko I, Reshetnikov E, Polonikov A, et al. Candidate genes for age at menarche are associated with uterine leiomyoma. Front Genet. 2021;11: 512940. https://doi.org/10.3389/fgene.2020.512940
Свинарева Д.И., Чурносов М.И. Роль матриксных металлопротеиназ в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы. Вестник офтальмологии. 2020;136(4):146-150. https://doi.org/10.17116/oftalma2020136041146
Tham YC, Cheng CY. Associations between chronic systemic diseases and primary open angle glaucoma: an epidemiological perspective. Clin Exp Ophthalmol. 2017;45:24-32.

Закрыть метаданные

Глаукома — наиболее распространенное глазное заболевание, которое приводит к серьезным необратимым изменениям и значительной потере зрения, вплоть до полной слепоты [1]. В Российской Федерации количество глаукомных больных превышает 1 млн человек [1], а в мире их число составляет свыше 60 млн, и, по прогнозам, распространенность заболевания в ближайшие десятилетия существенно возрастет, так что к 2040 г. численность больных превысит 110 млн человек [2]. Среди всех форм глауком на долю первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ) приходится от 72 до 96% [1, 3, 4].

Проведенные к настоящему времени молекулярно-генетические исследования ПОУГ продемонстрировали важную роль в формировании заболевания генетических факторов [5—13]. Результаты многочисленных полногеномных ассоциативных исследований (Genome Wide Association Studies, GWAS) свидетельствуют о связи полиморфных локусов гена CDKN2B-AS1 с ПОУГ и различными характеристиками оптического диска (вертикальный размер диска зрительного нерва — ДЗН, площадь экскавации и др.) [10, 14—23].

Выявлено, что рисковое значение для развития ПОУГ имеют аллели A rs4977756 CDKN2B-AS1 (ОШ=1,48 для населения Европы [23]), A rs7865618 CDKN2B-AS1 (ОШ=1,56 для японской популяции [16]), тогда как протективная роль в формировании ПОУГ показана для аллелей G rs1063192 CDKN2B-AS1 (ОШ=0,75 для населения Японии [14]), G rs2157719 CDKN2B-AS1 (ОШ=0,69—0,71 для популяций различного этнического состава — азиаты, европейцы, афроамериканцы [19, 20]), A rs944800 CDKN2B-AS1 (ОШ=0,75 в мультиэтнической популяции — европеоиды, азиаты, афроамериканцы [10]; табл. 1). Следует отметить, что рисковые для ПОУГ генетические варианты полиморфных локусов гена CDKN2B-AS1 (A rs4977756, A rs7865618, A rs1063192, A rs2157719, G rs944800), по данным проекта «1000 геномов» (представлены в табл. 2), в сравнении с «нерисковыми» аллельными вариантами этих локусов встречаются среди населения значительно чаще: в популяциях Европы частоты рисковых для ПОУГ аллелей составляют в целом 0,57—0,68, тогда как в азиатских и афроамериканских популяциях их частоты достигают максимальных значений и составляют уже 0,82—0,90 и 0,67—0,99 соответственно. О высокой распространенности среди населения рисковых для ПОУГ аллелей гена CDKN2B-AS1 свидетельствуют и данные ранее проведенных полногеномных исследований [10, 22]. Так, в работе K. Burdon и соавт. [22] показано, что аллельный вариант A rs4977756 встречается среди больных открытоугольной глаукомой с частотой 0,76, а в контрольной группе — 0,74 (ОШ=1,14). В исследовании Y. Shiga и соавт. [10], в котором была изучена мультиэтническая популяция, включающая европейцев, азиатов, афроамериканцов, выявлено, что аллель G rs944800, ассоциированный с повышенным риском развития ПОУГ, регистрируется у 88% больных и 85% лиц группы контроля.

