Изучение функционального значения полиморфных локусов гена LOXL1, ассоциированных с глаукомой по данным полногеномных исследований (анализ in silico)

Читать метаданные

Глаукома является одним из наиболее распространенных заболеваний глаз, приводящих к слепоте, и в ее формировании, как показали результаты полногеномных исследований, важное значение имеют генетические факторы.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Провести анализ in silico функционального значения полиморфных локусов гена LOXL1, ассоциированных с глаукомой, используя данные полногеномных исследований.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

С использованием каталога полногеномных исследований (GWAS) National Human Genome Research Institute (https://www.genome.gov/gwastudies/) были отобраны для исследования три полиморфных локуса гена LOXL1 (rs2165241, rs4886776, rs893818), ассоциированных с глаукомой (псевдоэксфолиативная глаукома/синдром). На основании современных баз данных по функциональной геномике (SIFT, PolyPhen-2, HaploReg, GTExportal) проведена оценка функционального значения этих полиморфных локусов (несинонимические замены, эпигенетические эффекты, связь с экспрессией генов, ассоциации с альтернативным сплайсингом транскриптов генов).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследовании установлено важное функциональное значение полиморфных локусов rs2165241, rs4886776 и rs893818 гена LOXL1. Они демонстрируют существенные эпигенетические эффекты (влияют на аффинность к пяти факторам транскрипции, расположены в регионе промоторов и энхансеров, в области гиперчувствительности к ДНКазе-1), ассоциированы с экспрессией и альтернативным сплайсингом трех генов (LOXL1, LOXL1-AS1, RP11-24D15.1) в патогенетически значимых для формирования глаукомы культурах клеток, органах и тканях, сильно сцеплены с полиморфизмом rs1048661, который обусловливает замену аминокислоты Arg141Leu в полипептиде LOXL1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полиморфные локусы гена LOXL1 (rs2165241, rs4886776 и rs893818) имеют важное функциональное значение (эпигенетическое, eQTL и sQTL), что может являться медико-биологической основой их ассоциаций с глаукомой.

Ключевые слова:

глаукома

ген LOXL1

полиморфизм

функциональное значение

Авторы:

Елисеева Н.В.

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Пономаренко И.В.

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки России

ORCID: 0000-0002-5652-0166

Чурносов М.И.

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки России

ORCID: 0000-0003-1254-6134

Дата поступления:

24.02.2021

Дата принятия в печать:

29.04.2021

Список литературы:

