Мексидол (этилметилгидроксипиридина сукцинат) — оригинальный отечественный лекарственный препарат, обладающий выраженным антигипоксическим и антиоксидантным действием. На протяжении 20 лет клинического использования он доказал свою высокую нейропротективную, антигипоксическую, антиоксидантную, анксиолитическую и ноотропную активность [1].

Первоначально предполагалось, что антиоксидантная активность мексидола связана с наличием в его молекуле гидроксильной группы, способной связывать свободные радикалы, а антигипоксическое действие обусловлено присутствием остатка янтарной кислоты, обеспечивающего восстановление окислительного фосфорилирования, нарушенного в условиях недостатка кислорода [1, 2]. Однако в дальнейшем было показано, что мексидол способен также повышать активность антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы), увеличивать соотношение липид/белок в цитоплазматической мембране, оказывая модулирующее влияние на активность мембраносвязанных ферментов и рецепторных комплексов (ГАМК-бензодиазепиновый, ацетилхолиновый), подавлять развитие глутаматной эксайтотоксичности [1, 3].

За формирование долговременной адаптации к гипоксии отвечает HIF-1, транскипционный фактор. Известно, что увеличение уровня HIF-1 приводит к повышению экспрессии генов, которые обеспечивают адаптацию клетки к недостатку кислорода и стимулируют эритропоэз (гены эритропоэтина), ангиогенез (ген фактора роста эндотелия сосудов VEGF), ферменты гликолиза (ген альдолазы, лактатдегидрогеназы, фосфофруктокиназы, пируваткиназы и пр.). Кроме того, HIF-1 регулирует экспрессию генов, участвующих в обмене железа, регуляции сосудистого тонуса, клеточной пролиферации, апоптоза, липогенеза и др. [4].

Учитывая многообразие эффектов мексидола, можно предположить, что одним из возможных дополнительных механизмов действия препарата является его воздействие на α-субъединицу транскрипционного фактора HIF-1.

Цель настоящего исследования — изучение влияния мексидола на экспрессию HIF-1α в коре лобной доли больших полушарий головного мозга крыс при односторонней окклюзии общей сонной артерии.

Исследование выполнено на 64 половозрелых крысах-самцах линии Вистар (Wistar) массой 220—300 г. Работа с животными проводилась в соответствии с правилами лабораторной практики (приказ МЗ РФ № 199н от 01.04.16).

Все животные были распределены на 5 групп. Животным 1-й группы (норма, n=6) вводили дистиллированную воду 3 раза в день в течение 14 дней. Крысам 2-й группы (n=5) вводили мексидол per os в дозе 100 мг/кг массы 3 раза в день в течение 14 дней [5]. Животным 3-й группы (n=5) однократно внутрибрюшинно вводили мексидол в дозе 120 мг/кг массы [6]. Крысам 4-й группы (контроль окклюзии, n=24) в течение 14 дней вводили дистиллированную воду 3 раза в день, а затем моделировали окклюзию общей сонной артерии и продолжали вводить дистиллированную воду в том же режиме. В 5-ю группу вошли крысы (n=24), которым на протяжении 14 дней до и после окклюзии общей сонной артерии вводили мексидол per os в дозе 100 мг/кг массы 3 раза в день; 4-я и 5-я группы включали по 4 серии — 4 и 12 ч, 5 и 12 сут после окклюзии сонной артерии (6 животных на каждую временну´ю точку).

Окклюзию общей сонной артерии моделировали под эфирным наркозом. После вскрытия мягких тканей шеи животных выделяли правую общую сонную артерию и накладывали на нее лигатуру с последующим ушиванием раны. В конце эксперимента (через 30 мин после последнего введения мексидола или воды) животных эвтаназировали декапитацией под эфирным наркозом. Для оценки экспрессии HIF-1α и биохимических исследований забирали образцы коры лобной доли правого полушария головного мозга.