Таблица 1. Данные литературы об ассоциациях полиморфных локусов гена CDKN2B-AS1 (9p21.3), включенных в исследование, с глаукомой и характеристиками оптического диска (результаты полногеномных исследований, https://www.ebi.ac.uk/gwas/)

Локус	Фенотип	Показатель ассоциации (уровень значимости) (ассоциированный аллель)	Источник
rs1063192	ПОУГ	ОШ=0,75 (p=5·10^–11) (G)	[14]
	Вертикальный размер ДЗН	β= –0,014 мм² (p=6·10^–11) (G)	[15]
rs7865618	ПОУГ	ОШ=1,56 (p=2·10^–9) (A)	[16]
	Вертикальный размер ДЗН	β= –0,013 (p=3·10^–20) (G)	[17]
	Площадь экскавации	β= –0,023 (p=1·10^–21) (G)	[18]
rs2157719	ПОУГ	ОШ=0,69 (p=2·10^–18) (G)	[19]
	ПОУГ	ОШ=0,71 (p=3·10^–33) (G)	[20]
	Вертикальный размер ДЗН	β= –0,013 (p=4·10^–35) (G)	[21]
rs944800	ПОУГ	ОШ=0,75 (p=4·10^–14) (A)	[10]
rs4977756	Открытоугольная глаукома	ОШ=1,50 (p=4,7·10^–9) (A)	[22]
	ПОУГ	ОШ=1,48 (p=7·10^–30) (A)	[23]

Примечание. ОШ — отношение шансов, β — коэффициент линейной регрессии.

Таблица 2. Материалы о функциональном значении (эпигенетические эффекты) GWAS-значимого для ПОУГ ресурса HaploReg (v4.1) (https://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/)

Полиморфизм	Позиция (hg38)	Ref	Alt	Частота альтернативного аллеля (alt) в различных этно-территориальных группах (данные проекта «1000 геномов»)				Enhancer histone marks*	DNAse*	Motifs	GRASP QTL	dbSNP func annot
Полиморфизм	Позиция (hg38)	Ref	Alt	Африка	Америка	Азия	Европа	Enhancer histone marks*	DNAse*	Motifs	GRASP QTL	dbSNP func annot
rs1063192	22003368	G	A	0,99	0,79	0,82	0,57		1	AIRE, GATA, Tgif1	3	3’-UTR
rs7865618	22031006	G	A	0,99	0,80	0,90	0,58	2			4	intronic
rs2157719	22033367	C	T	0,99	0,80	0,90	0,58	2	6	Pou2f2, Zfp187	4	intronic
rs944800	22050899	A	G	0,99	0,86	0,90	0,68	12	4	GATA		intronic
rs4977756	22068653	G	A	0,67	0,78	0,79	0,60		1		2	intronic

Примечания. ref — референсный аллель; alt — альтернативный аллель; Enhancer histone marks — расположение полиморфизма в регионе энхансера; DNAse — расположение полиморфизма в регионе гиперчувствительности к ДНКазе I; * — приведено количество органов и/или тканей, в которых данный полиморфизм проявляет эпигенетические эффекты; Motifs — расположение полиморфизма в регионе регуляторного мотива ДНК; GRASP QTL — данные о связи полиморфизма с экспрессией генов (указано количество значимых ассоциаций); dbSNP func annot — расположение полиморфизма в функциональном участке гена CDKN2B-AS1.

В ряде полногеномных исследований также показаны ассоциации полиморфных локусов гена CDKN2B-AS1 с различными значимыми в отношении ПОУГ характеристиками оптического диска — вертикальным размером диска зрительного нерва (ДЗН; rs1063192 [15], rs7865618 [17], rs2157719 [21]) и площадью экскавации (rs7865618 [18]; см. табл. 1). При этом важно подчеркнуть, что протективные для ПОУГ аллельные варианты гена CDKN2B-AS1 связаны с меньшими значениями вертикального размера ДЗН и площади экскавации, что соответствует современным представлениям об этиопатогенезе ПОУГ [1, 4]. Так, например, аллели G rs1063192 и G rs2157719 гена CDKN2B-AS1 ассоциированы с низким риском ПОУГ (ОШ=0,75 [14] и ОШ=0,69—0,71 [19, 20] соответственно) и меньшим вертикальным размером ДЗН (β= –0,014 мм²[15] и β= –0,013 [21] соответственно). Аналогично аллель G rs7865618 CDKN2B-AS1 имеет протективное значение для ПОУГ (для альтернативного ему аллеля A ОШ=1,56 [16]) и связан с меньшими значениями вертикального размера ДЗН (β= –0,013 [17]) и площади экскавации (β= –0,023 [18]).