Егоров Е.А. Национальное руководство по глаукоме: для практикующих врачей. Под ред. Егорова Е.А., Астахова Ю.С., Еричева В.П. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2015.
Елисеева Н.В., Чурносов М.И. Этиопатогенез первичной открытоугольной глаукомы. Вестник офтальмологии. 2020;136(3):79-86. https://doi.org/10.17116/oftalma202013603179
Tham YC, Li X, Wong TY, Quigley HA, Aung T, Cheng CY. Global Prevalence of Glaucoma and Projections of Glaucoma Burden through 2040: A Systematic Review and Meta-Analysis. Ophthalmology. 2014;121(11):2081-2090. https://doi.org/10.1016/j.ophtha.2014.05.013
Liu Y, Allingham RR. Molecular genetics in glaucoma. Exper Eye Res. 2011; 93:331-339.
Брежнев А.Ю., Баранов В.И., Иванов В.П., Куроедов А.В. Генетика псевдоэксфолиативного синдрома и псевдоэксфолиативной глаукомы: роль полиморфизмов гена LOXL1. Глаукома. Журнал НИИ ГБ РАМН. 2012;(3):53-56.
Aboobakar IF, Allingham RR. Genetics of exfoliation syndrome and glaucoma. Int Ophthalmol Clin. 2014;54(4):43-56. https://doi.org/10.1097/IIO.0000000000000042
Тикунова Е.В., Чурносов М.И. Генетические исследования при первичной открытоугольной глаукоме. Вестник офтальмологии. 2014; 130(5):96-99.
Кириленко М.Ю., Тикунова Е.В., Сиротина С.С., Полоников А.В., Бушуева О.Ю., Чурносов М.И. Изучение ассоциаций генетических полиморфизмов факторов роста с развитием первичной открытоугольной глаукомы. Вестник офтальмологии. 2017;133(3):9-15. https://doi.org/10.17116/oftalma 201713339-15
Tikunova E, Ovtcharova V, Reshetnikov E, et al. Genes of tumor necrosis factors and their receptors and the primary open angle glaucoma in the population of central Russia. Int J Ophthalmol. 2017;10(10):1490-1494.
Sakurada Y, Mabuchi F. Genetic Risk Factors for Glaucoma and Exfoliation Syndrome Identified by Genome-wide Association Studies. Curr Neuropharmacol. 2018;16(7):933‐941. https://doi.org/10.2174/1570159X15666170718142406
Свинарева Д.И. Вклад ген-генных взаимодействий полиморфных локусов матриксных металлопротеиназ в подверженность к первичной открытоугольной глаукоме у мужчин. Научные результаты биомедицинских исследований. 2020;6(1):63-77. https://doi.org/10.18413/2658-6533-2020-6-1-0-6
Eliseeva N, Ponomarenko I, Reshetnikov E, Dvornyk V, Churnosov M. The LOXL1 gene polymorphisms candidate for exfoliation glaucoma are also associated with a risk for primary open-angle glaucoma in a Caucasian population of central Russia. Mol Vis. 2021;27:262-269. eCollection 2021.
Starikova D, Ponomarenko I, Reshetnikov E, Dvornyk V, Churnosov M. Novel data about association of the functionally significant polymorphisms of the MMP-9 gene with exfoliation glaucoma in the Caucasian population of Central Russia [published online ahead of print, 2020 Oct 23]. Ophthalmic Res. 2020;10.1159/000512507. https://doi.org/10.1159/000512507
Thorleifsson G, Magnusson KP, Sulem P, et al. Common sequence variants in the LOXL1 gene confer susceptibility to exfoliation glaucoma. Science. 2007;317:1397-1400.
Nakano M, Ikeda Y, Tokuda Y, et al. Novel common variants and susceptible haplotype for exfoliation glaucoma specific to Asian population. Sci Rep. 2014;4:5340. https://doi.org/10.1038/srep05340
Shiga Y, Akiyama M, Nishiguchi KM, et al. Genome-wide association study identifies seven novel susceptibility loci for primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 2018;27(8):1486-1496. https://doi.org/10.1093/hmg/ddy053
Елисеева Н.В., Чурносов М.И. Полногеномные исследования первичной открытоугольной глаукомы. Вестник офтальмологии. 2020;136(5): 129-135. https://doi.org/10.17116/oftalma2020136051129
Aung T, Ozaki M, Mizoguchi T, et al. A common variant mapping to CACNA1A is associated with susceptibility to exfoliation syndrome [published correction appears in Nat Genet. 2015;47(6):689]. Nat Genet. 2015;47(4):387-392. https://doi.org/10.1038/ng.3226
Zagajewska K, Piątkowska M, Goryca K, et al. GWAS links variants in neuronal development and actin remodeling related loci with pseudoexfoliation syndrome without glaucoma. Exp Eye Res. 2018;168:138-148. https://doi.org/10.1016/j.exer.2017.12.006
Zanon-Moreno V, Zanon-Moreno L, Ortega-Azorin C, et al. Genetic polymorphism related to exfoliative glaucoma is also associated with primary open-angle glaucoma risk. Clin Exp Ophthalmol. 2015;43(1):26-30. https://doi.org/10.1111/ceo.12367
Chen L, Jia L, Wang N, et al. Evaluation of LOXL1 polymorphisms in exfoliation syndrome in a Chinese population. Mol Vis. 2009;15:2349-2357.
Pasutto F, Zenkel M, Hoja U, et al. Pseudoexfoliation syndrome-associated genetic variants affect transcription factor binding and alternative splicing of LOXL1. Nat Commun. 2017;8:15466. https://doi.org/10.1038/ncomms15466
Ponomarenko I, Reshetnikov E, Altuchova O, et al. Association of genetic polymorphisms with age at menarche in Russian women. Gene. 2019;(686): 228-236.
Ponomarenko I, Reshetnikov E, Polonikov A, et al. Candidate genes for age at menarche are associated with endometriosis. Reprod Biomed Online. 2020; 41(5):943-956. https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2020.04.016
Kumar P, Henikoff S, Ng PC. Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm. Nat Protoc. 2009;4(7):1073-1081.
Adzhubei IA, Schmidt S, Peshkin L, et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 2010;7(4):248-249. https://doi.org/10.1038/nmeth0410-248
Ward LD, Kellis M. HaploReg v4: systematic mining of putative causal variants, cell types, regulators and target genes for human complex traits and disease. Nucleic Acids Res. 2016;44(D1):877-881.
GTEx Consortium. The GTEx Consortium atlas of genetic regulatory effects across human tissues. Science. 2020;369(6509):1318-1330. https://doi.org/10.1126/science.aaz1776.
Пономаренко И.В., Полоников А.В., Чурносов М.И. Полиморфные локусы гена LHCGR, ассоциированные с развитием миомы матки. Акушерство и гинекология. 2018;10:86-91. https://doi.org/10.18565/aig.2018.10.86-91
Пономаренко И.В., Решетников Е.А., Полоников А.В., Чурносов М.И. Полиморфный локус rs314276 гена LIN28B ассоциирован с возрастом менархе у женщин Центрального Черноземья России. Акушерство и гинекология. 2019;(2):98-104. https://doi.org/10.18565/aig.2019.2.98-104
Ponomarenko I, Reshetnikov E, Polonikov A, et al. Candidate genes for age at menarche are associated with endometrial hyperplasia. Gene. 2020;757: 144933. https://doi.org/10.1016/j.gene.2020.144933
Ponomarenko I, Reshetnikov E, Polonikov A, et al. Candidate genes for age at menarche are associated with uterine leiomyoma. Front Genet. 2021;11: 512940. https://doi.org/10.3389/fgene.2020.512940
Shiga Y, Akiyama M, Nishiguchi KM, et al. Genome-wide association study identifies seven novel susceptibility loci for primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 2018;27(8):1486-1496. https://doi.org/10.1093/hmg/ddy053
Shen L, Walter S, Melles RB, Glymour MM, Jorgenson E. Diabetes Pathology and Risk of Primary Open-Angle Glaucoma: Evaluating Causal Mechanisms by Using Genetic Information. Am J Epidemiol. 2016;183(2):147-155. https://doi.org/10.1093/aje/kwv204
Rozpędek-Kamińska W, Wojtczak R, Szaflik JP, Szaflik J, Majsterek I. The Genetic and Endoplasmic Reticulum-Mediated Molecular Mechanisms of Primary Open-Angle Glaucoma. Int J Mol Sci. 2020;21(11):4171. https://doi.org/10.3390/ijms21114171
Hauser MA, Aboobakar IF, Liu Y, et al. Genetic variants and cellular stressors associated with exfoliation syndrome modulate promoter activity of a lncRNA within the LOXL1 locus. Hum Mol Genet. 2015;24(22):6552‐6563. https://doi.org/10.1093/hmg/ddv347
Свинарева Д.И., Чурносов М.И. Роль матриксных металлопротеиназ в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы. Вестник офтальмологии. 2020;136(4):146-150. https://doi.org/10.17116/oftalma2020136041146
Schlötzer-Schrehardt U, Pasutto F, Sommer P, et al. Genotype-correlated expression of lysyl oxidase-like 1 in ocular tissues of patients with pseudoexfoliation syndrome/glaucoma and normal patients. Am J Pathol. 2008;173(6): 1724-1735. https://doi.org/10.2353/ajpath.2008.080535
Panoutsopoulos AA, Gartaganis VS, Giannakopoulos MP, Goumas PD, Anastassiou ED, Gartaganis SP. Lysyl oxidase-like 1 polymorphisms in a southwestern Greek cataract population with pseudoexfoliation syndrome. Clin Ophthalmol. 2016;10:161‐166. https://doi.org/10.2147/OPTH.S90789
Yaz Y, Yıldırım N, Aydın Yaz Y, Çilingir O, Yüksel Z, Mutlu F. Three Single Nucleotide Polymorphisms of LOXL1’ in a Turkish Population with Pseudoexfoliation Syndrome and Pseudoexfoliation Glaucoma. Turk J Ophthalmol. 2018;48(5):215‐220. https://doi.org/10.4274/tjo.83797
Wu M, Zhu XY, Ye J. Associations of polymorphisms of LOXL1 gene with primary open-angle glaucoma: a meta-analysis based on 5,293 subjects. Mol Vis. 2015;21:165‐172.
Wiggs JL, Pasquale LR. Expression and regulation of LOXL1 and elastin-related genes in eyes with exfoliation syndrome. J Glaucoma. 2014;23(8 suppl 1):62‐63. https://doi.org/10.1097/IJG.0000000000000124
Schlötzer-Schrehardt U, Zenkel M. The role of lysyl oxidase-like 1 (LOXL1) in exfoliation syndrome and glaucoma. Exp Eye Res. 2019;189:107818. https://doi.org/10.1016/j.exer.2019.107818
Sun M, Kraus WL. From Discovery to Function: The Expanding Roles of Long NonCoding RNAs in Physiology and Disease. Endocr Rev. 2015;36:25-64.
Schmitz SU, Grote P, Herrmann BG. Mechanisms of long noncoding RNA function in development and disease. Cell Mol Life Sci. 2016;73:2491-2509.

