В последние десятилетия острая фокальная ишемия головного мозга, в частности ишемический инсульт (ИИ), является серьезной и актуальной проблемой, что связано с высокими показателями заболеваемости, смертности и инвалидизации. Результаты активного изучения биохимических и морфологический изменений ишемического повреждения головного мозга предоставляют возможности для более широкого понимания патогенеза острой фокальной ишемии головного мозга и создания новых эффективных подходов к еe лечению.
Каскад ишемических реакций — сложный комплекс процессов, который включает в себя: клеточную биоэнергетическую недостаточность, глутаматную эксайтотоксичность, окислительный стресс, дисфункцию гематоэнцефалического барьера, микрососудистые повреждения, гемостатическую активацию, постишемическую аутоиммунную реакцию, патологический апоптоз, гибель нейронов, глиальных и эндотелиальных клеток [1]. В процессе биохимических реакций одно событие тесно связано с другими компонентами ишемического каскада. Часть из них развивается в течение нескольких часов, другие активируются через несколько суток после развития ишемии и длятся в течение всей последующей жизни, несмотря на восстановление циркуляции крови [2]. При этом они индуцируют и поддерживают другие отдаленные последствия ишемии: реакцию генома с включением молекулярных программ, изменения астро- и микроглиального клеточного пула и связанные с ним иммунные сдвиги, локальное воспаление в очаге ишемии, нарушение целостности гематоэнцефалического барьера [3]. Одну из ключевых ролей в процессе развития оксидантного стресса играет дисфункция митохондрий, которая заключается в том, что митохондриальная ДНК подвергается повреждению, опосредованному активными формами кислорода (АФК), что в итоге приводит к митохондриальной геномной нестабильности и нарушению функции внешнего дыхания [4—6]. Все вышеописанные процессы тем или иным образом приводят к гибели клеток путем некроза, ярко представленного в зоне ишемического ядра.
В зоне пенумбры преобладает апоптотический механизм гибели клеток. Именно в этой зоне ишемическое повреждение недостаточно тяжелое для развития некроза клеток [7, 8], но достаточное для запуска их преждевременной запрограммированной смерти [3, 4]. Выделяют несколько факторов, определяющих, какой из механизмов гибели (некроз или апоптоз) будет преобладать: степень и длительность локальной ишемии, степень зрелости клеток, концентрация внутриклеточного свободного Са2+ и клеточное микроокружение [9—10].
Раннее проведение терапевтических мероприятий имеет решающее значение для спасения потенциально жизнеспособной ткани в зоне пенумбры и улучшения исхода заболевания. Именно на эту зону ориентированы все современные методы лечения, поэтому понимание механизмов и регулирующих факторов данного процесса является наиболее актуальным направлением клинико-биохимических исследований [11].
Апоптоз представляет собой активный и контролируемый процесс повреждения клеток, регулируемый не только биохимически, но и гененетически. При апоптозе, в отличие от некроза, отмечается активация специфических биологических механизмов, в результате которых происходит разрыв молекулы ДНК и разрушение белоксинтезирующих структур с сохранением целостности мембраны клетки до завершения апоптотических клеточных реакций. Апоптотический процесс характеризуется повышением внутриклеточного содержания Са2, образованием АФК, снижением трансмембранного потенциала митохондрий, выделением цитохрома С из митохондрий в цитоплазму, активацией каспаз и нелизосомных эндогенных эндонуклеаз с последующим расщеплением ядерной ДНК, рибосомальной РНК и белков на фрагменты. Важной чертой апоптоза является то, что удаление поврежденных клеток происходит без развития реакций воспаления [12, 13].
Механизмы запрограммированной смерти включаются позже некротического каскада (спустя 1—2 ч после развития ишемии), достигают максимальной активности на 2—3-и сутки и запускаются при любых ишемических и травматических повреждениях нервной ткани. Апоптоз наряду с другими отдаленными процессами повреждения обусловливает увеличение объема повреждения ткани [1].
В процессе апоптоза участвуют два механизма: внутренний путь, обусловленный митохондриальной недостаточностью, и внешний, возникающий при активации поверхностных рецепторов смерти клетки [14]. Запуск апоптоза происходит при распознавании Fas-рецептором экспрессируемого на нейронах и глии после ишемии своего лиганда (CD95L), что приводит к взаимодействию его внутриклеточного домена с адапторным белком FADD с образованием комплекса DISC (Death-Inducing Signalling Complex) [15]. Затем происходит связывание этого комплекса с молекулой прокаспазы-8, что в дальнейшем, в зависимости от типа клетки, имеет два пути развития событий. В первом случае каспаза-8 напрямую активирует прокаспазу-3 с образованием белков, инициирующих апоптоз [16]. Во втором случае активация прокаспазы-3 имеет более длинный путь, начинающийся с процесса расщепления белка Bid, активирующего проапоптотические белки Bax и Bak, которые изменяют проницаемость наружной мембраны митохондрий, и приводящий к выходу цитохрома С из внутренней мембраны митохондрий [15]. В результате образуется апоптотический сигнальный комплекс, включающий в себя цитохром С, возбуждающий фактор апоптозной протеазы-1 (Apaf-1) и дезокси-АТФ, что инициирует образование каспазы-9 и приводит к активации прокаспазы-3. И уже под ее влиянием происходит дальнейшая гибель клетки, сопровождающаяся фрагментацией ДНК и образованием апоптотических телец, быстро фагоцитируемых макрофагами с выделением противовоспалительных цитокинов [17].
