При рассеянном склерозе (РС) наиболее распространенным является ремиттирующий тип течения, приводящий к ранней инвалидизации пациентов трудоспособного возраста [1—3]. В связи с этим необходима разработка новых способов диагностики и терапии заболевания [4]. Тесное взаимодействие нервной и иммунной систем при РС как в стадии ремиссии, так и при обострении предполагает выявление новых молекулярных мишеней [4]. С учетом инициации заболевания на периферии по-прежнему актуально исследование маркеров воспаления в крови пациентов.

На основании экспериментальных данных была выдвинута гипотеза, что в роли иммунопатологического звена ремиттирующего рассеянного склероза (РРС) выступают белковые молекулы обширного семейства семафоринов и их рецепторы [4—6], участие которых изначально было выявлено в качестве направляющих роста аксонов в период нейронального развития [7, 8].

Исследования, проведенные на животных моделях, касаются патогенеза различных аутоиммунных, ревматологических и онкологических заболеваний с вовлечением семафоринов [4], в частности Sema4D, отнесенного по классу дифференцировки лимфоидных клеток к молекуле CD100 [9].

Показано [4, 10], что Sema-4D-дефицитные мыши устойчивы к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, являющегося моделью РС у животных. Элевация Sema4D была выявлена на поверхности Т-лимфоцитов и в сыворотке крови человека при HTLV1-ассоциированной миелопатии [11]. По данным экспериментов, Sema4D in vitro индуцирует апоптоз незрелых олигодендроцитов, принимающих активное участие в миелинизации нервных волокон [11].

Sema4D не теряет свою биологическую активность как на клетках иммунной системы, особенно на Т-лимфоцитах, так и в растворимой форме, куда он способен трансформироваться из мембранной формы за счет протеолитического отщепления с поверхности клеток [12]. Sema4D распространяет свои эффекты как в иммунной системе, используя рецептор CD72 [13], так и в центральной нервной системе (ЦНС), используя Plexin-В1 [14].

Молекула рецептора CD72 способствует иммунным реакциям семафорина, будучи широко представленной на В-лимфоцитах и являясь негативным регулятором В-клеточной активации. В свою очередь связь Sema4D с CD72 отменяет, по свидетельству экспериментов, эту негативную регуляцию, что теоретически должно вести к гиперактивации клеток [15]. Следует учесть тот факт, что В-лимфоциты наряду с Т-клетками имеют отношение к перманентному патологическому аутоиммунному процессу. Истощение их популяции рассматривается как важная стратегия терапии РРС, в частности при применении моноклональных антител (ритуксимаб и окрелизумаб), цитостатического препарата митоксантрон [1, 16].

Цель исследования — изучение экспрессии Sema4D (CD100), рецептора CD72 и роли Sema4D-CD72-зависимого сигнала в контроле функций иммунокомпетентных клеток при РРС.

В открытом одномоментном контролируемом исследовании были обследованы 76 пациентов. В основную группу вошли 52 пациента с РРС в возрасте 18—55 лет, которые ранее не получали препараты, изменяющие течение РС — ПИТРС (41 пациент в стадии ремиссии, 11 — в стадии обострения): 35 (67,3%) женщин и 17 (32,7%) мужчин. Группу контроля составили 24 здоровых. Диагноз Р.С. основывался на критериях McDonald (2010) [17], РРС был уточнен по принятым критериям [18]. Определение уровня инвалидизации проводилось по расширенной шкале оценки степени инвалидизации (Expanded Disability Status Scale — EDSS) [19]. Шкала EDSS включает восемь функциональных систем (Functional System score, FS — от FS1 до FS8), где FS1 обозначает зрительную функцию, FS2 — функции ствола головного мозга, FS3 — пирамидные функции, FS4 — функции мозжечка, FS5 — чувствительные функции, FS6 — функции мочевого пузыря и кишечника, FS7 — функции мышления, FS8 — функции ходьбы. Превалирующими вариантами дебюта РРС являлись сенсорные нарушения (25%) и ретробульбарный неврит (17%). Клиническая характеристика пациентов с РРС представлена в табл. 1.

При иммунологическом обследовании использовали гепаринизированную венозную кровь, из которой выделяли плазму и мононуклеарные клетки периферической крови.