Закрыть метаданные

Глаукома, являющаяся одним из наиболее распространенных и тяжелых заболеваний глаз, характеризуется важным медико-социальным значением, постоянным ростом заболеваемости, тяжелыми исходами, приводя к слепоте и инвалидности [1, 2]. По данным Y.C. Tham и соавт. [3], в мире среди лиц в возрасте 40—80 лет глаукомой страдают более 60 млн человек, а к 2040 г. распространенность заболевания, по прогнозам, существенно возрастет и превысит 110 млн человек. Роль генетических факторов в формировании глаукомы в настоящее время не вызывает сомнений [4—13]. По данным нескольких полногеномных ассоциативных исследований (genome wide association study, GWAS), проведенных в этнически различных популяциях (европеоидные, азиатские), значимые ассоциации с глаукомой продемонстрировал ген лизилоксидазоподобного фермента LOXL1 (табл. 1) [14—16]. При этом если до недавнего времени считалось, что полиморфизм гена LOXL1 ассоциирован только с ПЭГ/ПЭС [14, 15, 17—19], то в последние годы в ряде работ показаны ассоциации этого гена с первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) [20], в том числе в полногеномных исследованиях [16].

Таблица 1. Данные литературы об ассоциациях полиморфных локусов гена LOXL1 (15q24.1), включенных в исследование, с глаукомой, ПЭГ/ПЭС (результаты полногеномных исследований, https://www.ebi.ac.uk/gwas/)

Локус	Фенотип	Показатель ассоциации (уровень значимости) (ассоциированный аллель)	Источник
rs2165241	Глаукома ПЭГ ПЭС	OR=1,96 (p=1,30·10^–16) (T) OR=3,62 (p=1,0·10^–27) (T) OR=0,24 (p=2,77·10^–10) (С)	[14] [14] [19]
rs4886776	ПЭС (Япония) ПЭС (не Япония)	OR=9,87 (p=2,13·10^–217) (A) OR=0,49 (p= 2,35·10^–31) (A)	[18] [18]
rs893818	ПЭГ	OR=20,94 (p= 3·10^–84) (T)	[15]

Примечание. ПЭГ — псевдоэксфолиативная глаукома, ПЭС — псевдоэксфолиативный синдром, OR — отношение шансов.

В GWAS-исследовании G. Thorleifsson и соавт. [14], проведенном в популяции Исландии и Швеции на выборке из 564 пациентов с глаукомой (274 больных ПЭГ и 290 пациентов с ПОУГ) и 14 672 человек контрольной группы, установлено рисковое значение аллеля T rs2165241 гена LOXL1 как для ПЭГ (OR=3,62; p=1,00·10⁻²⁷), так и для глаукомы в целом (OR=1,96, p=1,30·10^–16). Следует отметить, что рисковый для глаукомы аллель T rs2165241 LOXL1 достаточно широко распространен среди индивидуумов, не имеющих этого заболевания (по данным работы [14], его частота составила 0,473 и 0,535 в контрольных группах из Исландии и Швеции соответственно), тогда как среди больных ПЭГ данный генетический вариант встречается с максимальной частотой (0,753 и 0,813 в популяциях Исландии и Швеции соответственно [14]). Более высокая распространенность аллеля T rs2165241 гена LOXL1 у пациентов с ПОУГ (78,0%) в сравнении с контрольной группой (68,5%) была выявлена и в работе V. Zanon-Moreno и соавт. [20] в испанской популяции. В данной работе на выборке из 232 больных ПОУГ и 241 человека контрольной группы установлено, что аллель T и генотип TT rs2165241 гена LOXL1 являются факторами риска развития ПОУГ в средиземноморской популяции (OR=1,44 и OR=2,07 соответственно). В 2019 г. в полногеномном исследовании K. Zagajewska и соавт. [19], выполненном в другой европейской популяции — польской, показана значимая роль полиморфизма rs2165241 гена LOXL1 в формировании ПЭС без глаукомы (выборка составила 103 больных ПЭС без глаукомы и 106 индивидуумов контрольной группы): аллель C является протективным фактором развития ПЭС без глаукомы (OR=0,24), тогда как референсный для него аллель T существенно повышает риск развития заболевания (OR=4,2; p=2,77·10^–10). Генотип TT, являющийся рисковым для ПЭС без глаукомы, в польской популяции (OR=6,93, p=1,04·10^–10) был зарегистрирован у подавляющего большинства больных (67,0%) и значительно реже встречался в контрольной группе (22,6%) [19]. Обращает на себя внимание тот факт, что полиморфные варианты локуса rs2165241 гена LOXL1 имеют разнонаправленный характер ассоциаций с развитием заболевания в популяциях разного этнического состава. Так, если в европейских популяциях фактором риска развития глаукомы в целом, ПЭГ, ПЭС без глаукомы является аллель T rs2165241 [14, 19], то в азиатских популяциях, наоборот, фактором риска формирования ПЭС служит аллель C rs2165241 [21, 22]. Также следует отметить, что в европейских популяциях, как правило, частым аллелем является аллель T rs2165241, тогда как в азиатских — аллель C rs2165241 [19—21]. Следует отметить, что значительные различия в частотах аллелей между европейскими и азиатскими популяциями наблюдаются и по другим полиморфным локусам гена LOXL1 (табл. 2, приведены данные проекта «1000 геномов»). Аналогичные данные о разнонаправленности ассоциаций с ПЭС, но уже другого локуса гена LOXL1 — rs4886776, в популяциях разного этнического состава получены и в полногеномном исследовании T. Aung и соавт. [18]: аллель A полиморфизма rs4886776 LOXL1 повышает риск развития заболевания в японской популяции (OR=9,87; p=2,35·10^–217) и, что стало, как указывают авторы в своей работе, «сюрпризом» для них, служит протективным фактором для ПЭС в неяпонских популяциях, в том числе и европеоидных (OR=0,49; p=2,35·10^–317).

