Известно, что патогенез шизофрении до конца не изучен. Одной из нейрохимических концепций патогенеза этого заболевания является глутаматергическая гипотеза, предложенная более 30 лет назад на основании данных об изменении концентрации глутамата, активности и концентрации его рецепторов и переносчиков в мозге больных шизофренией по сравнению с психически здоровыми [1—3].

Глутамат участвует в синаптической передаче, влияет на процессы дифференцировки и роста нейронов, вовлечен в синаптическую пластичность, процессы обучения и формирования памяти. Проведение глутаматного нейромедиаторного сигнала зависит не только от количества и активности рецепторов и переносчиков глутамата в нейронах и глиальных клетках, но и эффективности работы ферментов, метаболизирующих этот нейромедиатор и осуществляющих функционирование глутамат/глутаминового цикла между нейронами и глией [4]. Концентрация глутамата в синапсах определяется динамическим равновесием процессов его транспорта, связывания со специфическими рецепторами и ферментами его метаболизма. При патологии концентрация глутамата может изменяться вследствие нарушения его метаболизма.

Глутаматдегидрогеназа (ГДГ, КФ 1.4.1.3) является одним из ключевых ферментов метаболизма глутамата. ГДГ катализирует обратимое окислительное дезаминирование L-глутамата в α-оксоглутарат, используя НАД/НАДФ в качестве коферментов:

L-глутамат+Н₂О+НАД (Ф)⁺↔2-оксоглутарат+NН₄⁺+ НАД (Ф)Н+Н⁺.

Нативный фермент ГДГ имеет олигомерную структуру и состоит из шести идентичных субъединиц (два тримера, образующих гексамер), каждая из субъединиц содержит ~500 аминокислотных остатков [5]. Ферментативная активность ГДГ обеспечивается тремя основными функциональными областями: НАД (Ф)⁺связывающим, глутаматсвязывающим и регуляторным доменами. Регуляторный домен содержит «спиральный стержень» и «антенну». В функциональном тримере «антенны» соседних субъединиц переплетаются и аллостерически взаимодействуют, однако точные механизмы этого взаимодействия до конца не ясны [5, 6].

По данным литературы [7], у человека и высших приматов существуют изоферменты ГДГ, кодирующиеся двумя генами. Ген GLUD1, кодирующий hGDH1, содержит интроны и расположен на хромосоме 10, он экспрессируется во всех тканях. Ген GLUD2, кодирующий hGDH2, не содержит интронов и находится на Х-хромосоме, он экспрессируется в нервной ткани, почках и яичках [8, 9]. Соотношение количества двух изоферментов различается в разных типах тканей. Например, в печени присутствует только hGDH1, в клетках Сертоли яичек и кортикальных нейронах — только hGDH2, а астроциты содержат сопоставимые количества обоих изоферментов [9]. Внутриклеточное распределение изоферментов ГДГ также различается: оба присутствуют в митохондриях, но только hGDH1 связана с ядерной мембраной астро- и олигодендроцитов [9].

Помимо изоферментов, кодируемых разными генами, альтернативный сплайсинг увеличивает число форм ГДГ, синтезирующихся с РНК, транскрибируемых с одного и того же гена. В организме человека обнаружены четыре разных вида РНК, с которых считываются четыре формы ГДГ, различающиеся молекулярными массами и изоэлектрическими точками [10], и все эти варианты кодируются двумя генами ГДГ [8]. Так, для гена GLUD1 человека известны три транскрипта, кодирующие три белка, в то время как безинтронный GLUD2 отвечает за производство только одного белка — hGDH2.

Важно, что формы ГДГ представлены как различными изоферментами, так и изоформами: изоферменты являются продуктами различных генов, в то время как изоформы кодируются одним геном и возникают в результате альтернативного сплайсинга мРНК или посттрансляционных модификаций, однако в литературе [11] это различие часто стирается.

Исследование разнообразия форм ГДГ в мозге представляет особый интерес, так как дисфункции глутаматергических путей играют роль в развитии различных форм клинической патологии — болезни Альцгеймера [12], болезни Гентингтона [6, 10, 13], инсульта, эпилепсии, шизофрении [14, 15] и депрессии [16].

