В настоящее время ведущая роль в патогенезе большинства нервных и психических заболеваний отводится нарушению функционирования нейромедиаторных и нейромодуляторных систем, в частности выбросу возбуждающего медиатора — глутамата, лежащему в основе так называемой «смерти от перевозбуждения» или феномена эксайтотоксичности [2, 5].
Глутамат содержится в большинстве нейронов мозга. При гипоксии нервных клеток (возникающей при многих заболеваниях ЦНС) глутамат высвобождается из окончаний нейронов в межклеточное пространство. Его избыточное накопление активирует ионотропные NMDA- и AMPA-подтипы рецепторов, вызывая массивный приток ионов Са2+ в цитоплазму постсинаптического нейрона. Кальций в свою очередь запускает ряд процессов: активацию дыхательной цепи митохондрий с увеличением утечки супероксидного анион-радикала и гидроксильного радикала; активацию НАДФН
Мексидол — 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат — синтетический антиоксидант, создание и внедрение в клиническую практику которого является несомненным достижением отечественной фармакоиндустрии. Препарат доказал свою эффективность в лечении ряда неврологических и психических заболеваний [12]. Однако некоторые аспекты механизма и локализации его действия, например нейронные, окончательно не изучены.
Цель настоящего исследования — изучение влияния мексидола на развитие феномена эксайтотоксичности in vitro.
Материал и методы
В исследовании использовали 5% раствор мексидола («Фармасофт»).
Для изучения влияния мексидола на нейротоксичность глутамата у анестезированных нелинейных белых крыс-самцов извлекали из черепной коробки головной мозг и делали из него срезы толщиной 1 мм [7]. Из срезов или сразу готовили гомогенат (норма), или инкубировали их в течение 15 мин при температуре 37 °С в среде, содержащей 50 мМ трис-НСl буфера («Serva»), 0,25 М сахарозного буфера при рН=7,4 («Химмед»), 1 мМ L-глутамата («Sigma») (контрольная серия) и разные концентрации мексидола (опытные серии). После инкубации этих срезов также готовили гомогенат. Для оценки выраженности повреждения нейронов определяли уровень вторичного продукта ПОЛ малонового диальдегида (МДА) — по реакции с тиобарбитуровой кислотой [3].
Влияние мексидола на свободнорадикальное окисление, индуцируемое двухвалентным железом, изучали в двух метаболизирующих модельных системах (неферментативного — аскорбатзависимого и ферментативного — НАДФН
Способность мексидола связывать супероксидный анион-радикал изучали в модельной системе, основанной на спонтанном окислении кверцетина [12]. Пусковой стадией в этом процессе является образование супероксидного анион-радикала, поэтому вещества, способные связывать активные формы кислорода, тормозят аутоокисление кверцетина. В состав реакционной смеси входили: 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН=7,8), 2,4 мл дистиллированной воды или раствора изучаемого вещества, 0,058 мл тетраметилэтилендиамина («Sigma»), 0,08 мМ ЭДТА («Химмед»). Реакцию начинали внесением в среду инкубации 0,1 мл 0,462 мМ раствора кверцетина («Sigma»). Об антисупероксидной активности судили по проценту ингибирования аутоокисления кверцетина (А%), рассчитанному по формуле: А%=(ОД
Влияние мексидола на активность Cu, Zn-супероксиддисмутазы (СОД), Se-зависимой глутатионпероксидазы, 1-изофермента глутатион-SH-трансферазы, каталазы, нейрональной NO-синтазы (nNOS) и индуцибельной NO-синтазы (iNOS) изучали с использованием соответствующих ферментов («Roche)» в модельных системах, предназначенных для определения их активности: СОД — по торможению спонтанного окисления кверцетина [8]; Se-зависимой глутатионпероксидазы — по снижению концентрации НАДФН
В качестве препаратов сравнения при изучении антисупероксидной активности использовали аскорбиновую кислоту, при изучении влияния на железо-индуцируемое аскорбат- и НАДФН
Число независимых определений в каждом эксперименте равнялось шести. Измерение экстинкции выполняли на биохимическом анализаторе Humalaizer 2000.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.1. Результаты представлены в виде среднего арифметического и его ошибки (M±m). Различия между группами оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), критерия Ньюмена—Кейсла. Достоверными считались различия при р<0,05 [4].
Результаты
Мексидол достоверно (р<0,05) дозозависимо подавлял развитие глутаматиндуцируемой нейротоксичности, о чем свидетельствует значительное снижение содержания МДА в гомогенатах мозга, инкубируемых с мексидолом (рис. 1). В концентрации 10 мМ мексидол снижал содержание МДА в мозге на 42,0%, в концентрации 3 мМ — на 33,9%, в концентрации 0,5 мМ — на 23,3%, а в концентрации 0,1 мМ — на 11,5%. При изучении механизмов развития данного эффекта были получены следующие результаты. Мексидол достоверно (р<0,05) дозозависимо подавлял аскорбатзависимое железо-индуцируемое ПОЛ в течение 15 мин инкубации, причем по этому эффекту значительно превосходил кудесан (табл. 1). В конечной концентрации в растворе 12,5 мМ мексидол ингибировал аскорбатзависимое ПОЛ через 5 мин от начала инкубации на 65,8%, через 15 мин — на 75,9%; в концентрации 3 мМ — на 22,7 и 84,6%; в концентрации 0,3 мМ — на 39,6 и 56,5% соответственно. К 30-й минуте инкубации содержание мексидола, по-видимому, истощалось, и прирост уровня МДА достоверно (р<0,05) превосходил контрольные показатели на 18,3, 23,3 и 16,6% при конечных концентрациях мексидола 12,5, 3,3 и 0,3 мМ соответственно. В максимальной концентрации кудесан (1,86 мМ витамина Е, 5,72 мМ коэнзима Q
Рис. 1. Влияние мексидола на глутамат-индуцируемую нейротоксичность (по концентрации МДА, нмоль/мг белка). |
Примечание. Здесь и на рис. 2: * - достоверные различия по сравнению с пробами, не содержащими изучаемые вещества, на уровне p<0,05. |
Таблица1 |
При изучении НАДФН
Таблица2 |
В концентрации 12,5 мМ — на 33,3% через 5 мин инкубации и на 35,48% — через 15 мин; в концентрации 3,3 мМ через 15 мин — на 11,5% и через 30 мин — на 48,8%; в концентрации 0,3 мМ через 15 мин — на 18,43%, а через 30 мин — на 31,9%. В отличие от этого эффект кудесана максимально проявлялся к 15-й минуте, а к 30-й минуте инкубации его содержание истощалось, и прирост МДА начинал превосходить показатели контроля.