Следует отметить, что полиморфные локусы гена CDKN2B-AS1, ассоциированные с ПОУГ, находятся в интронных участках этого гена (т.е. не приводят к изменению аминокислотной последовательности в кодируемом полипептиде и не влияют на его активность), и поэтому до настоящего времени в значительной степени остаются неизвестными биологические механизмы, лежащие в основе ассоциаций полиморфизма гена CDKN2B-AS1 с ПОУГ.

Цель работы — изучение in silico функционального значения GWAS-значимого для ПОУГ полиморфизма гена CDKN2B-AS1.

Материал и методы

В соответствии с целью настоящей работы для исследования были отобраны пять полиморфных локусов гена CDKN2B-AS1 (rs1063192, rs7865618, rs2157719, rs944800, rs4977756), ассоциированных с ПОУГ, а также с различными характеристиками оптического диска (вертикальный размер ДЗН, площадь экскавации) по данным полногеномных исследований (см. табл. 1) [10, 14—21, 23]. Для поиска полиморфных локусов использовался каталог полногеномных исследований National Human Genome Research Institute (https://www.genome.gov/gwastudies/). Среди включенных в настоящее исследование пяти полиморфных локусов гена CDKN2B-AS1 уровень патогенности в базе данных Clinvar National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) представлен лишь для одного полиморфизма — rs1063192 (протективный фактор для заболеваний сосудов сердца), а по остальным четырем локусам информация в базе данных Clinvar отсутствует.

На следующем этапе работы in silico был проведен анализ функционального значения этих полиморфных локусов — изучались их эпигенетические эффекты, ассоциации с экспрессией генов (eQTL) и альтернативным сплайсингом транскриптов генов (sQTL) [24]. В работе использовались следующие современные мировые базы данных по функциональной геномике: 1) изучение эпигенетических эффектов — программа HaploReg (v4.1) (https://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/) [25] (рассматривалась модель Core 25-state model using 12 imputed marks); 2) связь SNPs с экспрессией генов в различных органах и тканях — база данных GTExportal (https://www.gtexportal.org/) [26]; 3) ассоциации SNPs с уровнем альтернативного сплайсинга генов — база данных GTExportal (https://www.gtexportal.org/) [26]. В онлайн-базе данных GTExportal приведены результаты международного проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx) [26], демонстрирующие показатели экспрессии и альтернативного сплайсинга генов в 15 201 образце из 49 различных органов и тканей 838 индивидуумов (dbGaP Accession phs000424.v8.p2). При изучении связи аллельных вариантов исследуемых полиморфных локусов с изменением аффинности мотивов ДНК к транскрипционным факторам, их ассоциации с уровнем транскрипции генов и альтернативным сплайсингом транскриптов генов использовались методики, представленные в ранее опубликованных работах [27—31]. Для оценки ассоциации рассматриваемых референсных и альтернативных аллелей изучаемых полиморфизмов гена CDKN2B-AS1 с уровнем экспрессии и альтернативного сплайсинга различных генов применялся коэффициент линейной регрессии (β), который описывает изменение в сторону уменьшения (отрицательное значение показателя) или увеличения (положительное значение показателя) нормализованного значения величины экспрессии гена или сплайсинга интронного участка гена на один минорный (альтернативный) генетический вариант (в работу включались статистически значимые eQTL и sQTL при p<8·10^–⁵и p_FDR≤0,05).