В нашей лаборатории были проведены [17] выделение и описание трех форм ГДГ из мозга человека: двух растворимых и одной связанной с мембранами. Они могут либо представлять собой продукты разных генов, либо синтезироваться с разных видов мРНК, образованной путем альтернативного сплайсинга, или возникать вследствие посттрансляционных модификаций. Ранее при сравнении количества этих форм ГДГ в аутопсийных образцах мозга (лобная кора, хвостатое ядро и кора мозжечка) от больных шизофренией и психически здоровых мы обнаружили [15] достоверные различия.

Для настоящего исследования были выбраны структуры мозга, вовлеченные в процессы, нарушение которых приводит к симптомам, характерным для психотических состояний. Согласно данным литературы [18], в лобной и лимбической коре при шизофрении происходят значительные метаболические нарушения, в том числе глутаматной системы. Так, в дорсолатеральной, префронтальной и передней лимбической коре при шизофрении изменяется концентрация субъединиц глутаматных рецепторов NMDA типа и ассоциированных с ними белков [19].

Лобная (особенно префронтальная) кора играет важную роль в реализации высших когнитивных функций: планирование и принятие решений, установление логических связей между явлениями и теоретическими положениями, вызов воспоминаний из кратковременной памяти и обеспечение одновременного решения множества задач. Именно эти высшие когнитивные функции нарушены при шизофрении. Лимбическая кора — это область головного мозга, отвечающая за эмоции, мотивации и память; в последнее время она становится предметом многих нейрокогнитивных исследований. Морфометрический анализ [20] выявил уменьшение размера передней лимбической коры у пациентов с шизофренией. В передней лимбической коре выявлены [21] изменения в пространственной организации олигодендроцитов и пирамидных нейронов у больных шизофренией по сравнению с контролем.

Роль связей префронтальной коры с мозжечком в процессе развития когнитивных функций и участие мозжечка в когнитивном функционировании подробно рассмотрены в обзоре A. Diamond [22]. По данным анализа изображений мозга и нейроанатомических и физиологических исследований [23], при шизофрении и шизотипическом расстройстве личности наблюдаются дисфункции мозжечка, что согласуется с современными представлениями о его значении для когнитивного функционирования. Пониженный объем мозжечка по сравнению с психически здоровыми лицами обнаружен [24, 25] как у пациентов с первым психотическим приступом, так и больных шизофренией, не принимавших нейролептики, что свидетельствует о независимости этого явления от терапии нейролептиками.

Цель настоящей работы — оценка уровня ферментативной активности ГДГ и количества ее иммунореактивных форм в префронтальной лимбической коре и коре мозжечка в контрольной группе здоровых и у больных шизофренией.

Использовали образцы аутопсийного мозга из коллекции лаборатории нейрохимии (зав. — проф. Г. Ш. Бурбаева) Научного центра психического здоровья, составленной на базе Московской психиатрической клинической больницы № 1 им. Н.А. Алексеева.

У 8 госпитализированных пациентов с хроническим течением заболевания шизофрения была диагностирована по критериям МКБ-10 при жизни.

В контрольную группу (9 случаев) включали образцы аутопсийного мозга, полученные из московских больниц от лиц без психических, неврологических и наркологических расстройств.

В обеих группах причинами смерти были острая сердечно-сосудистая недостаточность или тромбоэмболия легочной артерии.

Образцы коры мозга — префронтальной коры (поле 10), передней и задней лимбической коры (поля 24 и 23) и мозжечка выделяли по картам полей Бродмана при температуре +4 °С, переносили в криопробирки, замораживали в жидком азоте и хранили при –80 °С, избегая циклов замораживания и оттаивания. Данные о возрасте, числе обследованных и длительности постмортального интервала (ПМИ) представлены в таблице.

Приготовление экстрактов ткани мозга для определения активности и количества иммунореактивных форм ГДГ. Образцы ткани мозга (200 мг) гомогенизировали в гомогенизаторе Potter (стекло/тефлон) в 1 мл буфера 50 мM Трис-HCl, с 1,4 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 7,5 при +4 °С. Гомогенат центрифугировали (1000 g, 15 мин) при +4 °С для удаления осадка, содержавшего ядерные фрагменты и осколки неразрушенных клеток. Супернатант центрифугировали (60 000 g, 1 ч) при +4 °С, далее использовали супернатант (фракция легкорастворимых белков) для определения активности ГДГ и количества иммунореактивных форм ГДГ I и II. Осадок (мембранная фракция) суспендировали в 1 мл 50 мМ Трис-HCl, pH 6,8 и центрифугировали (60 000 g, 1 ч) при +4 °С, полученный осадок ресуспендировали в 100 мкл 50 мМ Трис-HCl, pH 6,8 и использовали для определения количества иммунореактивной формы ГДГ III.