Мексидол в концентрациях от 0,75 до 3,125 мМ подавлял аутоокисление кверцетина с 71,42 до 6,2% (р<0,05), что свидетельствует о его способности связывать супероксидный анион-радикал (рис. 2). По данному эффекту мексидол значительно уступал аскорбиновой кислоте, которая подавляла образование супероксидного анион-радикала в данных концентрациях на 100% (р<0,05).
Рис. 2. Влияние мексидола и аскорбиновой кислоты на образование активных форм кислорода (по % ингибирования аутоокисления кверцетина) |
Мексидол достоверно не влиял на активность каталазы и глутатион-SH-трансферазы (рис. 3), но значительно повышал активность Se-зависимой глутатионпероксидазы. В концентрации 1 мМ мексидол повышал активность данного фермента на 186,5% (р<0,05), а в концентрации 0,1 мМ — на 15,5% (р<0,05). Активность СОД также увеличивалась, но в меньшей степени: в концентрации мексидола 1 мМ — на 27,2% (р<0,05), а в концентрации 0,01 мМ — на 10,5% (р<0,05) (см. рис. 3).
Рис. 3. Влияние мексидола на активность антиоксидантных ферментов; n=6. |
Примечание. Здесь и на рис. 4: * - достоверные различия по сравнению с пробами, не содержащими мексидол, на уровне p<0,05. |
Мексидол достоверно не повлиял на активность nNOS во всех исследуемых концентрациях (рис. 4), но в диапазоне концентраций от 0,1 до 0,01 мМ ингибировал активность iNOS на 18,3 и 28,2% соответственно (р<0,05).
Рис. 4. Влияние мексидола на активность nNOS и iNOS; n=6. |
Обсуждение
В настоящее время глутамат признан основным возбуждающим нейромедиатором ЦНС [2, 5], а перевозбуждение глутаматных рецепторов, возникающее при многих патологиях нервной системы, оказывает основное поражающее действие на нейроны. Оно реализуется посредством массивного поступления ионов кальция внутрь клетки, что в свою очередь приводит к активации образования свободных радикалов и развитию окислительного стресса [14]. При этом активные формы кислорода образуются не только в дыхательной цепи. В настоящее время доказано, что при гипоксии нейронов происходит активация НАДФН
В нашем исследовании показано, что мексидол в конечной концентрации в растворе от 10 до 0,1 мМ снижал уровень МДА в гомогенатах мозга, подвергнутого воздействию L-глутамата. Учитывая, что ведущую роль в патогенезе глутаматной нейротоксичности играют свободнорадикальные реакции, данный эффект можно рассматривать как способность мексидола подавлять эксайтотоксичность глутамата.
При изучении влияния мексидола на узловые звенья данного процесса установлено, что мексидол достоверно подавлял как аскорбатзависимое — неферментативное, так и НАДФН
В проведенном исследовании мексидол в высоких концентрациях связывал супероксидный анион-радикал, но по этой способности он значительно уступал классическому антиоксиданту аскорбиновой кислоте. Мексидол не влиял на активность 1-изофермента глутатион-SH-трансферазы и каталазы, однако значительно повышал активность Se-зависимой глутатионпероксидазы. Считается, что утилизируя перекись водорода и органические перекиси, глутатионпероксидаза играет наибольшую роль в защите клеток от гипоксии [9]. Таким образом, данный эффект может лежать в основе выраженного антигипоксического действия изучаемого препарата. Также мексидол умеренно повышал активность СОД. Но, учитывая, что мексидол обладает прямым антисупероксидным действием, т.е. способен непосредственно связывать супероксидный анион-радикал, который является субстратом СОД, по-видимому, выявленное умеренное повышение активности СОД связано не со способностью препарата влиять на активность фермента, а с его прямым антирадикальным действием.
При изучении влияния мексидола на активность NOS выявлено, что изучаемый препарат не влиял на активность нейрональной, но умеренно подавлял активность индуцибельной изоформы. Так как при патологических состояниях повышается активность в основном индуцибельной изоформы (отсюда ее название), то данный эффект мексидола может играть существенную роль в повышении резистентности нейронов к гипоксии.
Таким образом, на основе проделанной работы можно заключить, что мексидол в экспериментах in vitro дозозависимо подавляет развитие глутамат-индуцируемой нейротоксичности, дозозависимо подавляет развитие аскорбатзависимого (неферментативного) и НАДФН