Высокая распространенность неврологических заболеваний (прежде всего ишемического инсульта и деменций) обусловливает необходимость рационального выбора наиболее эффективных препаратов. Если ранее считалось, что вазоактивные препараты имеют наибольшее значение для восстановления функций головного мозга, то в настоящее время происходит смещение акцента в сторону нейропротективных и нейротрофических препаратов.

Одним из таких препаратов является церебролизин (EVER Neuro Pharma, Австрия) - результат экстрагирования пептидной фракции головного мозга молодых свиней. Данный препарат отвечает требованиям международных стандартов нейропротекции в терапевтической и педиатрической практике [1]. Церебролизин производится и клинически тестируется в соответствии с существующими стандартами [2]. Многочисленные исследования указывают на несомненный положительный эффект применения препарата при инсульте, черепно-мозговой травме (ЧМТ), деменциях и перинатальной энцефалопатии. Хотя высокая терапевтическая эффективность и мультимодальное действие церебролизина давно доказаны, данные о точных молекулярно-фармакологических механизмах его действия изучены мало. Между тем, информация о механизмах действия препарата важна для рациональной терапии, планирования исследований по доказательной медицине препарата, для обучения неврологов фундаментальным основам нейротрофической терапии.

В течение ряда лет нами исследовался состав церебролизина, включая олигопептидную и мембранную фракции [3, 10], витаминную активность [4], аминокислотный [5] и микроэлементный состав [6, 7], его воздействие на гомеостаз микроэлементов мозга [8, 9].

Исследование проводилось с использованием универсального метода для решения задач молекулярной фармакологии пептидных препаратов, состоящего из 5 основных стадий. Результаты исследования пептидного состава препарата представлены в таблице.

Фактор роста нервов необходим для развития и восстановления сетей нейронов. Связывается специ­фическими рецепторами TrkA (тирозинкиназа А) и LNGFR (от англ. «low affinity nerve growth factor receptor», т.е. «низкоафинный рецептор NGF»), которые и стимулируют процессы деления и дифференциации. В составе церебролизина были найдены два пептида, образовавшихся при протеолизе секретируемой молекулы ФРН: GEFSV, соответствующий остаткам 119-123 полипептида и NSYCTTT, соответствующий остаткам 186-192. Эти пептиды образуются при неспецифическом протеолизе в процессе производства препарата. Анализ взаимодействия ФРН с рецептором позволяет предположить, что пептид GEFSV (119-123) непосредственно может контактировать с молекулой рецептора, тем самым проявляя нейротрофическую активность [13]. Известны модельные пептиды, включающие GEFSV, обладающие ФРН-подобной активностью [14, 15]. Обнаружение пептидов ФРН практически во всех фракциях исследованных образцов имеет значение для понимания нейротрофической активности церебролизина.

Энкефалины. В составе исследованных фракций церебролизина были обнаружены несколько эндорфин/энкефалинподобных пептидов: tyr-gly-gly-phe-leu (YGGFL), gly-gly-phe-leu-arg (GGFLR) и tyr-gly-gly-phe-met (YGGFM). Leu-энкефалины и динорфины синтезируются в организме в результате протеолиза полипептида, кодируемого геном PDYN (динорфин). Энкефалины - эндогенные опиоидные пептидные нейротрансмиттеры, которые поддерживают множество физиологических и психологических функций, включая реакцию на стресс, восприятие боли, эмоции, контроль приема пищи и др.

Нейропептид VF. В составе исследованных фракций церебролизина был найден пептид PQRF, соответствующий фрагменту нейропептида VF. К настоящему времени имеется мало данных о его роли, хотя и известно, что нейропептид VF может активировать мю-опиоидные и каппа-опиоидные рецепторы и регулировать работу гипоталамуса [16].

Орексин. Пептид cys-cys-arg-gln-lys (CCRQK), найденный в образцах церебролизина, идентифицируется как фрагмент полипептида орексина (ген ORX). Пептид CCRQK локализуется в районе 39-43 полипептида орексина и, по данным интегрального биоинформационного анализа, может иметь важное значение для взаимодействия орексина-А с рецепторами. Орексины (гипокретины) играют роль в регуляции приема пищи, цикла сон-бодрствование [17] и воздействуют на разнообразные аспекты физиологии человека, включая энергетический метаболизм, баланс гормонов, регуляцию уровня жидкости в организме. Орексин-А увеличивает экспрессию нейротрофина-3 [18], который в свою очередь поддерживает выживание и дифференциацию нейронов, стимулируя нейроно- и синаптогенез.