Результаты и обсуждение

Регуляторные эффекты (regSNP). При изучении эпигенетических эффектов пяти полиморфных локусов гена CDKN2B-AS1 выявлено (см. табл. 2), что три полиморфизма (rs7865618, rs2157719, rs944800) находятся в регионе модифицированных гистоновых белков, маркирующих энхансеры в различных культурах клеток, органах и тканях (культуры клеток мезодермы, эктодермы и энтодермы, мезенхимные стволовые клетки, фибробласты, ядра адипоцитов и др.). Четыре SNPs: rs1063192, rs2157719, rs944800, rs4977756 — локализуются в регионе гиперчувствительности к ДНКазе I более чем в 10 различных культурах клеток, органах и тканях (разные отделы головного мозга взрослого, головной мозг плода, первичная культура нейросфер, культура клеток — предшественников нейронов и др.). Три полиморфизма (rs1063192, rs2157719, rs944800) расположены в регионе пяти регуляторных мотивов ДНК к факторам транскрипции (AIRE, GATA, Tgif1, Pou2f2 и Zfp187).

По данным HaploReg (v4.1), аллель G rs1063192 гена CDKN2B-AS1 повышает аффинность к факторам транскрипции AIRE [различие между LOD scores аллелей G (alt) и A (ref) составляет 12,0], GATA [различие между LOD scores аллелей G (alt) и A (ref) составляет 12,0] и снижает аффинность к транскрипционному фактору Tgif1 [различие между LOD scores аллелей G (alt) и A (ref) составляет –11,8]. Аллель G rs2157719 снижает сродство регуляторного мотива ДНК к факторам транскрипции Pou2f2 [различие между LOD scores аллелей G (alt) и A (ref) составляет –2,0] и Zfp187 [различие между LOD scores аллелей G (alt) и A (ref) составляет –5,4], а аллель A rs944800 повышает аффинность к транскрипционному фактору GATA [различие между LOD scores аллелей A (alt) и G (ref) составляет 12,0].

Влияние на транскрипцию генов (eQTL-данные). На основе данных проекта Genotype-Tissue Expression установлены значимые (p<8·10^–5, p_FDR≤0,05) ассоциации четырех из пяти рассматриваемых нами полиморфных локусов гена CDKN2B-AS1 (rs1063192, rs7865618, rs2157719, rs944800) с уровнем транскрипции трех генов (CDKN2B-AS1, CDKN2B, CDKN2A). Лишь полиморфизм rs4977756 не имеет самостоятельного eQTL-значения.

Выявлено, что аллель A rs944800 ассоциирован с низкой экспрессией гена CDKN2B-AS1 в культуре клеток фибробластов (для аллеля G этого полиморфного локуса β=0,26, p=2,60·10^–6, p_FDR≤0,05), а аллели G rs1063192, rs7865618 и rs2157719 гена CDKN2B-AS1 связаны с пониженной экспрессией гена CDKN2A в коре головного мозга (для аллелей A этих полиморфных локусов β=0,33, p=3,10·10^–5, p_FDR≤0,05, β=0,33, p=4,50·10^–5, p_FDR≤0,05 и β=0,33, p=4,50·10^–5, p_FDR≤0,05 соответственно) и повышенной транскрипцией гена CDKN2B в скелетной мускулатуре (для аллелей A этих полиморфных локусов β= –0,14, p=5,10·10^–5, p_FDR≤0,05, β= –0,14, p=8,50·10^–5, p_FDR≤0,05 и β= –0,14, p=9,0·10^–5, p_FDR≤0,05 соответственно).

Ассоциации с альтернативным сплайсингом транскриптов генов (sQTL-данные). Выявлены ассоциации изучаемых нами полиморфных локусов гена CDKN2B-AS1 с уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта двух генов (CDKN2B-AS1 и RP11-149I2.4) в гипофизе (p<8·10^–5, p_FDR≤0,05) (для всех пяти полиморфизмов ID интрона 21995161:22046751:clu_55270). Следует отметить, что с низким уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта генов CDKN2B-AS1 и RP11-149I2.4 в гипофизе ассоциированы аллели G rs1063192 (для аллеля A β=0,47, p=7,90·10^–9, p_FDR≤0,05), rs7865618 (для аллеля A β=0,47, p=1,20·10^–8, p_FDR≤0,05), rs2157719 (для аллеля A β=0,47, p=1,30·10^–8, p_FDR≤0,05), rs4977756 (для аллеля A β=0,43, p=9,30·10^–8, p_FDR≤0,05) и аллель A rs944800 (для аллеля G β=0,40, p=4,00·10^–6, p_FDR≤0,05).

