Ежегодно в мире регистрируется не менее 15 млн случаев инсульта. В России заболеваемость инсультом составляет 3,4 на 1000 населения в год, или в абсолютных цифрах более 450 000 новых инсультов в год, на лечение и профилактику инсультов направлены значительные усилия врачей и ученых [1, 2]. В структуре инсультов ишемические поражения в целом преобладают над геморрагическими, составляя более 80% всех случаев. Комплексный подход к терапии инсульта включает реперфузионную, противотромботическую и цитопротективную терапию [3], в связи с чем активно развивается направление по фармакологической защите нейронов, т. е. созданию новых нейропротекторов. Патогенез постишемических процессов весьма сложен, включает несколько стадий и продолжает активно изучаться. В настоящее время не подлежит сомнению ведущая роль активных форм кислорода в патогенезе ишемических повреждений. Окислительный стресс, который определяется как дисбаланс между прооксидантной и антиоксидантной системами, является важным механизмом вовлечения в ишемический процесс. На ранней стадии ишемии головного мозга количество активных форм кислорода (АФК) увеличивается. Считается, что повышение АФК является следствием ишемии головного мозга и обострением состояния, вызванного гибелью клеток, апоптозом в результате окислительного стресса. При этом во время восстановления ткани мозга АФК действуют как сигнальные молекулы и могут быть полезны для регуляции ангиогенеза и предотвращения повреждения тканей головного мозга [4]. Важная роль в выраженности последствий ишемического инсульта отводится астроглии и воспалительным процессам. Установлено, что у мышей с отсутствием IL-1 наблюдается резкое снижение объемов инфаркта по сравнению с диким типом [5]. Недавние исследования показали определенную эффективность ингибиторов JNK-киназ [6], а также агонистов имидазолиновых рецепторов [7]. Определенную перспективу в качестве противоинсультных препаратов представляют соли лития. Препараты лития используются в медицине главным образом в качестве нормотимиков [8]. Ранее было показано собственное церебропротективное действие ионов лития [9, 10]. Отмечено положительное действие ионов лития в постинсультный период [11]. Однако препараты для лечения инсульта на основе солей лития отсутствуют.

Цель настоящей работы — изучение протективного действия антиоксиданта аскорбата лития на модели острого ишемического инсульта у крыс. В более ранних исследованиях [12, 13] было установлено, что эта соль обладает более низкой токсичностью (LD₅₀ >4000 мг/кг) в сравнении с используемыми в клинической практике препаратами лития и высокой антиоксидантной активностью.

Опытные партии аскорбата лития для экспериментов синтезировали из исходных реактивов аскорбиновой кислоты, карбоната лития («Sigma-Aldrich», Германия), квалификации ACS. Реагенты в стехиометрическом соотношении растворяли в дистиллированной воде при умеренном нагревании до 30 °C и постоянном перемешивании в течение 30 мин. Продукт реакции осаждали этанолом, промывали и сушили. Полученный продукт анализировали для подтверждения состава атомно-эмиссионной спектрометрией, CHNO-элементным анализом, ИК-спектроскопическим и термогравиметрическим методами. Полученный белый кристаллический порошок использовали в экспериментах в виде водного раствора.

В эксперименте использовали крыс-альбиносов линии Спрег-Доули обоих полов в возрасте 6—8 нед, массой 220—260 г, полученных в виварии НИИ Фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга (Томск). Животных случайным образом разделили на контрольную и экспериментальную группы по 10 крыс в каждой. Крысам экспериментальной группы вводили аскорбат лития внутрижелудочно с помощью зонда из расчета 200 мг/кг массы. Животным контрольной группы вводили 1 мл физиологического раствора внутрижелудочно.

Операцию моделирования ишемического инсульта выполняли по методике филаментной окклюзии средней мозговой артерии [14]. Под ингаляционным наркозом (кислород + 2% изофлуран) микрохирургическим способом выделяли общую, наружную и внутреннюю сонные артерии слева. После перевязки и отсечения наружной сонной артерии в образованную культю вводили фирменный нейлоновый филамент, покрытый медицинским силиконом («Doccol», США), подобранный по размеру в соответствии с массой животного. Филамент проводили через наружную и общую во внутреннюю сонную артерию до уровня, соответствующего отхождению средней мозговой артерии, что приводило к ее окклюзии и ишемии соответствующего участка головного мозга. Филамент оставляли в сосудистой системе на 1 ч, затем постепенно извлекали, сначала из внутричерепного отдела (частичная реперфузия), а через 15 мин полностью, отрывая кровоток по системе общая—внутренняя сонная артерии (полная реперфузия). Эта методология соответствует хронологии общепринятой тактики оказания экстренной медицинской помощи пациентам с ишемическим инсультом. После операции крыс помещали в обычные условия с неограниченным доступом к еде и питью. Крыс экспериментальной группы наблюдали в течение 1 сут после вмешательства и оценивали их выживаемость. После 24 ч с момента окклюзии животное выводили из эксперимента. Эвтаназию экспериментального животного проводили при помощи передозировки ингаляционного наркозного препарата.