Таблица 2. Данные о функциональном значении (эпигенетические эффекты) GWAS-значимого для глаукомы полиморфизма гена LOXL1 (15q24.1) (получены с использованием биоинформатического ресурса HaploReg (v4.1); https://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/)

Полиморфизм	Позиция (hg38)	Ref	Alt	Частота альтернативного аллеля (alt) в различных этно-территориальных группах (данные проекта 1000 геномов)				Promoter histone marks*	Enhancer histone marks*	DNAse*	Motifs	GRASP QTL	Selected eQTL	dbSNP func annot
Полиморфизм	Позиция (hg38)	Ref	Alt	Африка	Америка	Азия	Европа	Promoter histone marks*	Enhancer histone marks*	DNAse*	Motifs	GRASP QTL	Selected eQTL	dbSNP func annot
rs2165241	73929861	T	C	0,77	0,54	0,90	0,54	8	20	2	Arid5a, Foxa, Foxj2	4	2	intronic
rs4886776	73932655	G	A	0,12	0,26	0,51	0,33		12	5	GR, Hand1		2	intronic
rs893818	73936854	G	A	0,16	0,27	0,51	0,33		24	3			3	intronic

Примечание. ref — референсный аллель; alt — альтернативный аллель; Promoter histone marks — расположение полиморфизма в регионе промотора, Enhancer histone marks — расположение полиморфизма в регионе энхансера, DNAse — расположение полиморфизма в регионе гиперчувствительности к ДНКазе-1; * — приведено количество органов и/или тканей, в которых данный полиморфизм проявляет эпигенетические эффекты; Motifs — расположение полиморфизма в регионе регуляторного мотива ДНК; GRASP QTL и Selected eQTL — данные о связи полиморфизма с экспрессией генов (указано количество значимых ассоциаций); dbSNP func annot — расположение полиморфизма в функциональном участке гена LOXL1.

Следует отметить, что, как правило, полиморфные локусы, ассоциированные с глаукомой, располагаются в интронных областях гена LOXL1 (не влияют на последовательность аминокислот в кодируемом им белке и его активность), и поэтому биологические механизмы, лежащие в основе ассоциаций полиморфизма гена LOXL1 с глаукомой, остаются в значительной степени неизвестными.

Цель работы — изучение in silico функционального значения полиморфных локусов гена LOXL1, ассоциированных с глаукомой, по данным полногеномных исследований.

Материал и методы

На первом этапе работы с использованием каталога полногеномных исследований National Human Genome Research Institute (https://www.genome.gov/gwastudies/) были отобраны для исследования три полиморфных локуса гена LOXL1 (rs2165241, rs4886776, rs893818), ассоциированных с глаукомой, ПЭГ, ПЭС без глаукомы, по данным GWAS [14, 15, 18, 19] (см. табл. 1). Информация об уровне патогенности рассматриваемых полиморфизмов в базе данных Clinvar Национального Центра биотехнологической информации Национальной медицинской библиотеки США (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) имеется только для локуса rs2165241, который, согласно материалам этого информационного ресурса, имеет рисковое значение для развития псевдоэксфолиативного синдрома. Далее с использованием современных мировых баз данных по функциональной геномике проведена оценка функционального значения этих полиморфных локусов. Нами оценивалась связь изучаемых полиморфных локусов с несинонимическими заменами, их эпигенетические эффекты, ассоциации с экспрессией генов (eQTL) и альтернативным сплайсингом транскриптов генов (sQTL) [23, 24]. Для оценки функциональных эффектов полиморфизмов были использованы следующие базы данных: SIFT (https://sift.jcvi.org/) [25] и PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml) [26] (выявление миссенс-мутаций и оценка их предиктивного потенциала), HaploReg (v4.1) (https://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/) [27] (изучение эпигенетических эффектов — рассматривалась модель Core 25-state model using 12 imputed marks), GTExportal (https://www.gtexportal.org/) [28] (связь SNPs с экспрессией генов и альтернативным сплайсингом транскриптов генов в различных органах и тканях). Следует отметить, что база данных свободного доступа GTExportal содержит материалы анализа транскрипции и альтернативного сплайсинга генов, полученные международным консорциумом в рамках проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx) [28] (приведены результаты анализа РНК сиквенсов из 49 различных органов и тканей, полученных от 838 индивидуумов; dbGaP Accession phs000424.v8.p2). Анализ ассоциации аллельных вариантов рассматриваемых полиморфных локусов с изменением аффинности мотивов ДНК к факторам транскрипции, оценка их связи с уровнем транскрипции генов и альтернативным сплайсингом транскриптов генов проводились по методикам, представленным в ранее опубликованных работах [29—32]. Для установления связи полиморфизма гена LOXL1 (референсного и альтернативного аллелей каждого изучаемого локуса) с экспрессией и альтернативным сплайсингом различных генов нами использовался представленный в онлайн-программе GTExportal показатель (коэффициент) линейной регрессии (β). Положительное значение этого коэффициента (β>0) указывает на связь конкретного аллеля (альтернативного генетического варианта) с повышенной экспрессией/альтернативным сплайсингом данного гена, тогда как отрицательное значение коэффициента линейной регрессии (β<0) свидетельствует о снижении уровня транскрипции/альтернативного сплайсинга гена при наличии у индивидуума альтернативного аллеля. В настоящем исследовании использовались данные об ассоциациях полиморфизма гена LOXL1 с экспрессией и альтернативным сплайсингом генов при уровне статистической значимости p<8·10^–⁵и с учетом поправки на ложноположительные результаты p_FDR≤0,05.