Таким образом, согласно полученным нами данным, полиморфные локусы rs1063192, rs7865618, rs2157719, rs944800 и rs4977756 гена CDKN2B-AS1 имеют значимый регуляторный потенциал и важное eQTL- и sQTL-значение. Следует отметить, что пять изученных нами полиморфных локусов гена CDKN2B-AS1, несмотря на то что находятся на значительном расстоянии друг от друга (63,5 kb), достаточно сильно сцеплены между собой (r²≥0,57, D’≥0,90) и вследствие этого их функциональные эффекты могут «перекрываться». Данные полиморфные локусы расположены в области гистонов, маркирующих энхансеры и регионе гиперчувствительности к ДНКазе I более чем в 10 различных органах и тканях, области регуляторных мотивов ДНК к пяти факторам транскрипции (AIRE, GATA, Tgif1, Pou2f2 и Zfp187), ассоциированы с экспрессией трех генов (CDKN2B-AS1, CDKN2B, CDKN2A) и альтернативным сплайсингом транскриптов двух генов (CDKN2B-AS1 и RP11-149I2.4). Важно отметить, что свои функциональные эффекты (эпигенетические, eQTL, sQTL) эти локусы проявляют в патогенетически значимых для формирования ПОУГ культурах клеток, органах и тканях: фибробластах, центральной нервной системе (кора головного мозга, гипофиз) и др.

В настоящем исследовании in silico установлено, что аллель G rs1063192 гена CDKN2B-AS1 (согласно данным литературы, имеющий протективное значение для развития ПОУГ среди населения Японии [14]) повышает аффинность к факторам транскрипции AIRE и GATA, снижает сродство к транскрипционному фактору Tgif1, связан с более низкой экспрессией гена CDKN2A в коре головного мозга и повышенной транскрипцией гена CDKN2B в скелетной мускулатуре, определяет пониженный уровень альтернативного сплайсинга транскрипта генов CDKN2B-AS1 и RP11-149I2.4 в гипофизе. Аналогичное влияние на экспрессию генов CDKN2A и CDKN2B в коре головного мозга и скелетной мускулатуре, а также на уровень альтернативного сплайсинга транскрипта генов CDKN2B-AS1 и RP11-149I2.4 в гипофизе, согласно полученным нами данным, оказывает и аллель G rs7865618 гена CDKN2B-AS1 (по данным литературы, он является протективным фактором развития ПОУГ в японской популяции [16]). Нами выявлено, что аллель G rs2157719 (согласно ранее проведенным полногеномным исследованиям, ассоциированный с низким риском развития ПОУГ в популяциях различного этнического состава — азиаты, европейцы, афроамериканцы [19, 20]) снижает сродство регуляторного мотива ДНК к факторам транскрипции Pou2f2 и Zfp187, связан с низкой транскрипцией гена CDKN2A в коре головного мозга и высокой экспрессией гена CDKN2B в скелетной мускулатуре, определяет пониженный уровень альтернативного сплайсинга транскрипта генов CDKN2B-AS1 и RP11-149I2.4 в гипофизе. Также в результате настоящего исследования установлено, что аллель G rs4977756 (данные литературы свидетельствуют о протективном значении этого генетического варианта для развития ПОУГ среди европеоидного населения [23]) связан с низким уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта генов CDKN2B-AS1 и RP11-149I2.4 в гипофизе. Полученные нами результаты указывают на то, что аллель A rs944800 (согласно материалам ранее проведенных полногеномных исследований, служащий протективным фактором развития ПОУГ в популяциях различного этнического состава — азиаты, европейцы, афроамериканцы [10]) повышает аффинность к транскрипционному фактору GATA, ассоциирован с низкой экспрессией гена CDKN2B-AS1 в культуре клеток фибробластов и низким уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта генов CDKN2B-AS1 и RP11-149I2.4 в гипофизе.