Алгоритм лабораторных исследований представлен на рис. 1.

Критерием исключения из исследования явилось наличие в анамнезе системного воздействия кортикостероидов в течение как минимум 30 сут до взятия образцов периферической крови, учитывая их возможное иммунодепрессивное воздействие на клеточное звено иммунной системы [20].

Полученные мононуклеарные клетки периферической крови были использованы для оценки экспрессии (присутствия молекулы на мембране) Sema4D ex vivo Т-лимфоцитами, для чего применяли субпопуляционные маркеры CD3, а также CD4/CD8, которые определяют основные функциональные субпопуляции лимфоцитов. Выделяли не-Т-клеточную субпопуляцию CD3^–-лимфоцитов, состоящую из В-клеток, естественных киллеров и моноцитов. Моноклональные антитела к каждой из мембранных молекул (CD3, CD4 или CD8, CD100) были мечены разными флюорохромными метками. При помощи проточной цитометрии выявляли процент CD100-позитивных клеток в клеточной субпопуляции и среднюю интенсивность их свечения (Mean Fluorescence Intensity — MFI, условные единицы — у.е.), отражающую численность (плотность) молекул на мембране клетки.

Для оценки изменений экспрессии Sema4D Т-лимфоцитами в условиях, имитирующих иммунный ответ, определяли ее выраженность в культуре в спонтанном варианте (в полной питательной среде) и условиях активации. Клетки культивировали в течение 1 и 18 ч с использованием активатора форболмиристатацетата (ФМА), после чего определяли экспрессию Sema4D на мембране в общей популяции Т-лимфоцитов (CD3⁺-клеток). Оценивали процент CD100-позитивных клеток в клеточной субпопуляции и среднюю интенсивность их свечения.

Уровень растворимого Sema4D (soluble Sema4D — sSema4D) определяли в плазме крови и супернатантах клеточных культур (спонтанный вариант и вариант с активатором), полученных по окончании 18-часового культивирования Т-лимфоцитов, иммуноферментным методом.

У пациентов в стадии обострения РС были оценены 2 иммунологических показателя — экспрессию семафорина Sema4D/CD100 на Т-лимфоцитах периферической крови ex vivo и уровень sSema4D в плазме крови.

Экспрессию рецептора CD72 для Sema4D B-лимфоцитами определяли еx vivo в суспензии мононуклеарных клеток периферической крови с помощью клеточного маркера CD19⁺. Оценивали процент СD72⁺-клеток в популяции CD19⁺-клеток и среднюю интенсивность их свечения.

Для оценки влияния молекулы Sema4D на B-лимфоциты последние культивировали в течение 48 ч в присутствии Т-клеток в спонтанном варианте, на фоне активации (с использованием форболмиристатацетата и иономицина), а также на фоне блокады Sema4D-CD72-сигнала (отдельно проводили блокаду Sema4D и отдельно — блокаду его рецептора CD72). Изучали экспрессию 2 провоспалительных цитокинов (фактор некроза опухоли-α — TNF-α и лимфотоксин-α — LT-α) и одного противовоспалительного (интерлейкин-10 — IL-10) в CD19⁺-клетках. Выявляли процент клеток, несущих цитокин.

Статистическая обработка данных проводилась непараметрическими методами с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 («StatSoft Inc.», США). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05. При p<0,001 производили указание в формате p=0,000.

При анализе экспрессии семафорина Sema4D/CD100 Т-лимфоцитами ex vivo в обеих группах обнаружили, что Т-лимфоциты конститутивно экспрессируют маркер CD100 как у пациентов с РС, так и у здоровых [21, 22]. Однако уровень экспрессии Sema4D на Т-лимфоцитах (MFI) значимо превалировал в субпопуляциях клеток у 37 пациентов с РРС над показателями 20 здоровых группы контроля: CD3⁺4⁺ (p=0,000), CD3⁺8⁺ (p=0,000), CD3^– (p=0,003) (рис. 2).

Значимых отличий по уровню экспрессии Sema4D в субпопуляциях мононуклеарных клеток периферической крови у 27 пациентов с РРС в стадии ремиссии и у 10 — в стадии обострения не было установлено, что предполагает отсутствие зависимости экспрессии Sema4D от стадии демиелинизирующего процесса. Не было обнаружено отличий в уровне экпрессии Sema4D на мембране лимфоцитов и по половому признаку.