Галанин. В составе церебролизина имеется галанинподобный пептид WWLNSAGY (в галанинах соответствующий пептид имеет последовательность WTLNSAGY). Анализ интегрированной функциональной карты галанина указывает на фрагмент 33-42, имеющий важное значение для взаимодействия галанина с рецепторами. Галанин (ген GALN) участвует в таких разнообразных процессах как регуляция приема пищи, энергетический метаболизм, регулирование секреции других нейротрансмиттеров, модуляция ноцицепции, перистальтика, восстановление нервной системы после повреждений. Галанин выступает как нейропептид, модулирующий секрецию нейротрансмиттеров ацетилхолина, серотонина и норадреналина [19, 20]. Активация рецепторов галанина оказывает антиконвульсантное, антидепрессантное действие [21]. Галанин необходим для развития нейронов [22], стимулируя спраутинг аксонов [23].

Идентифицированные пептиды функционально значимы и могут проявлять специфическую биологическую активность, взаимодействуя с соответствующими рецепторами [10].

В работе проведено сопоставление результатов молекулярно-биологического исследования состава церебролизина и результатов его клинических и экспериментальных исследований.

В многочисленных исследованиях была продемонстрирована эффективность церебролизина в терапии ишемических повреждений мозга в составе комплексной терапии. Применение церебролизина при инсульте и ЧМТ достоверно снижает неврологический дефицит [24], улучшает когнитивные способности [25, 26], восстанавливает биоэлектрическую активность мозга [27], снижает объем зоны инфаркта [28]. Экспериментальные исследования подтвердили результаты клинических наблюдений и позволили уточнить физиологические механизмы действия препарата. Церебролизин оказывает нейрорегенеративное воздействие [29], ослабляя нарушения структуры нейронов [30, 31], улучшает когнитивные функции на моделях диабета, снижает уровни провоспалительного фактора ФНО-альфа, повышает уровни инсулиноподобного гормона роста IGF-1, серотонина и оказывает антиоксидантное действие [32].

Экспериментальные исследования показали, что нейропротекторные свойства церебролизина связаны с активацией сигнального каскада Shh, сигнального пути PI3K/Akt, стимулирования ангиогенеза и модуляции синтеза и секреции оксида азота.

Улучшение неврологических функций после инсульта при лечении церебролизином связывают с активацией сигнального каскада Shh. Терапия церебролизином значительно увеличивала деление клеток-предшественников нейронов и их дифференциацию в нейроны и в миелинизирующие олигодендроциты. Эти изменения сопровождались параллельным увеличением активности каскада Shh [33]. Shh осуществляет масштабную координацию клеточного роста и не обладает нейротрофическим эффектом как таковым. Активность каскада Shh имеет огромное значение для процессов развития эмбриона, осуществляя формирование общей структуры конечностей, структур головного мозга [34], спинного мозга [35], таламуса [36]. Одной из наиболее изученных ролей каскада Shh является формирование нервной трубки плода из базальной пластины и формирование вентральных типов клеток в нервной трубке [37]. Исследования ФРН указали на существование взаимодействий между сигнальным каскадом Shh, ростом нейритов и активностью ретиноидных рецепторов. Рецептор ретиноидов RARβ2 экспрессируется в нейронах с маркерами NF200, CGRP и IB4. Нейроны этого типа стимулируют рост нейритов в ответ на воздействие ретиноидов. Сигналы от их рецепторов регулируют рост аксонов и ФРН-зависимый рост аксонов тормозится при делеции генов рецепторов ретиноидов. Каскад Shh является всего лишь одной из мишеней воздействия сигнального пути рецепторов ретиноидов и при делеции гена рецептора RARβ2 не активируется. Shh не может вызвать сам по себе рост аксонов, но может усиливать сигнал от ретиноидных рецепторов [38], повышая выживание клеток [39]. Дотации витамина А индуцируют синтез ФРН и нейротрофического фактора мозга [40].

Учитывая данные о функционировании ФРН и наличие активных пептидных фрагментов ФРН в составе церебролизина, причина повышения активности каскада Shh под воздействием препарата становится очевидной [33]. ФРН инициирует рост нейритов и потенциирует активность рецепторов ретиноидов (RARβ2 и др.). Активированный ретиноидами рецептор RARβ2 дополнительно стимулирует рост нейритов и активирует каскад Shh. Активация каскада Shh способствует росту нейритов посредством усиления сигнала от ретиноидных рецепторов, что и является нейротрофическим эффектом.

