Детский аутизм (ДА) характеризуется дефицитом социального общения и взаимодействия, а также повторяющимся поведением детей, включая интересы или действия [1]. За последние 10 лет появилось много доказательств того, что воспалительные механизмы, приводящие к развитию иммунной дисрегуляции, вносят вклад в развитие ДА [2]. Помимо измененного системного иммунитета [3—4], в головном мозге пациентов с ДА наблюдается нейровоспаление, связанное с активацией микроглии. Есть данные о наличии активированной микроглии в дорсолатеральной префронтальной коре головного мозга пациентов с ДА [5]. Исследования с помощью позитронно-эмиссионной томографии выявили активацию микроглии в других областях мозга [6, 7]. Патолого-анатомические исследования детей с расстройствами аутистического спектра (РАС) показали активацию микроглии и увеличение ее плотности [8, 9]. Иммунологическая дисфункция у пациентов с ДА сопровождается повышенной экспрессией провоспалительных факторов, таких как цитокины и хемокины, в головном мозге и цереброспинальной жидкости [10]. В частности, провоспалительный цитокин IL-6, хемокины MCP-1 и RANTES были обнаружены в образцах крови у детей с ДА [10]. Было показано, что дефицит микроглиальной активности из-за воспаления во время развития мозга оказывает негативное влияние на формирование зрелых синапсов, приводя к увеличению незрелых синапсов, что может быть причиной когнитивных и поведенческих расстройств у больных с ДА [11, 12]. Таким образом, нейровоспалительные механизмы привлекают все большее внимание при изучении этиологии и патогенеза ДА.
В настоящее время показано, что существуют перекрестные связи между коагуляцией (свертыванием крови), иммунитетом и воспалением [13]. Выявлены специфические регуляторные механизмы, обеспечивающие поддержание баланса между коагуляцией и воспалением, необходимого для защиты организма от широкого спектра патологических проблем, связанных с неконтролируемым развитием воспалительной реакции и в конечном итоге для выживания. Если коагуляция и воспаление не сбалансированы между собой, появляются новые патологические проявления и обостряются уже существующие [14]. В большинстве случаев эти два процесса изучаются как функционирующие независимо друг от друга. Однако коагуляция и воспаление активируются при одних и тех же заболеваниях и коррелируют как во времени, так и в пространстве в одних и тех же органах и тканях [15]. Это свидетельствует о существовании сильной взаимозависимости между этими системами.
С использованием теста тромбодинамики (ТД) было показано, что у больных с ДА и детской шизофренией наблюдается гиперкогуляция плазмы крови, сопровождающаяся появлением спонтанных очагов микротромбообразования (спонтанных сгустков) [16].
Исследования Т.П. Клюшник и соавт. [17] показали, что у больных РАС в стадии обострения наблюдается активация показателей неспецифического иммунитета нейроиммунотеста (повышение ферментативной активности лейкоцитарной эластазы и функциональной активности протеиназного ингибитора (α1-ПИ, антитрипсина)), а также уровня аутоантител к церебральному белку S100β и основному белку миелина (ОБМ). Таким образом, у обследуемых больных системное иммунное воспаление сопровождается смещением показателей нейроиммунотеста и теста ТД в сторону их активации. Это позволяет предположить, что у детей с ДА, возможно, существуют связи между показателями нейроиммунотеста и теста ТД.
Современный корреляционный анализ связей включает поиск как минимум двух типов коэффициентов корреляции. Парный коэффициент корреляции R по Пирсону (Rij) между двумя параметрами (Хi и Хj) характеризует тесноту линейной связи двух переменных (Хi и Хj) на фоне действия на Rij всех остальных показателей тестов: –1<=Rij<=1.
Однако часто встречается следующая ситуация: если одна переменная коррелирует с другой, то это может быть лишь отражением того факта, что они обе коррелируют с некоторой третьей переменной (ковариатой) или совокупностью нескольких переменных, что требует дополнительного анализа. Поэтому необходимо использовать частные корреляции исследуемых параметров при фиксированных значениях остальных величин. Метод частных корреляций необходим для контроля изменчивости корреляционной связи анализируемых показателей нейроиммунотеста и теста ТД, когда надо учесть их модифицирующие эффекты на изучаемую нами парную корреляцию других показателей нейро-иммуно-теста и/или параметров ТД.