Результаты и обсуждение

Несинонимичные замены (nsSNP). Из трех рассматриваемых полиморфных локусов гена LOXL1 несинонимичных SNP выявлено не было. Установлено, что с локусами rs4886776 и rs893818 гена LOXL1 находится в сильном сцеплении полиморфизм rs1048661 (r²=0,99 и r²=0,98 соответственно), который детерминирует замену аминокислоты Arg141Leu в полипептиде LOXL1. По базам данных PolyPhen-2, аминокислотная замена (prediction of functional effects of human nsSNPs) имеет предикторный класс «POSSIBLY DAMAGING» (PolyPhen-2 score — 0,914, чувствительность — 0,81, специфичность — 0,94), а в соответствии с базой данных SIFT (Sorting Tolerant From Intolerant) предикторный потенциал этой несинонимической замены оценивается как «DELETERIOUS» (SIFT Score — 0,041, SIFT MEDIAN — 2,95).

Регуляторные эффекты (regSNP). Анализ эпигенетических эффектов трех полиморфных локусов гена LOXL1 показал, что наиболее выраженные регуляторные эффекты проявляют полиморфные локусы rs2165241 и rs893818 гена LOXL1 (см. табл. 2). Полиморфизм rs2165241 расположен в регионе гистонов, маркирующих промоторы в 8 тканях и энхансеры в 20 тканях, области гиперчувствительности к ДНКазе-1 в двух тканях и регионе трех регуляторных мотивов ДНК (Arid5a, Foxa, Foxj2). Полиморфный локус rs893818 локализуется в эволюционно консервативном регионе, в области гиперчувствительности к ДНКазе-1 в трех органах и регионе гистонов, маркирующих энхансеры в 24 тканях.

Согласно базе данных HaploReg (v4.1), аллель C rs2165241 снижает аффинность к факторам транскрипции Arid5a [различия между LOD scores аллелей C (alt) и T (ref) составляют –6,1], Foxa [различия между LOD scores аллелей C (alt) и T (ref) составляют –11,9] и Foxj2 [различия между LOD scores аллелей C (alt) и T (ref) составляют -2,0]. Наряду с этим аллель A rs4886776 повышает аффинность к транскрипционным факторам GR [различия между LOD scores аллелей A (alt) и G (ref) составляют 1,8] и Hand1 [различия между LOD scores аллелей A (alt) и G (ref) составляют 11,9].

Влияние на транскрипцию генов (eQTL данные). Данные проекта Genotype-Tissue Expression свидетельствуют о значимом влиянии (p<8·10^–5; p_FDR≤0,05) на уровень транскрипции трех генов (LOXL1, LOXL1-AS1, RP11-24D15.1) изученных полиморфизмов гена LOXL1. Установлено, что аллель C rs2165241 ассоциирован с повышенной экспрессией гена LOXL1-AS1 в культуре клеток фибробластов (β=0,21; p=2,30·10^–14; p_FDR≤0,05), периферической крови (β=0,18; p=6,50·10^–6; p_FDR≤0,05), надпочечниках (β=0,39; p=7,70·10^–7; p_FDR≤0,05), кровеносных сосудах (аорте; β=0,14; p=3,70·10^–5; p_FDR≤0,05), генов LOXL1 и LOXL1-AS1 в гипофизе (β=0,37; p=1,30·10^–10; p_FDR≤0,05 и β=0,43; p=2,50·10^–9; p_FDR≤0,05 соответственно). Аллель A rs4886776 также связан с повышенной экспрессией гена LOXL1-AS1 в периферической крови (β=0,21; p=7,40·10^–7; p_FDR≤0,05), щитовидной железе (β=0,17; p=3,50·10^–7; p_FDR≤0,05), жировой ткани (β=0,14; p=1,40·10^–4, p_FDR≤0,05), но при этом он ассоциирован с низкой транскрипцией гена LOXL1 в культуре клеток фибробластов (β= –0,22; p=4,10·10^–13; p_FDR≤0,05) и кровеносных сосудах (аорта, артерии; β= –0,13 — –0,15, p≤3,50·10^–8, p_FDR≤0,05; рис. 1). Аналогично аллель A rs893818 ассоциирован с повышенной экспрессией гена LOXL1-AS1 в периферической крови (β=0,21; p=5,60·10^–7; p_FDR≤0,05), щитовидной железе (β=0,17; p=2,70·10^–7; p_FDR≤0,05), жировой ткани (β=0,13; p=2,70·10^–4; p_FDR≤0,05) и низкой транскрипцией гена LOXL1 в культуре клеток фибробластов (β= –0,22; p=4,00·10^–13; p_FDR≤0,05) и кровеносных сосудах (аорта, артерии; β= –0,13 — –0,15; p≤3,20·10^–8; p_FDR≤0,05; см. рис. 1).