Церебролизин (2,5 мл/кг) стимулирует рост клеток-предшественников нейронов за счет активации сигнального пути PI3K/Akt и повышает результат оценки неврологического тестирования [41]. Сигнальный путь PI3K/Akt активируется ФРН и орексином, которые были найдены в составе церебролизина. ФРН стимулирует цикл клеточного деления с участием циклинов и циклинзависимых киназ [42], а орексин стимулирует поглощение нервной тканью глюкозы за счет транслокации транспортера глюкозы GLUT4 из цитоплазмы нейронов на внешнюю поверхность мембраны [43].

ФРН и орексин стимулируют синтез/секрецию нейротрофического фактора мозга (BDNF), который также активирует сигнальный путь PI3K/Akt [44] под действием церебролизина. ФРН активирует циклинзависимую киназу 5 (cdk5) с участием цАМФ, что активирует процессы клеточного роста [45], нейропротекцию [46] и регулирует экспрессию BDNF [47] через сигнальный каскад внеклеточной регулируемой киназы 1/2 (ERK1/2) [48]. Орексин подавляет толерантность к глюкозе и предупреждает повреждение нейронов посредством повышения активности BDNF [49, 50].

Церебролизин улучшает восстановление когнитивных способностей после ЧМТ, в частности за счет стимулирования ангиогенеза [25]. Улучшение неврологических показателей связано с повышением уровня фактора роста эндотелия (VEGF), стимулирующего восстановление сосудистого русла и повышающего кровоток в зоне ишемии [51]. Данный эффект также объясняется наличием в церебролизине ФРН. Известно, что ФРН стимулирует повышение экспрессии VEGF и ангиогенез при репаративной регенерации нейрональной ткани [52].

Церебролизин также модулирует активность синтеза/секреции оксида азота. В эксперименте хроническая алкогольная интоксикация в течение 30 дней приводила к увеличению уровня оксида азота с одновременным снижением уровней L-арги­нина, каталазы и супероксиддисмутазы. Применение церебролизина в течение последующих 14 дней привело к нормализации функции системы оксида азота [53]. Данный эффект основан на том, что в состав церебролизина входят энкефалины и ФРН, которые оказывают влияние на метаболизм оксида азота. Цитопротекция энкефалином опосредована активацией синтазы окиси азота (СОА) и функции аденозинтрифосфат-регулируемых калиевых каналов [54]. В частности, мет-энкефалин модулирует синтез/секрецию оксида азота [55]. ФРН стимулирует экспрессию индуцируемой формы СОА и вещества Р [56]. Сигнальный путь Akt - оксид азота - цГМФ способствует воздействию ФРН на рост нейритов в модели деменции [57].

Успешное применение церебролизина для поддержания состояния пациентов при нейродегенеративных заболеваниях было многократно продемонстрировано. Метаанализ 6 рандомизированных исследований по применению церебролизина для терапии сосудистой деменции (597 участников) подтвердил наличие его положительного эффект в отношении когнитивных функций пациентов по шкалам MMSE (на 1,10 балла в среднем, 95% ДИ 0,37-1,82) и ADAS-cog+ (в среднем на 4,01 балла, 95% ДИ 2,66-5,36) и по шкале CGI (ОШ 2,71; 95% ДИ 1,83-4,00) [58, 59]. Лечение церебролизином снижает уровень атрофии таламуса у молодых пациентов (20±0,5 года) с активным рассеянным склерозом [60] и способствует профилактике атрофии зрительного нерва у детей [61].

Вызываемое церебролизином уменьшение дефицита памяти и других проявлений нейродегенеративного процесса сохраняется по крайней мере в течение 3 мес после окончания лечения. Посредством иммуногистохимического анализа было показано, что снижение амилоидных бляшек в новой коре и гиппокампе также сохраняется в течение 3 мес [62]. Эффект церебролизина при деменции связывают с преодолением холинергического дефицита, воздействием на отложение амилоидного тау-белка, модуляцией активности киназы 3 гликогенсинтазы (GSK3), ингибированием каскада калпаина.

Показано, что церебролизин увеличивает число холинергических нейронов [63] и общую длину дендритных пирамидальных нейронов [64]. Известно, что ФРН-рецептор TrkA повышает экспрессию генов, вовлеченных в холинергическую передачу сигнала [65]. Входящий в состав церебролизина активный фрагмент ФРН активирует TrkA, восполняя дефицит ацетилхолина. На амилоидной модели деменции церебролизин уменьшал уровни бета-амилоида и фосфорилирование ассоциированного с микротрубочками тау-белка путем регулирования киназы 3 гликогенсинтазы и циклинзависимой киназы 5, увеличивая плотность синапсов и восстанавливая цитоархитектонику нейрональной ткани [66, 67]. Этот эффект может быть связан с воздействием активного фрагмента пептидов галанина и ФРН. Показано, что галанин тормозит ухудшение пространственной памяти и уменьшает уровень бета-амилоида в модели болезни Альцгеймера [68], способствует дифференцировке нейронов в культуре клеток субвентрикулярной зоны [69].