Концентрацию белка определяли спектрофотометрически методом Лоури с использованием набора реагентов Bio-Rad DC Protein Assay (США) и бычьего сывороточного альбумина в качестве белкового стандарта.

Ферментативную активность ГДГ в экстрактах мозга человека измеряли по методике L. Fahien и соавт. [26] в соответствии с химическим уравнением:

2-оксоглутарат+NН₄⁺+НАДН+Н⁺→L-глутамат+ Н₂О+НАД⁺.

Определяли убыль НАДН спектрофотометрически по уменьшению абсорбции при длине волны 340 нм в реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 2,6 мМ ЭДТА, 100 мМ хлорида аммония, 0,1 мМ НАДН и 1 мМ АДФ. Реакцию запускали добавлением 2-оксоглутарата до конечной концентрации 10 мМ. Для расчета ферментативной активности было принято значение коэффициента молярной экстинкции НАДН 6,22·10^–3 л·моль^–1·cм^–1.

Определение количества иммунореактивных форм ГДГ проводили с использованием электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях и ECL-Вестерн-иммуноблоттинга. К аликвоте супернатанта добавляли буфер для образцов (10% n-додецилсульфат натрия, 10% β-меркаптоэтанол, 0,05% бромфеноловый синий, 62,5 мМ Трис-HCl, pH 6,8) в количестве 10% от объема образца, нагревали в течение 5 мин при 95 °C и проводили одномерный электрофорез в 10% ПААГ в денатурирующих условиях с последующим ECL-Вестерн-иммуноблоттингом, используя полусухой метод переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану. Затем производили засветку фотопленок с реагентами ECL («Amersham Biosciences», «GE Healthcare Life Sciences», Швеция).

Определение количества форм ГДГ I, II и III проводили с помощью кроличьих антисывороток, полученных в лаборатории нейрохимии Научного центра психического здоровья [15], и вторичных ослиных антител к IgG кролика — F (ab’)2-fragment NA9340 («Amersham Biosciences», Швеция), конъюгированных с пероксидазой хрена, в рабочем разведении 1:10 000. Специфичность антисывороток была оценена ECL-Вестерн-иммуноблоттингом с использованием очищенных образцов белков ГДГ, выделенных из мозга человека. Так, кроличья антисыворотка к ГДГ I и II (использована в рабочем разведении 1:15 000) окрашивала две полосы, соответствующие ГДГI (58±0,5 кДа) и ГДГ II (56±0,5 кДа) (рис. 1, а);

На каждый гель было нанесено 5, 10 и 20 мкг внутреннего стандарта, белковые маркеры молекулярной массы, восемь образцов от больных шизофренией и 9 — контрольной группы, содержащих по 10 мкг белка в пробе (т.е. все исследуемые образцы были уравнены по количеству общего белка, вносимого в лунку геля). В качестве внутреннего стандарта использовали образцы (поле 1—3 по Бродману) мозга контрольного случая (мужчина, 70 лет).

Количество иммунореактивных форм ГДГ I, II и III после сканирования фотопленок и количественного анализа полученных изображений на приборе KODAK Image Station IS2000R (США) выражали в относительных единицах (отн. ед.). Для этого значение интенсивности засветки фотопленки каждого белкового пятна было разделено на величину интенсивности засветки белкового пятна внутреннего стандарта (10 мкг белка внутреннего стандарта) и выражено в процентах (отн. ед.). На диаграммах представлены средние значения по результатам трех опытов.

Для статистической обработки данных использовали программу Statistica 6.0 («Statsoft»), модуль — непараметрический анализ (поиск статистически значимых различий между группами — U-тест Манна—Уитни, корреляционный анализ — поиск ранговых корреляций и определение коэффициента корреляции Спирмена).