Итак, протективные для ПОУГ, согласно результатам проведенных ранее полногеномных исследований [10, 14, 16, 19, 20, 23], полиморфные варианты гена CDKN2B-AS1 — аллели G rs4977756, G rs7865618, G rs1063192, G rs2157719, A rs944800, в соответствии с полученными нами in silico данными, повышают аффинность к факторам траскрипции AIRE и GATA, снижают сродство к транскрипционным факторам Tgif1, Pou2f2 и Zfp187, ассоциированы с низкой экспрессией гена CDKN2B-AS1 в культуре клеток фибробластов и гена CDKN2A в коре головного мозга, повышенной транскрипцией гена CDKN2B в скелетной мускулатуре, связаны с низким уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта генов CDKN2B-AS1 и RP11-149I2.4 в гипофизе. Эти функциональные эффекты полиморфных локусов rs1063192, rs7865618, rs2157719, rs944800 и rs4977756 гена CDKN2B-AS1 могут являться медико-биологической основой их ассоциаций с ПОУГ.

В данной работе нами in silico выявлена связь полиморфизма гена CDKN2B-AS1 с уровнем экспрессии этого гена в культуре клеток фибробластов. Следует отметить, что фибробласты, являясь одним из основных структурных элементов соединительной ткани организма, играют ключевую роль в образовании белков коллагена и эластина, а также других компонентов внеклеточного матрикса (протеогликаны и др.), которые, согласно данным литературы, имеют важное значение в этиопатогенезе глаукомы [32]. Соединительная ткань играет существенную роль в возникновении заболевания в рамках механической теории патогенеза ПОУГ, при этом наблюдается дисбаланс в образовании компонентов экстрацеллюлярного матрикса (коллагена, протеогликанов, молекул клеточной адгезии), что в результате обусловливает повышение жесткости и снижение эластических свойств роговицы и склеры глаза [4, 32]. Снижение ригидности фиброзных оболочек глаза и внутриглазных структур (трабекулярной и решетчатой диафрагм) — один из важных локальных факторов риска возникновения ПОУГ [1]. Считается, что нарастающая дезорганизация, деструкция соединительной ткани как переднего, так и заднего отдела глаза является начальным звеном патогенеза первичной глаукомы [4].

В результате проведенного in silico анализа мы показали связь GWAS-значимых для ПОУГ полиморфных локусов гена CDKN2B-AS1 с экспрессией гена CDKN2A в коре головного мозга и уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта генов CDKN2B-AS1 и RP11-149I2.4 в гипофизе, что согласуется с современными представлениями о ключевой роли различных отделов центральной нервной системы (кора головного мозга, гипофиз) в регуляции всех процессов, происходящих в организме, в том числе имеющих важное значение для патофизиологии глаукомы (метаболических, сосудистых и др.) [4]. Такие хронические системные заболевания, как гипертензия, сахарный диабет и ожирение, вовлеченность в развитие которых коры головного мозга и гипофиза в настоящее время не вызывает сомнений, могут коррелировать с ключевыми патогенетическими процессами ПОУГ — повышением внутриглазного давления и нарушением сосудистого снабжения головки зрительного нерва [33]. Вазоспазм, артериальная гипертензия и гипотензия, ночное снижение артериального давления являются важными факторами риска развития ПОУГ в рамках сосудистой концепции патогенеза заболевания [4]. Метаболические нарушения в организме, согласно данным литературы, повышают риск развития глаукомы и играют ключевую роль в патофизиологии заболевания [1, 4]. Современные данные свидетельствуют об общих «генетических основах» ряда хронических системных заболеваний и ПОУГ. Так, в полногеномном исследовании Y. Shiga и соавт. [10] установлены значимые генетические корреляции между ПОУГ и такими заболеваниями, как сахарный диабет 2-го типа (r²=0,27; p=0,0002), инфаркт миокарда (r²=0,20; p=0,02), ишемический инсульт (r²=0,27; p=0,04).