Антиамилоидное действие церебролизина может быть связано с наличием в его составе активных пептидов ФРН. Интраназальное введение ФРН снижает отложения амилоида [70] и его токсическое воздействие на нейроны [71]. ФРН воздействует на активность киназы 3 гликогенсинтазы (GSK3) посредством активации сигнального пути Akt [72], что приводит к подавлению ее активности [73]. ФРН активирует циклинзависимую киназу 5 (cdk5) с участием сигнальной молекулы цАМФ, что активирует процессы клеточного роста и дифференциации [45], причем взаимодействие между cdk5 и GSK3 опосредовано белком нейрегулином [46].

Церебролизин стабилизирует целостность нейронов и уменьшает число апоптотических клеток после ишемического поражения путем ингибирования каскада калпаина за счет активности ФРН и галанина. Активация рецептора ФРН тормозит активность бета- и гамма-секретаз, что предотвращает стимулируемое GSK3 фосфорилирование тау-белка и активацию каспаз и калпаина, которые приводят к распаду цитоскелета и ухудшению аксонального транспорта [74]. Делеция гена галанина приводит к увеличению экспрессии калпаина, увеличивая гибель нейронов, в том числе холинергических [75].

Терапевтический эффект церебролизина при атрофии зрительного нерва у 646 детей отмечался при внутримышечном (0,1 мл/кг массы тела) и ретробульбарном (0,3-0,5 мл) введении [61]. Этот эффект связан с наличием ФРН в составе препарата. Этим наблюдениям соответствуют экспериментальные данные о снижении экспрессии генов ФРН и рецептора TrkA в зрительном нерве крыс с глаукомой [76]. При дегенерации ганглиозных клеток сетчатки установлено влияние ФРН на регенерацию сетчатки [77]. ФРН и его рецепторы TrkA и p75 экспрессируются в переднем и заднем сегментах глаза человека; при нанесении на склеру ФРН достигает сетчатки и зрительного нерва [78].

Церебролизин улучшает состояние нейронных структур на моделях синдрома Ретта - врожденной прогрессирующей аномалией развития ЦНС, которая характеризуется умственной отсталостью, стереотипиями и апраксией. Исследования пациентов с синдромом Ретта показали снижение ветвления дендритов нейронов и аномальное формирование нейронных структур. Делеция гена метил-CpG-связывающего белка (MECP2) приводит к экспериментальной модели синдрома Ретта. Применение церебролизина на моделях синдрома Ретта улучшало рост нейронов и структурирование нервной ткани [79]. Положительное воздействие церебролизина на структуру нервной ткани при синдроме Ретта объясняется входящим в состав препарата активных пептидов ФРН. При синдроме Ретта отмечаются снижение уровня ФРН, продолжающееся с возрастом, в то время как в контрольной группе здоровых лиц уровень ФРН возрастает [80].

Церебролизин уменьшает апоптоз лимфоцитов человека [81, 82]. Этот эффект может осуществляться за счет ФРН и энкефалиновых пептидов в его составе. ФРН имеет выраженный антиапоптотический эффект на лимфоциты, защищая их от апоптоза путем активации белка PKCzeta [83]. В В-лимфо­цитах памяти ФРН ингибирует апоптоз с помощью инактивации белка р38МАРК и предотвращения фосфорилирования регулирующего апоптоз белка Bcl-2 [84]. Энкефалины также защищают лимфоциты от апоптоза [85]. Антиапоптотическое действие метионинэнкефалина связано с эффектами каспазы-3 [86].

Церебролизин снижает уровень перинатальных расстройств ЦНС посредством иммуномодуляции, антиоксидантной защиты и нейротрофического эффекта. Изучалось влияние церебролизина на аутоиммунные параметры (FasL, Fas и металлотионеин-1) у новорожденных с перинатальными ишемическими повреждениями ЦНС и в группе 20 здоровых новорожденных. Лечение церебролизином (0,1 мл/кг, 10 инъекций через день) привело к нормализации апоптоза Т-лимфоцитов (увеличение Fas и снижение FasL) и активация антиоксидантной защиты путем увеличения экспрессии белка-антиоксиданта металлотионеина-1. Нормализация аутоиммунных реакций приводила к уменьшению отека мозга и улучшению кровотока в участках мозга пострадавших от ишемии [87].