После извлечения головной мозг крысы замораживали и готовили срезы толщиной 2 мм. Определение объема ишемического инфаркта мозга проводили путем окраски срезов мозга 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом. Срезы помещали в 1% раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида и инкубировали в течение 15 мин при температуре 37 °C. В результате зоны инфаркта мозга оставались неокрашенными, остальные ткани приобретали розовую окраску. Далее срезы сканировали, измеряли площадь зоны инфаркта при помощи программного обеспечения ImageJ и рассчитывали общий объем зоны инфаркта мозга.

По полученным результатам рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение (М±SD). Для оценки статистических параметров при сравнении групп животных использовали параметрический критерий Стьюдента. Различия групп считали достоверными при p<0,001.

Гистологическое исследование ткани головного мозга крыс показало, что объем зоны инфаркта при воздействии лития в экспериментальной группе составил 62±27 мм³, что достоверно меньше (p<0,001), чем в контрольной группе, где объем зоны инфаркта мозга составил 248±41 мм³. На рис. 1 представлены

Полученные результаты подтверждают высокую цитопротективную активность аскорбата лития при ишемических и реперфузионных повреждениях мозговой ткани. Ишемический инсульт характеризуется острым началом и формированием стабильного или частично регрессирующего неврологического дефекта, обусловленного развитием зоны некроза нейронов, поэтому в терапевтическом плане наибольшую значимость имеет перифокальная зона инфаркта — пенумбра, сохранение и восстановление нейронов именно этой зоны является ключевой задачей. В состоянии гибернации и гипоксии в клетках нарушаются обычные биохимические процессы, что усугубляется при быстром развитии окислительных повреждений после реперфузии ткани. Однако внутриклеточные механизмы действия лития при ишемии во многом остаются неизвестными. В настоящее время доказанным считается ингибирующее действие лития на киназу гликогенсинтазы 3β, которое, видимо, обусловливает нормотимический (прежде всего антиманиакальный) эффект лития. Ингибирование гликогенсинтазы играет роль при ишемическом процессе ввиду неспецифичности воздействия лития. Рассматривается теория антагонизма по отношению к ионам натрия и, таким образом, влияние на процессы поляризации/деполяризации. Противоишемическое действие солей лития, очевидно, не ограничивается этими путями и включает снижение окислительного повреждения вследствие реперфузии и уменьшение апоптоза в клетках поврежденной ткани. При этом важная функция принадлежит воздействию аниона в литиевом препарате. Для разных солей лития показаны как апоптоз-ингибирующее, так и апоптоз-индуцирующее воздействие на клетки in vitro [15, 16]. Нарушение энергетического обмена играет центральную роль в инициации гибели нейронов после церебральной ишемии. Поддержание энергетического гомеостаза, опосредованного нейропротективным эффектом препарата, может также вносить вклад в общую выживаемость нейронов в зоне ишемической полутени. Вероятно, этот эффект солей лития также опосредуется анионным компонентом. При этом задействуются многие метаболические внутриклеточные пути и выделение конкретной мишени является весьма проблематичным, поскольку нарушаются базовые биохимические процессы, в том числе фосфорилирование и присоединение ацетилглюкозаминовых (O-GlcNAc) фрагментов к цитоплазматическим и митохондриальным белкам. Последние исследования показывают, что посттрансляционная модификация (O-GlcNAcylation) является путем, который модулирует гомеостаз глюкозы при ишемическом инсульте, и фармакологическое воздействие на этом этапе способствует выживанию нейронов [17]. Однако влияние ионов лития на этот процесс остается неподтвержденным.

Проведенное предварительное изучение защитных свойств аскорбата лития в дозе 1,2 мМ при острых нарушениях мозгового кровообращения выявило, что препарат оказывает выраженное церебропротективное действие и снижает объем инфаркта мозга в среднем на 75% в сравнении с контролем. Таким образом, сочетание известных нормотимических и антиоксидантных свойств аскорбата лития наряду с выраженным церебропротективным действием представляется перспективным для клинических исследований и практического применения в неврологии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Плотников Е.В. — https://orcid.org/0000-0002-4374-6422; e-mail: plotnikov.e@mail.ru

Литвак М.М. — https://orcid.org/0000-0001-9527-3332; e-mail: mm_litvak@mail.ru

Автор, ответственный за переписку: Плотников Евгений Владимирович — e-mail: plotnikov.e@mail.ru