Экспрессию HIF-1α определяли иммуногистохимически. Образцы коры фиксировали в 10% растворе забуференного нейтрального формалина, обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации, просветляли ксилолом и заключали в парафин. Перед реакцией иммунного окрашивания производили демаскировку антигенов тканей нагреванием на водяной бане в 10 мМ цитратном буфере (рН 6,0). Эндогенную пероксидазу блокировали 3% раствором пероксида водорода. Затем срезы инкубировали с первичными антителами к HIF-1α (моноклональные антитела мыши HIF1α/HIF1 Alpha (aa432−528) (Unconjugated) (H1alpha 67), 50 мкл (LifeSpan LS-B110)) в разведении 1:50 по стандартной методике. Для иммунного окрашивания использовали полимерную систему детекции с пероксидазной меткой Novolink («Leica microsystems», Германия). Микропрепарат фотографировали с помощью цифровой камеры ТС-500 «ЛОМО» при увеличении в 400 раз.

В каждом гистологическом препарате оценивали 10 репрезентативных участков (10 фотографий). В дальнейшем изображения анализировали с помощью медицинской программы для анализа и обработки цифровых изображений ImageJ. Определяли общее количество HIF-1α-позитивных ядер в поле зрения. Дополнительно гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином.

В гомогенате лобной коры головного мозга крыс также определяли концентрацию ТБК-реактивных продуктов [7], уровень небелковых SH-групп [8], активность глутатионпероксидазы (G-per) [9] и активность глутатион-S-трансферазы (G-tr) [10].

Полученные результаты обрабатывали с помощью программ Statistica 7.0 «StatSoft» и SPSS Statistics ver. 20 («IBM»). Для оценки статистической значимости различий между показателями использовали критерий Крускала—Уоллиса. Попарные сравнения выполняли с помощью критерия Манна—Уитни. Для анализа корреляции между экспрессией HIF-1α и показателями свободнорадикального статуса ткани головного мозга использовали коэффициент корреляции Спирмена. Результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей.

В коре лобной доли головного мозга крыс HIF-1α-позитивно окрашивались ядра клеток. В исследовании не проводили дифференцировку клеток на нейроны и клетки глии, а подсчитывали общее число иммуннопозитивных ядер клеток в 4-м слое коры лобной доли головного мозга.

Однократное внутрибрюшинное введение мексидола и курсовое пероральное использование тестируемого препарата в течение 14 дней не влияло на количество HIF-1α-позитивных ядер, а также на концентрацию ТБК-реактивных продуктов, уровень небелковых SH-групп, активность G-tr и G-per в гомогенате коры головного мозга крыс. Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение мексидола интактным животным, не находящимся в условиях гипоксии, не влияет на экспрессию HIF-1α и оксидативный статус клеток коры головного мозга.

При моделировании окклюзии общей сонной артерии через 4 ч от момента ее пережатия в клетках лобной коры головного мозга крыс отмечалось увеличение количества HIF-1α-позитивных ядер на 71,2% (p=0,052) по сравнению с показателем нормы. В более поздние сроки эксперимента количество HIF-1α-позитивных ядер клеток головного мозга приходило в норму и статистически значимо от данных интактных крыс не отличалось (см. рисунок).

Применение мексидола в течение 14 дней до и после моделирования окклюзии общей сонной артерии приводило к увеличению количества HIF-1α-позитивных ядер клеток лобной доли коры головного мозга крыс через 4 ч после окклюзии на 49,0% (p=0,032), через 12 ч — на 69,2% (р=0,016), в остальные сроки исследования достоверно не отличалось от показателей нормы (животные 1-й группы). При введении мексидола на 5-е сутки окклюзии количество HIF-1α-позитивных ядер на 28,2% (p=0,017) превышало данный показатель животных группы контроля окклюзии (4-я группа) (см. рисунок).

Концентрация ТБК-реактивных продуктов по сравнению с показателями нормы (животные 1-й группы) увеличивалась в гомогенате коры через 4 ч от момента окклюзии на 30,4% (р=0,052), приходила в норму через 12 ч от момента пережатия артерии и вновь повышалась на 5-е и 12-е сутки на 50,8% (р=0,004) и 60,6% (р=0,002) соответственно. Концентрация небелковых SH-групп в гомогенате головного мозга снижалась по сравнению с показателями нормы через 4 ч и на 5-е сутки окклюзии на 28,1% (р=0,017) и 39,8% (р=0,004) соответственно. Активность G-per снижалась через 4 ч пережатия сонной артерии на 18,9% (р=0,065), через 12 ч — на 22,9%, активность G-tr повышалась на 35,8% (р=0,009) через 4 ч от момента окклюзии по отношению к уровню нормы (см. таблицу).