В настоящее время в литературе нет данных об исследовании частных корреляционных связей иммунных параметров нейроиммунотеста и коагуляционных параметров ТД.
Цель исследования — выявить парные и частные корреляции показателей нейроиммунотеста и теста ТД у детей с ДА в состоянии обострения.
Материал и методы
В работе была использована база данных детей с ДА, полученная в 2018—2019 гг. В исследование были включены 46 пациентов с ДА в возрасте от 2 до 13 лет (медианный возраст [Q1; Q3] — 5 лет [4; 7], 10 (22%) девочек и 36 (78%) мальчиков).
Критерии включения: пациенты с диагнозом «детский аутизм» в возрасте от 2 до 22 лет.
Критерий невключения: тяжелые соматические заболевания, влияющие на состояние иммунитета и коагуляции. У всех больных кровь забирали однократно после амбулаторной оценки психического статуса.
От детей и их законных представителей было получено информированное согласие на участие в исследовании. Исследование соответствовало всем положениям Хельсинкской декларации и было одобрено локальным Этическим комитетом НЦПЗ.
У детей с ДА с 1-го года жизни прослеживался асинхронный дизонтогенез по типу «переслаивания» гипо- и гиперчувствительности в области всех анализаторов. Диссоциация сенсорных сфер обусловливала аутистическое «отрешение» в картине заболевания. На 2-м году жизни возникали проявления «мягкой» кататонии с приостановкой в речевом развитии ребенка. При правильной маршрутизации к 4—5 годам диссоциация сенсорной сферы смягчалась. Развивались эмоции, социализация, познавательная активность, речь. Таким образом, состояние обследуемых пациентов определялось высокофункциональным аутизмом, имело благоприятный прогноз и соответствовало I уровню социального функционирования.
Определения показателей нейроиммуннотеста
Нейроиммунотест включает определение энзиматической активности лейкоцитарной эластазы (ЛЭ, leucocyte elastase, LE), функциональной активности α1 протеинового ингибитора (α1-ПИ), определение уровней аутоантител к белку S100B (aabS100Б) и аАТ к ОБМ (Basic Myelin Protein) (aabBMP).
Энзиматическую активность ЛЭ в сыворотке крови определяли ферментативным методом [5] по скорости расщепления специфического хромогенного субстрата N-терт-бутоксикарбонил-L-аланин-паранитрофенилового эфира — BOC-Ala-ONp («ICN Biomedical Inc.») в условиях, подобранных для полного высвобождения фермента из комплекса ЛЭ — α1-ПИ.
Измерение функциональной активности α1-ПИ в сыворотке крови проводили с помощью спектрофотометрического метода [6]. Метод основан на взаимодействии α1-ПИ с трипсином при использовании в качестве субстрата N-α-бензоил-L-аргининэтилового эфира гидрохлорида — BAEE («ICN Biomedical Inc.»). Активность α1-ПИ в сыворотке крови определяли по степени торможения BAEE-эстеразной активности трипсина определенным количеством исследуемой сыворотки.
Определение уровня aabS100b и aabBMP в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) в модификации Т.П. Клюшник и соавт. [17].
Определения параметров тромбодинамики
Тест ТД проводили по методике, описанной нами ранее [4]. При постановке теста рассчитываются следующие параметры: время задержки роста сгустков (Tlag, мин); инициальная скорость роста сгустка от активатора (Vi, мкм/мин) и скорректированная на нелинейность стационарная скорость (V, мкм/мин); плотность сгустка (Density, усл. ед.); время появления спонтанных сгустков (Tsp, мин).