Была прослежена прямая корреляционная связь между процентом CD100⁺ клеток в субпопуляции CD3⁺CD4⁺-лимфоцитов и значением FS2 (функции ствола мозга) шкалы EDSS (r=0,418, p=0,010), FS7 (когнитивные функции) (r=0,351, p=0,033), FS8 (функции ходьбы) (r=0,338, p=0,041), а также между уровнем экспрессии Sema4D/CD100 на CD3^–-клетках и значением FS2 (функции ствола головного мозга) (r=0,406, p=0,014).

У пациентов с РРС был отмечен более значимый интервал снижения уровня экспрессии Sema4D/CD100 на мембране CD3⁺-клеток в условиях активации 18-часовых клеточных культур в сравнении с показателем 1-часовых клеточных культур (рис. 3, график

При этом у пациентов с РСС показатели уровня экспрессии Sema4D/CD100 на мембране CD3⁺-клеток были статистически значимо выше в сравнении с таковыми в группе контроля на большинстве этапов культивирования (табл. 2).

Уровень sSema4D в плазме крови был повышен у 21 пациента с РРС в сравнении с 7 здоровыми (p=0,012): у 14 больных РРС в стадии ремиссии (p=0,031) и у 7 в стадии обострения (p=0,018) (рис. 4).

Однако отличий по уровню sSema4D в плазме крови 14 пациентов с РРС, находящихся в стадии ремиссии (4,62 [2,92; 5,88]), и 7 больных в стадии обострения (7,08 [3,37; 9,63]), выявлено не было (p=0,371). Не было обнаружено зависимости уровня sSema4D в плазме крови от клинических особенностей пациентов.

У 15 пациентов с РРС в стадии ремиссии и 14 здоровых группы сравнения уровень sSema4D в супернатантах 18-часовых клеточных культур (и активированного, и спонтанного вариантов) значимо возрастал в сравнении с его уровнем в плазме крови (см. рис. 4), преобладая при РС в активированном варианте супернатанта 18-часовых клеточных культур в группе контроля.

Нарастание уровня sSema4D при культивировании клеток у пациентов с РРС представляется логичным в связи с выявленным ранее высоким уровнем экспрессии мембранного Sema4D: чем выше уровень мембранного Sema4D, тем более выражено повышение sSema4D в условиях клеточной активации. Точно так же это согласуется с выявленным снижением у пациентов с РРС уровня экспрессии Sema4D на мембране в ходе 18-часового культивирования лимфоцитов (см. рис. 3), учитывая экспериментальные данные о слущивании Sema4D с мембраны с переходом в растворимую форму [12].

У 14 пациентов в стадии ремиссии РРС была прослежена обратная корреляция между уровнем sSema4D в плазме крови и длительностью заболевания (r= –0,567, p=0,035), что связано с преобладанием воспалительных изменений (демиелинизации) в дебюте патологии. При экзацербации РРС в 7 случаях была прослежена прямая корреляция между уровнем sSema4D в плазме крови и количеством контрастируемых очагов в головном мозге (r=0,900, p=0,037), что может отражать усиление воспаления и демиелинизации в ЦНС в этой стадии заболевания.

Кроме того, было выявлено значимое снижение процента CD72⁺ и CD19⁺-клеток у пациентов с РРС в сравнении со здоровыми (табл. 3)

У пациентов с РРС было повышено процентное содержание В-лимфоцитов (доля CD19⁺-клеток) в периферической крови по сравнению со здоровыми (см. табл. 3) [21, 22]. Учитывая, что CD72 является негативным регулятором функции В-клеток [23], а связывание Sema4D с рецептором CD72 отменяет негативное действие CD72 на В-клеточную активацию [24], установленное в настоящем исследовании повышение уровня экспрессии Sema4D интактными Т-лимфоцитами в периферической крови пациентов с РРС в сравнении со здоровыми указывает на возможное участие семафорина в гиперактивации B-клеточного звена иммунной системы при РРС [21, 22].