Тест Манна—Уитни показал, что анализируемые группы достоверно не различались по возрасту и времени, прошедшему от момента смерти до замораживания образцов ткани мозга (ПМИ) (р>0,05), а уровни исследуемых форм ГДГ не коррелировали с возрастом в обеих группах (корреляции по Спирмену недостоверны, p>0,05).

Определение ферментативной активности проводили в экстрактах ткани мозга, приготовленных без детергентов, во фракции «легкорастворимых» белков, в которой присутствуют ГДГ I и II, поэтому была определена их суммарная ферментативная активность. При измерении ферментативной активности ГДГ в экстрактах указанных структур мозга установили, что у больных шизофренией по сравнению с контролем ферментативная активность ГДГ достоверно повышена в коре: префронтальной — поле 10 (p<0,004), задней лимбической — поле 23 (p<0,05) и мозжечка (p<0,002), а в передней лимбической коре — поле 24 не изменена. Результаты определения ферментативной активности ГДГ в исследованных образцах представлены на рис. 2.

Для сравнения количества трех форм ГДГ в тех же экстрактах образцов мозга в работе использовали ECL-иммуноблоттинг. Этот полуколичественный метод позволяет увидеть межгрупповые достоверные различия. На рис. 1 приведен пример засветки рентгеновской пленки после ECL-иммуноблоттинга, где соответствующими специфическими антисыворотками выявлены иммунореактивные ГДГ I и II (молекулярная масса субъединицы ГДГ I 58 кДа, ГДГ II 56 кДа, см. рис. 1, а) в экстрактах задней лимбической коры (поле 23) и ГДГ III (масса субъединицы 56 кДа, см. рис. 1, б) в образцах префронтальной коры (поле 10). В случае окраски антисывороткой к ГДГ III наблюдалось неспецифическое взаимодействие с зоной белка с молекулярной массой 66 кДа (см. рис. 1, б). Следует отметить, что не только полученная в нашей лаборатории поликлональная антисыворотка к ГДГ III, но и антисыворотка фирмы «Biogenesis» (Cat No. 4670—5488, данные не показаны) выявляет дополнительную белковую полосу 66 кДа. Очевидно, ГДГ и 66 кДа белок имеют эпитоп (ы) сходной структуры. При этом 66 кДа белок не обладал ферментативной активностью ГДГ и далее не исследовался [17].

Как видно на рис. 1, а, интенсивность засветки полос, соответствующих ГДГ I и II, в контрольных случаях значительно ниже, чем в образцах от больных шизофренией (соответственно дорожки 1—4 и 5—8). Интенсивность засветки зоны, соответствующей ГДГ III, в контроле тоже значительно ниже, чем у больных шизофренией (соответственно дорожки 1—4 и 5—8, см. рис. 1, б).

Проведенный корреляционный анализ показал, что повышение количества иммунореактивных форм ГДГ при шизофрении по сравнению с контролем не связано с возрастом, ПМИ или хлорпромазиновым эквивалентом, поэтому мы считаем, что наблюдаемый феномен связан именно с данной патологией. Мы не знаем причин этого явления, хотя полагаем, что последствия достоверного повышения количества фермента, связывающего глутаматный и энергетический метаболизм, могут быть значительными.

Формы ГДГ, описанные в настоящем исследовании, не были секвенированы и не могут быть соотнесены с hGDH1 и hGDH2 — продуктами генов GLUD1 и GLUD2. По данным, полученным с использованием специфических антител к hGDH2 [27], количество hGDH2 в мозге человека существенно ниже, чем hGDH1, что делает обнаружение hGDH2 проблематичным. При выделении и очистке разных форм ГДГ из ткани коры мозга человека без психической патологии мы не отмечали существенного преобладания какой-либо одной формы ГДГ над другими, хотя форма ГДГ II присутствовала в несколько меньшем количестве, чем ГДГ I (рис. 3).

Ранее предполагалось, что ГДГ у всех эукариот локализована исключительно в митохондриях, и этот фермент рассматривался как маркер митохондрий [11]. В нашем исследовании имеются две легко солюбилизируемые формы ГДГ I и II, которые, вероятно, не локализованы в митохондриях. В то же время ГДГ III может иметь митохондриальную локализацию, поскольку ассоциирована с мембранной фракцией. Наличие ассоциированных с мембранами форм ГДГ было показано различными исследователями [6, 11, 28]. ГДГ были обнаружены [29] в плазматической мембране олигодендроцитов с использованием иммуноцитохимических методов.