Индукция апоптоза при повреждении ДНК обусловлена появлением в клетке нерепарированных повреждений ДНК, приводящих к активации протеинкиназ, которые фосфорилируют и активируют белковый фактор транскрипции p53. Его активация ведет к подавлению транскрипции генов антиапоптотических белков (bcl-2 и др.) и активации р53-зависимой транскрипции генов проапоптотических белков BAX и FAS. Кроме того, р53 ингибирует синтез ДНК, блокируя инициацию репликации [18]. В последние годы белок р53 рассматривается как один из основных проапоптотических факторов, участвующих в индукции программированной смерти клетки.
На дальнейшее развитие запущенной программированной смерти клетки влияют регуляторы апоптоза семейств Вcl-2 и IAP. Белки семейства Вcl-2 включают как Вcl-2-подобные факторы выживания, так и BAX-подобные факторы гибели [19—21]. Было выявлено [22], что семейство Bcl-2 является регулятором митохондриального пути запуска апоптоза и играет ключевую роль в механизме клеточной гибели при церебральной ишемии. Кроме того, избыток антиапоптотических белков семейства Bcl-2 защищает ткань мозга от ишемии. Белок Bcl-2 контролирует передачу апоптозного внутриклеточного сигнала за счет предотвращения оттока цитохрома C из митохондрий через митохондриальные поры переходной проницаемости, что предотвращает образование апоптосомы с использованием цитохрома C за счет связывания каспазы 9 и апоптозного протеазоактивирующего фактора-1 [23].
На экспериментальных моделях было показано [24], что выраженность повреждения ткани головного мозга определяется не только степенью и длительностью локальной ишемии, но и соотношением проапоптотических и антиапоптотических процессов, которое и обусловливает особенности течения и исхода ИИ.
Цель исследования — изучение динамики концентрации маркеров апоптоза Bcl-2 и p53 в сыворотке крови пациентов в остром периоде ИИ в сопоставлении с динамикой тяжести неврологического дефицита и объемом поражения головного мозга.
Материал и методы
В соответствии с целями исследования обследовали 51 пациента (34 мужчины и 17 женщин) в возрасте от 45 до 75 лет (средний возраст 60,5±2,2 года) в остром периоде верифицированного МРТ впервые развившегося ИИ в системе внутренней сонной артерии: у 27 (52,9%) больных — атеротромботический подтип, у 24 (47,1%) — кардиоэмболический. Больные были включены в исследование в первые 24 ч от начала заболевания и составили основную группу. В группу сравнения вошли 20 больных (12 мужчин и 8 женщин) в возрасте от 45 до 75 лет (средний возраст 58,7±2,1 года) с хронической ишемией головного мозга, по данным анамнеза и результатам МРТ не переносивших инсульт.
Критерии включения: информированное согласие на участие в исследовании; возраст от 45 до 75 лет; верифицированный впервые выявленный ИИ в системе внутренней сонной артерии (атеротромботический и кардиоэмболический ИИ по критериям ТОАSТ); менее 24 ч от начала развития заболевания; неврологическая симптоматика менее 14 баллов по шкале тяжести инсульта NIHSS.
Критерии невключения: отказ от подписания информированного согласия; возраст менее 45 или более 75 лет; повторный инсульт; геморрагический инсульт либо спонтанное субарахноидальное кровоизлияние; ИИ в вертебрально-базилярной системе; расстройства сознания при поступлении до уровня сопора или комы; плохо контролируемая артериальная гипертензия с АД >200/100 мм рт.ст.; острый инфаркт миокарда; наличие застойной сердечной недостаточности ФК II; повышение уровня печеночных трансаминаз (аланинаминотрансфераза и аспартатаминотрансфераза) более чем в 1,5 раза; содержание креатинина в сыворотке крови более 132,6 мкмоль/л; наличие онкологических заболеваний; наличие наследственно-дегенеративных, системных, аутоиммунных, инфекционных и эндокринных заболеваний; декомпенсация сопутствующей соматической патологии; противопоказания для проведения КТ и МРТ головного мозга; участие в других клинических исследованиях.
Проводились динамическое клинико-неврологическое обследование с оценкой выраженности неврологического дефицита по шкале NIHSS; КТ и МРТ головного мозга; иммуноферментный анализ ELISA для определения уровней проапоптотических (p53) и антиапоптотических факторов (Bcl-2) в динамике в сыворотке крови; клинико-инструментальные исследования патологии сердца и сосудов и биохимических показателей крови для определения соответствия пациентов критериям включения. Обследование проводили в 1, 3, 5 и 10-е сутки ИИ.