Исследован профиль цитокинов, синтезируемых В-лимфоцитами при их культивировании (48 ч) в присутствии Т-клеток. В спонтанном варианте (без активации клеток) В-клетки здоровых синтезируют значимо меньшее количество провоспалительных цитокинов, TNF-α и LT-α, в сравнении с группой пациентов с РРС (p=0,003 и p=0,001 соответственно) и большее количество противовоспалительного цитокина IL-10 (p=0,001) (табл. 4).

По результатам настоящего исследования, происходило смещение профиля всех исследуемых цитокинов, синтезируемых В-лимфоцитами, в условиях активации клеток у пациентов с РРС: увеличение процента B-клеток, содержащих исследуемые цитокины TNF-α (p=0,003), LT-α (p=0,003), IL-10 (p=0,040). При этом в активированном варианте процент клеток, несущих цитокин, преобладал у пациентов с РРС только для одного провоспалительного цитокина — TNF-α (p=0,015).

В свою очередь при блокаде Sema4D-CD72-сигнала тоже происходило изменение профиля цитокинов в сравнении со спонтанным вариантом без ингибитора у пациентов с РРС: снижение процента B-клеток, продуцирующих TNF-α (p=0,004 при блокаде Sema4D и p=0,006 при блокаде CD72), и LT-α (p=0,017 при блокаде Sema4D и p=0,004 при блокаде CD72).

Это показывает участие семафорина Sema4D в активации В-клеточного звена при РРС при взаимодействии с рецептором CD72 в индукции синтеза провоспалительных цитокинов. Что касается противовоспалительного цитокина IL-10, то увеличение доли B-клеток, его продуцирующих, происходило изолированно на фоне блокады Sema4D (p=0,008).

Учитывая совокупность измененных иммунологических показателей с акцентом на повышение экспрессии Sema4D в иммунной системе при РРС, можно предложить несколько механизмов вовлечения семафорина в патогенез этого заболевания. Во-первых, Sema4D способен вызывать апоптоз незрелых нейронов и олигодендроцитов [11] и у пациентов с РС он, вероятно, оказывает непосредственное поражающее действие на нервные ткани, причем как в растворимой форме с проникновением через неполноценный при РС гематоэнцефалический барьер, так и в мембранной форме за счет инфильтрации ЦНС Т-лимфоцитами и их активации в ответ на аутоантигены. Во-вторых, так как мембранный Sema4D может выступать не только в качестве лиганда, но и как рецептор, проводя сигнал в Т-клетку, причем сигнал костимулирующий [10], повышение его экспрессии при РС влияет на усиление активации Т-лимфоцитов, в том числе аутоспецифичных Т-клеток, как во вторичных лимфоидных органах, так и в ЦНС. Исходя из полученных данных, роль семафорина Sema4D в иммунной системе в условиях относительной нормы и аутоиммунной патологии можно представить в виде следующей схемы (рис. 5).

Научно обоснованно применение SemaD в качестве мишени при терапии РРС [4], что, несомненно, предполагает дальнейшие исследования с использованием моноклональных антител к этой молекуле.

При положительном решении о применении анти-Sema4D-препаратов необходимо учитывать эффекты семафорина не только в ЦНС, но и в иммунной системе пациентов с РРС.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Данченко И.Ю. — https://orcid.org/0000-0002-3145-5409; e-mail:irene-dan@mail.ru

Байдина Т.В. — https://orcid.org/0000-0002-5114-0463; e-mail: tatiana_baidina@mail.ru

Куклина Е.М. — https://orcid.org/0000-0002-2173-2724; e-mail: ibis_07@mail.ru

Трушникова Т.Н. — https://orcid.org/0000-0001-9199-7392; e-mail: trushnikova.t@mail.ru

Некрасова И.В. — https://orcid.org/0000-0002-6706-5912; e-mail: nirina5@mail.ru

Как цитировать:

Данченко И.Ю., Байдина Т.В., Куклина Е.М., Трушникова Т.Н., Некрасова И.В. Ремиттирующий рассеянный склероз: клинико-иммунологические аспекты патологии на примере молекул Sema4D и CD72. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2019;119(10, вып. 2):63-71. https://doi.org/10.17116/jnevro201911910263

Автор, ответственный за переписку: Данченко Ирина Юрьевна — e-mail: irene-dan@mail.ru