Применение мексидола до и после моделирования окклюзии общей сонной артерии с профилактической и лечебной целями оказывало нейропротективное действие, о чем свидетельствует снижение выраженности окислительного стресса в гомогенате коры лобной доли головного мозга крыс. На фоне мексидола происходила нормализация уровня ТБК-реактивных продуктов и небелковых SH-групп, на протяжении всего эксперимента эти показатели статистически значимо не отличались от значений у нормы (животные 1-й группы). Активность G-per по сравнению с нормой снижалась через 12 ч и на 5-е сутки после пережатия общей сонной артерии на 26,8% (р=0,004) и 19,8% (р=0,03) соответственно, активность G-tr уменьшалась через 12 ч на 17,6% (р=0,052). Концентрация ТБК-реактивных продуктов у животных, получавших мексидол, была достоверно ниже значений контроля окклюзии (4-я группа) на 5-е и 12-е сутки на 31,9% (р=0,082) и 24,3% (р=0,002) соответственно. Уровень небелковых SH-групп у подопытных животных превышал значения контроля окклюзии через 4 ч на 81,2% (р=0,032), через 5 сут — на 72,8% (р=0,004) и через 12 сут — на 49,7% (р=0,004). Активность G-per у крыс, получавших мексидол, была ниже показателей 4-й группы на 5-е сутки окклюзии на 22,2% (p=0,016), активность G-tr — через 4 ч после пережатия артерии на 27,1% (р=0,03) (см. таблицу).

У животных группы контроля окклюзии наблюдалась прямо пропорциональная зависимость между количеством HIF-1α-позитивных ядер клеток головного мозга и концентрацией ТБК-реактивных продуктов Rs=0,48 (p=0,043). У животных, получавших мексидол на фоне окклюзии общей сонной артерии, наблюдалась прямо пропорциональная зависимость между количеством HIF-1α-позитивных ядер клеток головного мозга и уровнем небелковых SH-групп Rs=0,506 (p=0,023).

HIF-1 — транскрипционный фактор, ответственный за формирование основы долговременной адаптации к гипоксии. HIF-1 состоит из двух субъединиц α и β. β-Субъединица экспрессируется постоянно, экспрессия α-субъединицы контролируется уровнем кислорода. В присутствии кислорода и 2-оксоглутарата HIF-1α гидроксилируется, ацетилируется, перемещается в протеосомы и разрушается [11]. При стабилизации субъединицы HIF-1α в условиях гипоксии она связывается с HIF-1β. Образовавшийся в результате этого транскрипционный белок HIF-1 в ядре клетки соединяется с особыми последовательностями ДНК в генах, экспрессия которых индуцируется гипоксией [4].

В настоящем исследовании установлено, что однократное внутрибрюшинное и курсовое (в течение 14 дней) пероральное введение мексидола не изменяет количество HIF-1α-позитивных ядер в коре лобной доли больших полушарий головного мозга интактных (не подвергавшихся патологическим воздействиям) крыс. Полученные результаты свидетельствуют, что мексидол не влияет на экспрессию HIF-1α у интактных животных. Курсовое и однократное введение мексидола животным, не подвергшимся патологическим воздействиям, также не оказало существенного влияния на свободнорадикальный статус клеток коры лобной доли больших полушарий головного мозга крыс — концентрацию ТБК-реактивных продуктов, уровень небелковых SH-групп, активность G-tr и G-per.

При моделировании окклюзии общей сонной артерии через 4 ч от момента ее пережатия в лобной коре головного мозга крыс отмечалось увеличение количества HIF-1α-позитивных ядер клеток по сравнению с показателями нормы. Полученные результаты согласуются с данными литературы. В исследовании G. Kalesnykas и соавт. [12] показано, что экспрессия HIF-1α увеличивается в нейронах крыс после окклюзии общей сонной артерии. Авторы предположили, что снижение кровотока и ишемия приводят к клеточной гипоксии, что в свою очередь вызывает стабилизацию HIF-1α. Аналогичные по дизайну исследования показали, что уровень HIF-1α повышается сразу после гипоксического воздействия, достигая максимума через 3—4 ч и сохраняется до 24 ч после инсульта [13, 14].