Статистическая обработка и анализ материала включали применение параметрических и непараметрических методов: вычисление средних значений и доверительных интервалов, анализ корреляционных зависимостей показателей с использованием коэффициента корреляции Пирсона, критерия Стьюдента для выявления статистически значимых различий средних значений параметров в различных выборках. В проведенных сравнениях различие между показателями признавалось статистически значимым на 5% уровне.
Результаты и обсуждение
При анализе динамики неврологического статуса пациентов основной группы по результатам оценки по шкале NIHSS выявлено, что неврологический дефицит в 1-е сутки ИИ варьировал от 5 до 14 баллов (в среднем 11,7±1,5 балла). За время наблюдения (10 сут) у всех пациентов регрессировал общемозговой синдром, у большинства пациентов было отмечено уменьшение неврологического дефицита до 8,3±3,2 балла, за исключением 2 пациентов, у которых состояние осталось неизменным.
Объем повреждения вещества головного мозга варьировал от 15 до 350 см3 (в среднем 117,5±9,6 см3). У мужчин средний объем повреждения вещества мозга составил 106,0±9,2 см3, у женщин — 129,7±10,1 см3.
В проведенном исследовании при анализе про- и антиапоптотических белков в сыворотке крови у пациентов в остром периоде ИИ были зафиксированы статистически достоверно высокие уровни белков р53 и Bcl-2 на 3-и (19,03±13,94 Ед/мл и 3,12±3 нг/мл соответственно) и 10-е сутки (15,91±11,76 Ед/мл и 3,76±4 нг/мл соответственно) исследования при сопоставлении с группой сравнения согласно двухвыборочному t-тесту Стьюдента (р<0,05). Результаты динамики сывороточных уровней р53 представлены на рис. 1.
При анализе различий уровня в сыворотке р53 в зависимости от тяжести неврологического дефицита в 1-е сутки ИИ, оценивавшегося по шкале NIHSS (сравнение подгрупп, полученных при делении основной группы исследования по балльной оценке: NIHSS ≥10 и NIHSS <10 баллов), были зафиксированы достоверно более высокие значения данного показателя у пациентов в подгруппе с более выраженным неврологическим дефицитом в 1-е сутки (19,82 Ед/мл; р=0,0384) и 3-и сутки (26,94 Ед/мл; р=0,0245) ИИ (рис. 2).
При анализе средних уровней р53 в сыворотке крови в зависимости от объема очага повреждения мозга по данным МРТ (сравнение подгрупп, полученных при делении основной группы исследования, с объемом поражения 50 см3 и более и менее 50 см3) были установлены более высокие значения концентрации белка р53 на протяжении всего исследования: 1-е сутки заболевания — 17,97±13,55 и 0,38±0,25 Ед/мл (р=0,0009); 3-и сутки — 28,75±20,56 и 1,2±0,89 Ед/мл (р=0,008); 5-е сутки — 14,78±14,36 и 1,29±0,82 Ед/мл (р=0,04) и 10-е сутки — 20,645±14,97 и 0,5±0,37 Ед/мл соответственно (р=0,007) (рис. 3).
В основной группе средние сывороточные значения ингибирующего апоптоз белка Bcl-2, согласно двухвыборочному t-тесту Стьюдента, были достоверно выше таковых в группе сравнения (р<0,05) на 3-и (3,12±3 нг/мл) и 10-е сутки (3,76±4 нг/мл) ИИ. У всех пациентов группы сравнения Bcl-2 в сыворотке крови не определялся (рис. 4).
Содержание белка Bcl-2 в сыворотке крови в подгруппе больных с объемом повреждения более 50 см3 было достоверно выше только на 10-е сутки (5,065± 5,0 нг/мл; р=0,0445), что, возможно, обусловлено временными затратами для активации компенсаторных антиапоптотических процессов (рис. 5).
Таким образом, в настоящем исследовании у пациентов с ИИ были выявлены достоверно высокие уровни апоптозиндуцирующего белка р53 и апоптозингибирующего белка Bcl-2 на 3-и и 10-е сутки заболевания при сопоставлении с группой сравнения. Повышение содержания белка р53 положительно коррелировало с тяжестью неврологического дефицита уже в 1-е и 3-и сутки острого ИИ и, по данным МРТ, с объемом поражения паренхимы мозга с момента ИИ и на протяжении всего исследования. Высокий уровень белка Bcl-2 положительно коррелировал с большим объемом очага поражения на 10-е сутки ИИ, что, возможно, обусловлено временны́ми затратами для активизации компенсаторного антиапоптотического процесса.
Полученные данные подтверждают активное участие про- и атиапоптотических процессов в формировании отсроченной гибели нейронов головного мозга, которые являются важными компонентами повреждения ткани мозга при И.И. Идентификация морфологических и биохимических маркеров апоптоза должна в перспективе способствовать более глубокому пониманию механизмов патогенеза заболевания, улучшению дифференциальной диагностики, созданию принципиально новых направлений терапии и возможности прогнозирования течения ИИ (при использовании комбинации маркеров с оценкой каждого из звеньев патогенеза, помимо апоптотических маркеров) [12].
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
*e-mail: chukanova.anna@gmail.com