Статистический анализ данных проводили с использованием программного обеспечения Statistica, версия 8 («StatSoft», США) и MedCalc, версия 17.4.1 (Бельгия). Для оценки разницы значений показателей от нормы использовали одновыборочный T-тест (ОВ T-тест, one-sample T-test). Для определения корреляционных связей нами были выбраны показатели нейроиммунотеста и теста ТД, имеющие нормальное распределение (W-критерий Шапиро—Уилка). Корреляционный анализ включал метод определения парных корреляций по Пирсону и частных корреляций с включением ковариат. Статистическая значимость определялась по p<0,05. Силу корреляционных связей определяли по шкале Чеддока: R=0,1—0,3 — слабая, R=0,3—0,5 — умеренная, R=0,5—0,7 — выраженная, R=0,7—0,9 — высокая, R>0,9 — очень высокая.
Результаты
Сравнительный статистический анализ показателей нейроиммунотеста и теста ТД
В табл. 1 приведена описательная статистика показателей нейроиммунотеста и теста ТД, а также их отличий от нормы у детей, больных ДА.
Таблица 1. Значения показателей нейроиммунотеста и теста ТД в группе детей, больных ДА, и их отличия от нормы
| Показатель | Норма | Среднее | σ | Min | Max | 95% ДИ для среднего | Одновыборочный T-тест |
| ЛЭ, нмоль/мин·мл | 150—200 | 230 | 35 | 167 | 309 | 230—251 | p<0,0001*** |
| α1-ПИ, ИЕ/мл | 25—35 | 43 | 10 | 24 | 60 | 40—46 | p<0,0001*** |
| aabS100b, ед.опт.пл | 0,60—0,85 | 0,74 | 0,13 | 0,50 | 0,74 | 0,70—0,77 | p=0,59 |
| aabBMP, ед.опт.пл | 0,60—0,85 | 0,75 | 0,17 | 0,50 | 0,76 | 0,70—0,81 | p=0,62 |
| Tlag, мин | 0,60—1,50 | 1,00 | 0,30 | 0,80 | 1,90 | 1,00—1,20 | p=0,81 |
| Vi, мкм/мин | 38—56 | 59 | 7,4 | 47 | 79 | 57—62 | p=0,0017** |
| V, мкм/мин | 20—29 | 51,5 | 17 | 27 | 87 | 46—57 | p<0,0001*** |
| D, усл. ед. | 15 000—32 000 | 20 815 | 4128 | 14 373 | 33 803 | 19 660—22 720 | p=0,9 |
| Tsp, мин | >30 | 21,8 | 11,9 | 4,5 | 45 | 18—25,5 | p=0,0001*** |
Примечание. ** — p<0,01; *** — p<0,0001.
Видно, что показатели нейроиммунотеста ЛЭ и α1-ПИ, а также показатели теста ТД Vi; V и Tsp находятся за пределами нормальных значений, т.е. смещены в сторону активации (показатели скорости роста тромба Vi и V выше нормы, а время появления спонтанных сгустков Tsp ниже нормы).
Корреляционный анализ, включающий парные и частные корреляции показателей нейроиммунотеста и теста ТД
Как видно из табл. 2, анализ парных корреляций выявил у детей с ДА девять статистически значимых корреляций, которые согласно шкале силы связи Чеддока можно разбить на три группы: группа с умеренной силой связи (R=0,3—0,5): Tlag и V (R=0,406, p=0,0062); Tlag и Tsp; (R=0,396, p=0,01) aabBMP и Tsp (R=0,369, p=0,018); группа с выраженной силой связи (R=0,5—0,7): aabBMP и aabS100b 0,620 p<0,0001); Tlag и Vi (R=0,539, p=0,0002); Tsp и Vi (R=0,625, p<0,0001); Tlag и D (R=0,504, p=0,0005); Vi и V (R=0,406, p=0,0001), группа с высокой силой связи (R=0,7—0,9): Tsp и V (R=0,734, p<0,0001).