Рис. 1. Связь уровня транскрипции гена LOXL1 в культуре клеток фибробластов (а) и гена LOXL1-AS1 в периферической крови (б) с полиморфным локусом rs4886776 (https://www.gtexportal.org/)

Ассоциации с альтернативным сплайсингом транскриптов генов (sQTL данные). Установлена связь рассматриваемых нами полиморфных локусов гена LOXL1 с уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта трех генов (LOXL1, LOXL1-AS1, RP11-24D15.1) во многих культурах клеток, тканях и органах, в том числе вовлеченных в механизмы развития глаукомы (p<8·10^–5; p_FDR≤0,05). При этом аллель C rs2165241 ассоциирован с более высоким уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта гена LOXL1-AS1 в культуре клеток фибробластов (β=0,60; p=3,70·10^–19; p_FDR≤0,05, ID интрона — 73919383:73919838:clu_16638), гипофизе (β=0,49; p=4,90·10^–8; p_FDR≤0,05; ID интрона — 73919383:73919838:clu_19772), кровеносных сосудах (аорта и коронарные артерии; β=0,57; p=2,20·10^–16; p_FDR≤0,05, ID интрона — 73919383:73919838:clu_18550 и β=0,48; p=1,80·10^–6; p_FDR≤0,05, ID интрона — 73919383:73919838:clu_17318 соответственно), щитовидной железе (β=0,33; p=2,00·10^–8; p_FDR≤0,05, ID интрона — 73919383:73919838:clu_22134), гена LOXL1 в культуре клеток фибробластов (β=0,42; p=2,00·10^–21; p_FDR≤0,05; ID интрона — 73942962:73947067:clu_16641) и других органах и тканях (рис. 2).

Рис. 2. Связь полиморфного локуса rs2165241 с альтернативным сплайсингом генов LOXL1 (а) и LOXL1-AS1 (б) в культуре клеток фибробластов (https://www.gtexportal.org/).

Аллели A rs4886776 и rs893818 также связаны с повышенным уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта гена LOXL1-AS1 в культуре клеток фибробластов (β=0,40; p=3,30·10^–9; p_FDR≤0,05; ID интрона — 73919383:73919838:clu_16638 и β=0,45; p=1,20·10^–9; p_FDR≤0,05, ID интрона — 73919383:73919838:clu_16638 соответственно; рис. 3), кровеносных сосудах (аорта; β=0,43; p=2,10·10^–8; p_FDR≤0,05; ID интрона — 73919383:73919838:clu_18550 и β=0,42; p=2,80·10^–8; p_FDR≤0,05; ID интрона — 73919383:73919838:clu_18550 соответственно), гена LOXL1 в различных органах и тканях (см. рис. 3).

Рис. 3. Ассоциации полиморфных локусов rs4886776 (а) и rs893818 (б) с альтернативным сплайсингом гена LOXL1-AS1 в культуре клеток фибробластов (https://www.gtexportal.org/).

Итак, согласно нашим данным, полиморфные локусы rs2165241, rs4886776, rs893818 гена LOXL1 имеют значимый регуляторный потенциал, а также важное eQTL и sQTL-значение. Следует отметить, что три изученных нами полиморфизма гена LOXL1 (rs2165241, rs4886776, rs893818) находятся на расстоянии 6 kb друг от друга, сцеплены между собой (r²>0,40; D’=0,99), и вследствие этого их функциональные эффекты могут «перекрываться». Сильно сцепленный с ними полиморфизм rs1048661 обусловливает аминокислотную замену Arg141Leu в полипептиде LOXL1 с предикторным потенциалом «POSSIBLY DAMAGING» (по базе PolyPhen-2) и «DELETERIOUS» (по базе SIFT). Установлено, что исследуемые полиморфные локусы находятся в эволюционно консервативных регионах. Они локализованы в области гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры, в регионе гиперчувствительности к ДНКазе-1 более чем в 20 различных органах и тканях, области взаимодействия с разными регуляторными белками и регионах большого количества регуляторных мотивов ДНК, ассоциированы с экспрессией и альтернативным сплайсингом трех генов (LOXL1, LOXL1-AS1, RP11-24D15.1). Важно подчеркнуть, что свои функциональные эффекты (эпигенетические, eQTL, sQTL) эти локусы проявляют в патогенетически значимых для формирования глаукомы культурах клеток, органах и тканях, таких как эндокринные железы (щитовидная железа, надпочечники) и жировая ткань, кровеносные сосуды, периферическая кровь, фибробласты и др.

Следует отметить, что, согласно результатам настоящего исследования, аллель C rs2165241 гена LOXL1 (данные литературы указывают на протективное значение этого аллеля для развития глаукомы, ПЭГ и ПЭС без глаукомы в европейских популяциях [14, 19]) снижает аффинность к трем факторам транскрипции (Arid5a, Foxa, Foxj2), связан с более высоким уровнем экспрессии и альтернативного сплайсинга транскрипта генов LOXL1 и LOXL1-AS1 в культуре клеток фибробластов и в большинстве других ПОУГ-значимых органов и тканей (периферическая кровь, кровеносные сосуды, гипофиз и др.). Результаты нашего исследования in silico свидетельствуют, что аллель A rs4886776 гена LOXL1 (по данным ранее проведенных полногеномных работ, являющийся фактором риска развития ПЭС в японской популяции и протективным фактором развития ПЭС у неяпонского населения [18]), повышает аффинность к двум транскрипционным факторам (GR и Hand1), детерминирует высокий уровень альтернативного сплайсинга транскрипта генов LOXL1 и LOXL1-AS1 и оказывает разнонаправленное влияние на уровень экспрессии генов LOXL1-AS1 (повышает) и LOXL1 (снижает). Аналогично в соответствии с полученными нами результатами аллель A rs893818 (данные литературы свидетельствуют о протективной роли этого аллеля при развитии ПЭГ в японской популяции [15]) связан с повышенным уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта генов LOXL1 и LOXL1-AS1 и оказывает разнонаправленное влияние на уровень транскрипции генов LOXL1-AS1 (повышает) и LOXL1 (снижает). Следует отметить, что установленные нами in silico значительные эпигенетические, eQTL и sQTL-эффекты полиморфных локусов rs2165241, rs4886776, rs893818 гена LOXL1 могут являться медико-биологической основой их ассоциаций с глаукомой.