Результаты определения относительного количества иммунореактивных форм ГДГ в префронтальной коре (поле 10) лиц контрольной группы и пациентов с шизофренией представлены на рис. 3, а. У больных шизофренией по сравнению с контролем было выявлено значительное достоверное повышение уровня иммунореактивных ГДГ I, II и III (U-тест Манна—Уитни, р<0,008, р<0,003 и р<0,0001 соответственно).

Результаты определения относительного количества иммунореактивных форм ГДГ в задней лимбической коре (поле 23) в контроле и при шизофрении представлены на рис. 3, б. У больных шизофренией по сравнению с контролем было выявлено значительное достоверное повышение уровня иммунореактивных ГДГ I, II и III (р<0,004, <0,001 и <0,02 соответственно).

Результаты определения относительного количества ГДГ I, II и III в передней лимбической коре (поле 24) в контрольной группе и при шизофрении представлены на рис. 3, в. Достоверных изменений уровня иммунореактивных форм ГДГ у больных шизофренией по сравнению с контролем выявлено не было.

Результаты определения относительного количества иммунореактивных форм ГДГ в коре мозжечка лиц контрольной группы и пациентов с шизофренией представлены на рис. 3, г. У больных шизофренией по сравнению с контролем было выявлено значительное достоверное повышение уровня иммунореактивных ГДГ II и III (р<0,02 и <0,001 соответственно), а уровень ГДГ I не изменен.

Исследование активности и количества изоформ/изоферментов ГДГ при шизофрении остается одной из важных проблем, которые необходимо решать в дальнейшем.

ГДГ представлена как различными изоферментами (продукты различных генов), так и изоформами (кодируются одним геном и образуются в результате альтернативного сплайсинга мРНК или посттрансляционных модификаций). Наличие двух изоферментов указывает на возможность их раздельной локализации, регуляции и функций. В коре головного мозга hGDH1 локализуется преимущественно в митохондриях астроцитов и ядерной мембране олигодендроцитов и их предшественников, а hGDH2 — в митохондриях крупных корковых нейронов и астроцитов, а также ядерной мембране мелких корковых нейронов.

Антипсихотические препараты ингибируют активность ГДГ в лабораторных условиях [30], при этом изофермент hGDH2 заметно более чувствителен к препаратам (IC50=26 мкМ для галоперидола и 31 мкМ для перфеназина) по сравнению с hGDH1 (IC50=122 мкМ и 194 мкМ соответственно) [7]. Высокая чувствительность hGDH2 к воздействию антипсихотических препаратов предполагает модуляцию глутаматергической передачи сигналов путем ингибирования hGDH2 [13].

Добавим, что обнаружение форм ГДГ I и II в тромбоцитах крови позволило провести сравнительные исследования их количества в группе больных с эндогенными психозами и контроле. Было обнаружено [31], что у больных количество форм ГДГ I и II может служить целям предикции эффективности антипсихотической терапии.

Для сравнительных нейрохимических исследований в норме и при патологии определение ферментативной активности ГДГ в экстрактах белков из ткани мозга человека представляется недостаточно информативным. Метод иммуноблоттинга со специфическими антителами позволяет оценить относительные количества различных изоформ/изоферментов ГДГ. Данные, полученные в настоящей работе с помощью иммуноблоттинга, показывают, что изменение количества иммунореактивных форм ГДГ в различных областях мозга при шизофрении по сравнению с контрольными случаями происходит по-разному в разных структурах мозга и свидетельствует о сложной картине участия этого фермента глутаматного метаболизма в патологических процессах при шизофрении. Антипсихотические препараты, связывая дофаминовые рецепторы, позволяют контролировать продуктивную (позитивную) симптоматику шизофрении, и недавно обнаруженная способность этих лекарств влиять на активность ГДГ может представлять новый альтернативный механизм воздействия, направленный на глутаматергические механизмы мозга. Эти исследования могут обозначить новую стратегию для терапевтического вмешательства при психозах [13].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.