Таблица 2. Матрица парных корреляций показателей нейроиммунотеста и теста ТД у детей с ДА
| Показатель | ЛЭ | α1-ПИ | aabS100b | aabBMP | Tlag | Vi | V | D | Tsp |
| ЛЭ, нмоль/мин·мл | 0,163 | –0,18 | –0,174 | 0,006 | 0,157 | 0,242 | 0,077 | –0,247 | |
| 1 | 0,2784 | 0,2321 | 0,2467 | 0,9678 | 0,3138 | 0,1175 | 0,6214 | 0,1194 | |
| α1-ПИ, ИЕ/мл | 0,163 | 0,114 | –0,124 | 0,153 | –0,18 | –0,025 | 0,055 | 0,027 | |
| 0,2784 | 1 | 0,4501 | 0,4112 | 0,3265 | 0,2473 | 0,8738 | 0,7253 | 0,867 | |
| aabS100b, ед.опт.пл | –0,18 | 0,114 | 0,620** | 0,007 | –0,019 | –0,092 | 0,134 | 0,187 | |
| 0,2321 | 0,4501 | 1 | <0,0001 | 0,9619 | 0,9045 | 0,556 | 0,3923 | 0,2426 | |
| aabBMP, ед.опт.пл | –0,174 | –0,124 | 0,620** | –0,105 | –0,095 | –0,203 | 0,116 | 0,369** | |
| 0,2467 | 0,4112 | <0,0001 | 1 | 0,5016 | 0,5467 | 0,1921 | 0,457 | 0,0177 | |
| Tlag, мин | 0,006 | 0,153 | 0,007 | –0,105 | –0,539** | –0,406** | 0,504** | 0,396** | |
| 0,9678 | 0,3265 | 0,9619 | 0,5016 | 1 | 0,0002 | 0,0062 | 0,0005 | 0,0125 | |
| Vi, мкм/мин | 0,157 | –0,18 | –0,019 | –0,095 | –0,539** | 0,679** | –0,166 | –0,625** | |
| 0,3138 | 0,2473 | 0,9045 | 0,5467 | 0,0002 | 1 | <0,0001 | 0,2812 | <0,0001 | |
| V, мкм/мин | 0,242 | –0,025 | –0,092 | –0,203 | –0,406** | 0,679** | –0,177 | –0,734** | |
| 0,1175 | 0,8738 | 0,556 | 0,1921 | 0,0062 | <0,0001 | 1 | 0,2495 | <0,0001 | |
| D, усл. ед. | 0,077 | 0,055 | 0,134 | 0,116 | 0,504 | –0,166 | –0,177 | 0,177 | |
| 0,6214 | 0,7253 | 0,3923 | 0,457 | 0,0005 | 0,2812 | 0,2495 | 1 | 0,2814 | |
| Tsp, мин | –0,247 | 0,027 | 0,187 | 0,369** | 0,396** | –0,625** | –0,734** | 0,177 | |
| 0,1194 | 0,867 | 0,2426 | 0,0177 | 0,0125 | <0,0001 | <0,0001 | 0,2814 | 1 |
Примечание. ** — p<0,05. Коэффициент коррекции вычислялся по Пирсону.
Для ответа на вопрос, являются ли вышеописанные статистически значимые парные показатели (Rij) независимыми или они связаны с другими показателями тестов, были определены частные коэффициенты корреляции Rij между парами переменных при исключении последовательного влияния остальных показателей нейроиммунотеста и теста ТД.
В табл. 3 показано влияние остальных показателей нейроиммунотеста и теста ТД (ковариат) на выявленные парные корреляции показателей нейроиммунотеста и теста ТД у детей с ДА.