Материалы базы данных GeneCards: The Human Gene Database свидетельствуют о том, что ген CDKN2B-AS1 (относится к группе генов, кодирующих lncRNA) расположен в кластере генов CDKN2B и CDKN2A на хромосоме 9p21 и кодируемая им lncRNA, взаимодействуя с поликомбинированными репрессивными комплексами 1 (PRC1) и 2 (PRC2), приводит к значительным эпигенетическим изменениям: PRC2 метилирует гистон Н3 на лизине 27, т.е. приводит к появлению модифицированных гистоновых белков H3K27me3 — маркер «молчащей» ДНК, а PRC1, взаимодействуя с H3K27me3 и моноубиквитинируя гистоны H2A на лизине 119 (H2AK119Ub1), ингибирует активированную форму комплекса преинициирования РНК-полимеразы II, что обеспечивает сохранение длительного эпигенетического «молчания» хроматина. Конечный результат этих процессов — подавление экспрессии генов, так как происходят значительные изменения структуры хроматина, при которых транскрипционные факторы не могут связываться с промоторными последовательностями ДНК. Следует отметить, что с интронного участка гена CDKN2B-AS1, согласно базе данных GTExportal, транскрибируется еще один ген — RP11-149I2.4, для которого sQTL-значение имеют исследуемые нами полиморфные локусы. RP11-149I2.4 относится к генам, контролирующим образование длинных некодирующих РНК (lncRNAs) (https://www.ensembl.org/), информация о нем в базах данных GeneCards: The Human Gene Database и Ensembl не представлена.

По данным GeneCards: The Human Gene Database (https://www.genecards.org/), ген CDKN2A (cyclin dependent kinase inhibitor 2A) кодирует несколько (не менее трех) вариантов транскрипта, которые различаются своими первыми экзонами. Два из них кодируют структурно родственные изоформы, известные как ингибиторы циклин-зависимой киназы CDK4. Третий транскрипт содержит альтернативную открытую рамку считывания и кодирует белок, который является стабилизатором белка — супрессора опухоли p53 (за счет взаимодействия с Е3 убиквитин-белковой лигазой MDM2 и белком, ответственным за деградацию р53). Несмотря на структурные и функциональные различия, белки, кодируемые геном CDKN2A, имеют сходное функциональное значение: за счет регуляторной роли CDK4 и p53 контролируют G1-фазу клеточного цикла и тем самым служат важными регуляторами роста клеток.

Ген CDKN2B кодирует ингибитор 2В циклин-зависимых киназ (CDK), который, образуя комплекс с CDK4 или CDK6, предотвращает активацию этих киназ. Кодируемый геном CDKN2B белок, контролируя G1-фазу клеточного цикла, является важным регулятором роста клеток. В индукцию экспрессии этого гена вовлечен трансформирующий фактор роста β (TGF-β), и именно с CDKN2B связывают индуцированное TGF-β ингибирование роста. Имеются данные о двух вариантах альтернативного сплайсинга транскрипта этого гена, которые кодируют различные белки (https://www.genecards.org/).

Заключение

В результате проведенного in silico исследования выявлено важное функциональное значение GWAS-значимых для ПОУГ полиморфных локусов rs1063192, rs7865618, rs2157719, rs944800 и rs4977756 гена CDKN2B-AS1. Эти полиморфные локусы расположены в области гистонов, маркирующих энхансеры, в регионе гиперчувствительности к ДНКазе I более чем в 10 различных органах и тканях, области регуляторных мотивов ДНК к пяти факторам транскрипции (AIRE, GATA, Tgif1, Pou2f2 и Zfp187), ассоциированы с экспрессией трех генов (CDKN2B-AS1, CDKN2B, CDKN2A) и альтернативным сплайсингом транскриптов двух генов (CDKN2B-AS1 и RP11-149I2.4) в патогенетически значимых для формирования ПОУГ культурах клеток, органах и тканях. Установленные нами медико-биологические эффекты полиморфных локусов гена CDKN2B-AS1 могут лежать в основе их ассоциации с глаукомой, что расширяет представления об отдельных механизмах патофизиологии заболевания.

Участие авторов:

Концепция и дизайн: Н.Е., М.Ч., И.П.

Сбор и обработка материала: Н.Е., М.Ч., И.П.

Написание текста: Н.Е., М.Ч.

Редактирование: М.Ч., Н.Е.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.