Применение мексидола в течение 14 дней до и после моделирования окклюзии общей сонной артерии приводило к повышению количества HIF-1α-позитивных ядер клеток коры лобной доли головного мозга крыс через 4 и 12 ч после окклюзии по сравнению с показателями нормы. На 5-е сутки окклюзии при введении мексидола количество HIF-1α-позитивных ядер превышало таковой показатель животных группы контроля окклюзии.

Мексидол способен повысить экспрессию HIF-1α в условиях гипоксии за счет нескольких механизмов. Сукцинат, входящий в состав мексидола, является агонистом сукцинатзависимого рецептора (GPR-91), стимулирующего митоген-активированную протеинкиназу (MAPK), которая фосфорилирует HIF-1α и таким образом стабилизирует ее молекулу [15]. Кроме того, предполагается, что сукцинат непосредственно может ингибировать HIF-пролилгидроксилазу в цитозоле, таким образом стабилизируя субъединицу HIF-1 [15].

Показано, что дыхательная цепь митохондрий вовлечена в регуляцию экспрессии HIF-1α. Блокада комплекса I электронно-транспортной цепи приводит к практически полному устранению гипоксической индукции экспрессии HIF-1. Сукцинат, являясь субстратом комплекса II, может восстанавливать работу дыхательной цепи и таким образом способствовать индукции экспрессии HIF-1 [16].

Моделирование окклюзии общей сонной артерии сопровождалось развитием окислительного стресса, о чем свидетельствовало повышение концентрации ТБК-реактивных продуктов, уменьшение уровня SH-групп и активности G-per в ткани головного мозга. Прямо пропорциональная зависимость между количеством HIF-1α-позитивных ядер и концентрацией ТБК-реактивных продуктов подтверждает взаимосвязь окислительного стресса и ишемии.

Повышенная экспрессии HIF-1α при введении мексидола на фоне односторонней окклюзии общей сонной артерии сопровождалась антиоксидантным действием изучаемого препарата. Концентрация ТБК-реактивных продуктов у животных, получавших мексидол, была достоверно ниже значений контроля окклюзии на 5-е и 12-е сутки, уровень небелковых SH-групп превышал значения контроля окклюзии через 4 ч, 5 и 12 сут. Наблюдалась прямо пропорциональная зависимость между количеством HIF-1α-позитивных ядер клеток и уровнем небелковых SH-групп, отражающим концентрацию восстановленного глутатиона. Глутатион играет важную роль в поддержании внутриклеточного редокс-гомеостаза, необходимого для экспрессии ряда транскрипционных факторов и развития репаративных процессов. Видимо, установленная корреляционная зависимость показывает, что экспрессия HIF-1α при введении мексидола на фоне окклюзии общей сонной артерии связана не с выраженностью окислительного стресса (отражением которого является уровень ТБК-реактивных продуктов), а с активацией репаративных процессов.

Таким образом, в настоящем исследовании установлено, что мексидол увеличивает экспрессию HIF-1α в клетках коры лобной доли больших полушарий головного мозга не в условиях нормы, а при односторонней окклюзии общей сонной артерии, что, вероятно, является одним из механизмов, обеспечивающих репарацию и переносимость гипоксии. Однократное внутрибрюшинное введение мексидола в дозе 120 мг/кг массы и его курсовое пероральное введение в дозе 100 мг/кг массы 3 раза в день в течение 14 дней не влияет на экспрессию транскрипционного фактора HIF-1α в клетках коры лобной доли головного мозга крыс. При односторонней окклюзии общей сонной артерии происходит повышение экспрессии HIF-1α в клетках коры лобной доли головного мозга крыс через 4 ч от момента пережатия артерии по сравнению с показателями нормы. Пероральное введение мексидола в дозе 100 мг/кг массы 3 раза в день в течение 14 дней до и после моделирования односторонней окклюзии общей сонной артерии приводит к повышению экспрессии HIF-1α в клетках коры лобной доли головного мозга крыс через 4 и 12 ч после окклюзии по сравнению с показателями нормы, на 5-е сутки по сравнению со значениями контроля окклюзии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.