Таблица 3. Влияние ковариат на выявленные парные корреляции показателей нейроиммуннотеста и теста ТД в группе ДА
| Ковариаты | Умеренные корреляции | Выраженные корреляции | Высокие корреляции | ||||||
| Tlag & V | Tlag & Tsp | aabBMP & Tsp | aabBMP & aabS100b | Tlag & Vi | Tsp & Vi | Tlag & D | Vi & V | Tsp & V | |
| Нет | –0,406 | 0,392 | 0,368 | 0,617 | –0,539 | –0,62 | 0,51 | 0,68 | –0,73 |
| p=0,006 | p=0,01 | p=0,018 | p<0,0001 | p=0,002 | p<0,0001 | p=0,0005 | p<0,0001 | p<0,0001 | |
| ЛЭ | –0,406 | 0,388 | 0,336 | 0,607 | –0,534 | –0,6 | 0,5 | 0,65 | –0,71 |
| p=0,008 | p=0,017 | p=0,03 | p<0,0001 | p=0,0003 | p=0,0001 | 0,0006 | p<0,0001 | p<0,0001 | |
| α1-ПИ | –0,393 | 0,375 | 0,371 | 0,643 | –0,514 | 0,61 | 0,5 | 0,68 | –0,74 |
| p=0,01 | p=0,02 | p=0,018 | p<0,0001 | p=0,0005 | p=0,0001 | 0,0007 | p<0,0001 | p<0,0001 | |
| aabS100b | –0,333 | 0,368 | 0,327 | n/a | –0,526 | 0,61 | 0,5 | 0,67 | –0,72 |
| p=0,01 | p=0,025 | p=0,04 | p=0,0003 | p=0,0001 | 0,0006 | p<0,0001 | p<0,0001 | ||
| aabBMP | –0,425 | 0,399 | n/a | n/a | –0,542 | 0,58 | 0,52 | 0,66 | –0,69 |
| p=0,005 | p=0,014 | p=0,0002 | p=0,0002 | 0,0004 | p<0,0001 | p<0,0001 | |||
| ЛЭ, α1-ПИ, aabS100b, aabBMP | –0,433 | 0,415 | 0,331 | 0,632 | –0,545 | 0,56 | 0,52 | 0,655 | –0,7 |
| p=0,006 | p=0,015 | p=0,04 | p<0,0001 | p=0,003 | p=0,0005 | 0,0006 | p<0,0001 | p<0,0001 | |
| Tlag | n/a | n/a | 0,34 | 0,61 | n/a | –0,53 | нет | 0,6 | –0,7 |
| p=0,04 | p<0,0001 | p=0,0006 | p<0,0001 | p<0,0001 | |||||
| Vi | –0,065 | 0,08 | 0,2 | 0,61 | n/a | n/a | 0,5 | n/a | –0,56 |
| p=0,67 | p=0,62 | p=0,21 | p<0,0001 | p=0,0007 | p=0,0002 | ||||
| V | n/a | 0,21 | 0,015 | 0,6 | –0,39 | –0,31 | 0,48 | n/a | n/a |
| p=0,19 | p=0,92 | p<0,0001 | p=0,009 | p=0,06 | p=0,001 | ||||
| D | –0,37 | 0,37 | 0,29 | 0,6 | 0,53 | –0,62 | n/a | 0,66 | –0,73 |
| p=0,014 | p=0,02 | p=0,08 | p<0,0001 | p=0,0002 | p<0,0001 | p<0,0001 | p<0,0001 | ||
| Tsp | –0,1 | n/a | n/a | 0,59 | –0,41 | n/a | 0,57 | 0,31 | n/a |
| p=0,56 | p<0,0001 | p=0,009 | p=0,0002 | p=0,053 | |||||
| Vi, V, D, Tsp, Tlag | 0,01 | –0,016 | –0,05 | 0,56 | –0,52 | –0,27 | 0,64 | 0,27 | –0,56 |
| p=0,94 | p=0,92 | p=0,78 | p<0,0008 | p=0,001 | p=0,1 | p<0,0001 | p=0,1 | p=0,0004 | |
Примечание. Выделены жирным шрифтом корреляции с p>0,05; n/a (not applicable) — неприменимо, т.е. данную корреляцию невозможно рассчитать.
Обнаружено, что влияние показателей ТД Vi или Tsp, включенных как ковариаты, приводит к исчезновению парной корреляции (R=n/a) и Tlag и V (R=0,21, p=0,19). Такой же эффект оказывает включение двух ковариат Vi; Tsp совокупности ковариат (Vi; V; D; Tsp; Tlag (R=0,01, p=0,94. Также эти ковариаты влияют на парные корреляции Tlag и Tsp (R=n/a) Tsp и Vi (R=–0,27, p=0,1); Vi и V (R=–0,27, p=0,1). Следовательно, парные корреляции полностью связаны с вмешивающимся влиянием других показателей ТД. Показано также определяющее суммарное влияние на эти парные корреляции показателей ViV (R=0,27, p=0,1); TspTlag (R=–0,016, p=0,94). Таким образом, показано вмешивающееся влияние остальных показателей ТД на корреляции между параметрами ТД.