Мы обнаружили связь рассматриваемых полиморфизмов гена LOXL1 с экспрессией гена LOXL1-AS1 в органах и тканях, характеризующихся выраженными гормон-продуцирующими функциями (щитовидная железа, надпочечники, жировая ткань). Полученные нами in silico результаты, указывающие на вовлеченность в патофизиологию глаукомы биологических механизмов, опосредованных органами и тканями эндокринной системы, согласуются с имеющимися данными литературы: ассоциация одного из полиморфизмов гена LOXL1 (rs1048661) с транскрипционной активностью этого гена в жировой ткани была продемонстрирована G. Thorleifsson и соавт. [14] в ранее проведенном полногеномном исследовании глаукомы среди населения Исландии и Швеции. Общеизвестна значимая роль органов эндокринной системы в регуляции всех процессов жизнедеятельности организма, в том числе метаболических процессов (обмен углеводов, липидов и др.), играющих ключевую роль в патофизиологии глаукомы [2]. Наличие выраженных метаболических расстройств (например, таких как сахарный диабет, атеросклеротическое поражение сосудов и др.) является значимым фактором риска развития глаукомы [1, 2]. В полногеномном исследовании Y. Shiga и соавт. [33] в результате анализа GWAS данных из японского биобанка и расчета на их основе генетических корреляций установлены значимые генетические связи между сахарным диабетом 2-го типа и ПОУГ (r²=0,27±0,07; p_FDR=0,001). При использовании метода менделевской рандомизации, позволяющего устанавливать причинно-следственные связи, в работе L. Shen и соавт. [34] при анализе генетических данных (учитывалось распределение 39 различных полиморфизмов, характеризующих генетические факторы сахарного диабета 2-го типа и связанных с ним фенотипов — ожирения, функции β-клеток, регуляции инсулина и других метаболических процессов) многочисленной когорты взрослых индивидуумов (выборка для исследования включала 69 685 человек, среди которых с ПОУГ было 3554) показано, что не только клинически выраженный сахарный диабет 2-го типа, но даже наличие дисрегуляции функции β-клеток (без манифестации сахарного диабета) существенно увеличивают риск развития ПОУГ (OR=2,53 и OR=5,26 соответственно). Основываясь на полученных результатах, авторы полагают, что метаболическая дисрегуляция (до постановки клинического диагноза эндокринного заболевания) может увеличивать риск развития ПОУГ.

Следует отметить, что одним из ключевых звеньев патофизиологии метаболических расстройств в организме является формирование окислительного стресса, развитие которого в различных структурах глаза (эндоплазматический ретикулум разных типов клеток и др.), согласно современным представлениям, играет важную роль в патогенезе глаукомы [35]. Считается, что воздействие свободных радикалов и других «компонентов» окислительного стресса может обусловливать развитие глаукомной оптиконейропатии [2]. В экспериментальной работе M.A. Hauser и соавт. [36] показано, что экспрессия гена LOXL1-AS1 значительно изменяется в ответ на окислительный стресс в эпителиальных клетках хрусталика человека и в ответ на циклический механический стресс в эндотелиальных клетках шлеммова канала у человека. Полученные в этом исследовании данные свидетельствуют о важной функциональной роли lncRNA LOXL1-AS1 в клеточном стрессовом ответе, и авторы работы предполагают, что дисрегуляция ее экспрессии, которая может зависеть от полиморфных генетических вариантов, являющихся eQTL-значимыми для этого гена, играет ключевую роль в патогенезе ПЭС.

Согласно полученным нами in silico данным GWAS, значимые для глаукомы полиморфизмы гена LOXL1 связаны с уровнем экспрессии и альтернативного сплайсинга генов LOXL1, LOXL1-AS1 в кровеносных сосудах (аорта, артерии). Эти результаты согласуются с данными литературы по патофизиологии глаукомы [1, 2]. Сосудистая концепция развития заболевания занимает одно из центральных мест среди теорий возникновения ПОУГ [2]. Считается, что изменения сосудистого тонуса и дисфункция эндотелия сосудов могут приводить к нарушению гемодинамики глаза и вследствие этого предрасполагать к возникновению деструктивных изменений в структурах глаза, включая в первую очередь гибель аксонов ганглиозных клеток сетчатки [2]. Заболевания сердечно-сосудистой системы (артериальная гипертензия и др.) являются известным фактором риска развития глаукомы [1]. Следует отметить имеющиеся в литературе данные о положительной генетической корреляции между ПОУГ и такими осложнениями сердечно-сосудистых заболеваний, как инфаркт миокарда (r²=0,20; p=0,02) и ишемический инсульт (r²=0,27; p=0,04) [33].

В нашей работе с использованием in silico инструментария показана ассоциация рассматриваемых полиморфных вариантов гена LOXL1 с транскрипцией и альтернативным сплайсингом генов LOXL1, LOXL1-AS1 в фибробластах. Фибробласты — это основной компонент соединительной ткани организма, обеспечивающий синтез коллагеновых и эластиновых волокон, протеогликанов и других элементов экстрацеллюлярного матрикса соединительной ткани, роль которых в патофизиологии глаукомы в настоящее время не вызывает сомнений [37]. Содержание коллагена, архитектоника его волокон, плотность их упаковки непосредственно определяют морфофункциональные (биомеханические) характеристики склеры и ее производного — решетчатой пластинки, играющей важную роль в развитии глаукомного процесса [2, 37]. В процессе формирования глаукомы снижается эластичность и возрастает жесткость решетчатой пластинки склеры, возникает ее деформация, приводящая к повреждению аксонов ганглиозных клеток сетчатки [2]. Вместе с тем вследствие нарушения структуры эластических волокон и появления микрофибриллярных отложений ухудшаются фильтрация и отток водянистой влаги через трабекулярную диафрагму, что также способствует развитию глаукомного процесса [2].