Структура рецептора ФРН р75 сходна со структурой Fas-рецептора, связывающего лиганд FasL, который играет важную роль в регуляции клеточного апоптоза [83]. Нельзя исключить, что ФРН может непосредственно взаимодействовать с Fas-рецеп­то­ром, проявляя иммуномодуляторные эффекты. Модуляции системы Fas-рецептор/FasL могут осуществляться метионинэнкефалином [88].

Церебролизин стимулирует секрецию гамма-интерферона лимфоцитами [89]. Показано, что метионинэнкефалин стимулирует субпопуляции лимфоцитов в периферической крови [90], а энкефалин-подобные агонисты дельта-опиоидных рецепторов существенно улучшают выживаемость в моделях сепсиса [91]. Мет-энкефалин и его пептидный фрагмент YGG оказывают непосредственное влияние на синтез гамма-интерферона: стимулируя синтез при низких дозах и тормозя синтез при высоких. Пептидный фрагмент YG является минимальным молекулярным фрагментом энкефалина, оказывающим иммуномодулирующее воздействие [92]. Известно, что процессы дифференцировки нейронов сопровождаются вызываемым рецептором ФРН повышением уровня гамма-интерферона [93].

Основополагающая роль энкефалинов и ФРН в осуществляемой церебролизином иммуномодуляции подтверждается профилем иммунологических изменений при внутримышечном применении препарата у детей с синдромом дефицита внимания и гиперактивностью. В этих случаях была отмечена нормализация как неврологических, так и иммунных показателей. Церебролизин повышал экспрессию маркеров активации (HLA-DR, CD25) и нормализацию количества клеток лимфоцитов типа CD45+, CD14-, CD4+, CD19+, CD16+, CD11b+ и CD56+, а также уровней IgG и IgA в сыворотке, активность NK-клеток и активацию Т-хелперов [94, 95]. Данный эффект также реализуется через действие энкефалинов и ФРН. Метионинэнкефалин воздействует на лимфоциты человека, нормализуя количество и активность Т-клеток CD4+, CD8+, регуляторных Т-клеток, дендритных клеток, NK-клеток и маркер активации CD25 [90]. Бета-эндорфин и мет-энкефалин оказывают иммуномодулирующее действие, влияя на экспрессию маркеров CD11b+, CD18+ и CD16+ [96]. ФРН влияет на экспрессию маркера активации Т-клеток HLA-DR [97], а рецептор ФРН (NGFR) присутствует на поверхности лимфоцитов человека и модулирует деление В-клеток и секрецию иммуноглобулинов [98].

Несмотря на существование доказательной базы по использованию церебролизина в клинической медицине, точные механизмы фармакологического действия препарата изучены недостаточно. В настоящей работе представлен анализ связи состава церебролизина и результатов исследований препарата in vitro, in vivo. Показано что установленные ранее специфические особенности воздействия церебролизина в рамках нейротрофического, нейропротективного, иммуномодулирующего эффектов, могут быть объяснены через специфическую активность пептидных компонентов препарата (активные фрагменты ФРН, энкефалинов, орексина, галанина).

Проведенный анализ позволил сделать ряд выводов, важных для повышения эффективности использования церебролизина в клинической практике. Наиболее интересным, на наш взгляд, является возможный синергизм церебролизина с витамином А (ретиноидами). Результаты фундаментальных исследований показали, что установленное в эксперименте повышение активности сигнального каскада Shh под воздействием церебролизина связано скорее всего с наличие активных пептидных фрагментов ФРН в составе препарата. ФРН потенцирует активность рецепторов ретиноидов, которые стимулируют долговременный рост нейритов и параллельно активируют каскад Shh. Активация каскада Shh дополнительно способствует росту нейритов посредством усиления сигнала от ретиноидных рецепторов. Результаты позволяют сделать вывод о том, что долговременное воздействие церебролизина может существенно зависеть от обеспеченности организма витамином А. Поэтому у пациентов с дефицитом витамина А (и/или с неблагоприятными вариантами полиморфизмов генов метаболизма витамина А) можно ожидать более низкую нейротрофическую активность церебролизина. И наоборот, у пациентов, обеспеченных витамином А, церебролизин будет проявлять большую нейтротрофическую активность.

Представляется весьма перспективным исследование возможного синергичного эффекта церебролизина и ряда других микронутриентов. Первым этапом такого исследования является системно-биологический и биоинформационный анализ возможных молекулярно-фармакологических механизмов такого рода синергизма. Данный анализ позволит отобрать микронутриенты, восполнение дефицита который максимизирует эффективность церебролизина в экспериментальных и клинических исследованиях.