Обнаружено, что влияние показателей ТД (Vi; V; D; Tsp; Tlag) как ковариат, включенных по отдельности или в совокупности, приводит к исчезновению парной корреляции aabBMP и Tsp. Таким образом, показано вмешивающееся влияние остальных показателей ТД на корреляции между параметрами ТД и нейроиммунотеста.
Было выявлено семь парных корреляционных связей между параметрами теста ТД у детей, больных ДА. Это связано с тем, что все показатели ТД отражают динамику роста тромба от активатора, сопровождающуюся появлением очагов микротромбообразования (спонтанных сгустков).
Была выявлена статистически значимая положительная корреляционная связь между показателем приобретенного иммунитета aabBMP и основным параметром тромбоцитарного гемостаза — Tsp. Можно предположить, что аутоантитела к BMP блокируют прокоагулянтное действие ОБМ и тем самым обладают антикоагулянтным действием. Однако в этом анализе не было учтено возможное влияние других показателей нейроиммунотеста и теста ТД. Поэтому при изучении корреляции конкретных показателей нейроиммунотеста и ТД необходимо учитывать возможное модифицирующее влияние других показателей этих тестов.
Было показано, что в обследуемой группе детей с ДА наблюдается статистически значимая положительная корреляционная связь между показателем приобретенного иммунитета: уровнем сывороточных антител к ОБМ: показатель aabBMP и основным параметром тромбоцитарного гемостаза — Tsp. Следовательно, чем больше уровень аутоантител к ОБМ, тем позже появляются спонтанные сгустки (Tsp). Можно предположить, что аутоантитела к BMP блокируют прокоагулянтное действие ОБМ и тем самым обладают антикоагулянтным действием.
Показано, что при исключении влияния на основную (парную) корреляцию ( aabBMP & Tsp) отдельных показателей тромбодинамики (Vi, V и D), а также их суммарного влияния частная корреляция становится статистически незначимой. Это свидетельствует о том, что эти показатели ТД могут по отдельности или в сумме определять выявленную корреляцию между уровнями антител к ОБМ и временем появления спонтанных сгустков.
Что касается нейроиммунотеста, то видно, что у детей с ДА при исключении влияния на парную корреляцию (aabBMP & Tsp) его отдельных показателей (α1-ПИ, abS100b, aabBMP), а также их суммарного влияния частная корреляция остается статистически значимой. Таким образом, данные показатели по отдельности или одновременно не влияют на выявленную корреляцию между aabBMP и Tsp.
Это может свидетельствовать о большой связности (connectivity) иммунной системы и системы гемостаза у пациентов с ДА. Данный показатель связности отражает повышенную сложность и упорядоченность этих систем, а также большую способность к взаимодействию их отдельных компонентов (показателей нейроиммунотеста и ТД).
В исследовании не учитывалось возможное влияние различных психопатологических параметров, возрастного фактора и этапа заболевания (обострение, ремиссия) на показатели ТД и параметры нейроиммунотеста, что может быть отнесено к ограничениям исследования.
Заключение
Статистическая значимость большинства выявленных парных корреляций определяется вмешивающим влиянием показателей нейроиммунотеста и тромбодинамики. Было показано, что у детей с ДА корреляционные связи между изучаемыми параметрами нейроиммунотеста и показателями теста ТД взаимно зависят от остальных показателей этих тестов. Это подтверждает гипотезу, что иммунная система и система гемостаза представляют две разные стороны единой суперсистемы, что существенно расширяет имеющиеся представления о патогенетических механизмах, лежащих в основе изучаемых заболеваний.
Для более тщательного исследования характеристик этой системы у больных расстройствами аутистического спектра необходимо дальнейшее определение показателей нейроиммунотеста и теста ТД, а также изучение сопряженности корреляционных связей между изучаемыми параметрами тестов с особенностями клинической симптоматики пациентов в рамках этой нозологии.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.