Одним из биологических механизмов, лежащих в основе ассоциаций GWAS-значимых полиморфных локусов rs2165241, rs4886776, rs893818 гена LOXL1 с глаукомой, могут являться фенотипические эффекты сильно сцепленного с ними несинонимичного полиморфизма rs1048661, который приводит к замене аминокислоты Arg141Leu в полипептиде LOXL1. В работе U. Schlötzer-Schrehardt и соавт. [38] изучен материал различных тканей глаза — радужной оболочки, хрусталика, цилиарного тела — от 25 пациентов с ПЭС/ПЭГ и 25 индивидуумов из группы контроля, установлено уменьшение уровня экспрессии гена LOXL1 в тканях глаза на 20% на каждый рисковый аллель полиморфизма rs1048661. Исследования в разных популяциях показали значимые ассоциации rs1048661 гена LOXL1 с развитием ПЭС/ПЭГ [21, 39, 40] и ПОУГ [41]. Однако обращает на себя внимание тот факт, что в этнически разных популяциях рисковое значение для ПЭС/ПЭГ имеют различные генетические варианты rs1048661 LOXL1: 141Arg — в европейских и южноафриканских популяциях, 141Leu — в восточноазиатских. В соответствии с этим, как отмечается в работе J.L. Wiggs и соавт. [42], полиморфизм rs1048661 гена LOXL1 и детерминируемая им аминокислотная замена Arg141Leu в полипептиде LOXL1 не являются причиной развития заболевания, а лишь, по-видимому, маркируют вовлеченность других, сильно сцепленных с ними полиморфных локусов, имеющих существенное влияние на экспрессию различных генов (например, LOXL1-AS1) и активность белков, значимых для развития глаукомы.

В работе F. Pasutto и соавт. [22] установлены «рисковые» и «нерисковые» для развития ПЭС 14-локусные гаплотипы гена LOXL1 (в их состав входили и изучаемые нами rs2165241 и rs4886776) в итальянской и немецкой популяциях, показаны существенно более высокая частота «рискового» гаплотипа (64,7%) и значительно низкая встречаемость «нерискового» гаплотипа (5,8%) в тканях глаза у больных с ПЭС в сравнении с контрольной группой (21,2 и 27,6% соответственно). Также в этой работе установлено, что уровень экспрессии LOXL1 во всех изученных тканях глаза (радужная оболочка, цилиарное тело, решетчатая пластинка) у индивидуумов с «рисковым» гаплотипом значительно (на 40—50%) снижен в сравнении с индивидуумами с «нерисковым» генотипом. Следует отметить, что в данной работе не выявлено ассоциаций между гаплотипами и уровнем тканевой экспрессии LOXL1-AS1 [22].

Согласно материалам базы данных GeneCards: The Human Gene Database (https://www.genecards.org/), ген LOXL1 (лизолоксидаза пободная 1) кодирует белковый продукт, который необходим для образования и метаболизма эластических волокон и основных компонентов фибриллярных агрегатов. Он является ключевым в метаболизме внеклеточного матрикса и имеет важное значение на начальных стадиях аномального фиброгенеза в тканях. Повышение экспрессии гена LOXL1 и соответственно увеличение продукции компонентов эластических волокон способствуют образованию аномально сшитых агрегатов в путях оттока внутриглазной жидкости, что приводит к нарушению ее оттока из глаза и повышению уровня внутриглазного давления [43]. Нарушение экспрессии гена LOXL1 в различных тканях глаза (радужная оболочка, хрусталик, цилиарное тело) у пациентов с ПЭС/ПЭГ по сравнению с контрольной группой (повышение на ранних стадиях развития заболевания и снижение на ее поздних стадиях) установлено в работе U. Schlötzer-Schrehardt и соавт. [38].

Ген LOXL1-AS1 определяет образование длинной некодирующей РНК (lncRNA), информация о которой записана на противоположной цепи, кодирующей ген LOXL1 [36]. Данные литературы, посвященной lncRNA, свидетельствуют о том, что эти длинные некодирующие РНК имеют множественные биологические эффекты, играющие ключевую роль на различных этапах организации и реализации потока наследственной информации в организме. Они влияют на процессы метилирования ДНК и ремоделирования хроматина. Различные модификации гистонов опосредуют взаимодействие факторов транскрипции с регионами энхансеров, которые вовлечены в посттранскрипционную регуляцию [44, 45].

Заключение

В работе установлено важное функциональное значение GWAS-значимых для глаукомы полиморфных локусов rs2165241, rs4886776 и rs893818 гена LOXL1. Они демонстрируют существенные эпигенетические эффекты (влияют на аффинность к пяти факторам транскрипции, расположены в регионе промоторов и энхансеров, в области гиперчувствительности к ДНКазе-1), ассоциированы с экспрессией и альтернативным сплайсингом трех генов (LOXL1, LOXL1-AS1, RP11-24D15.1) в патогенетически значимых для формирования глаукомы культурах клеток, органах и тканях, сильно сцеплены с полиморфизмом rs1048661, который обусловливает замену аминокислоты Arg141Leu в полипептиде LOXL1. Эти медико-биологические эффекты данных полиморфных локусов могут лежать в основе их ассоциации с глаукомой. Полученные в работе результаты расширяют имеющиеся к настоящему времени представления о патогенетических механизмах формирования глаукомы.

Участие авторов:

Концепция и дизайн: Н.Е., М.Ч., И.П.

Сбор и обработка материала: Н.Е., М.Ч., И.П.

Написание текста: Н.Е., М.Ч.

Редактирование: М.Ч., Н.Е.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.