Мексидол (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат) является оригинальным отечественным препаратом с широким спектром таких фармакологических эффектов, как антиоксидантный, противогипоксический, мембранотропный, нейропротективный и др. Терапевтический эффект препарата наиболее выражен при нейродегенеративных и сосудистых патологиях головного мозга. Мексидол применяется при всех нозологиях, патогенез которых включает ишемию и гипоксию, но преимущественно при ишемии наиболее энергопотребляющих органов и систем организма — нервной и сердечно-сосудистой [1].

Молекула мексидола состоит из двух частей: 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина и остатка янтарной кислоты. Первая часть обладает прямой антиоксидантной активностью за счет подвижного атома водорода гидроксильной группы. Вторая проявляет выраженные противогипоксические свойства, поддерживая в условиях гипоксии работоспособность сукцинатоксидазного ФАД-зависимого звена цикла Кребса [2, 3]. Однако впоследствии было показано [1, 4], что мексидол также повышает активность ряда антиоксидантных ферментов, увеличивает соотношение липида и белка в цитоплазматической мембране, подавляет развитие глутаматной эксайтотоксичности, усиливает экспрессию транскрипционного фактора HIF1.

На сегодняшний день выявленные многочисленные эффекты мексидола не могут быть объяснены лишь химическими особенностями его структуры.

NF-E2-related factor 2 (Nrf2) — редокс-чувствительный транскрипционный фактор, который реагирует на изменение соотношения восстановленных и окисленных SH-групп в белках. Его экспрессия повышается при развитии окислительного стресса и направлена на защиту клетки от воздействия свободных радикалов [5]. Известно, что выключение гена, кодирующего Nrf2 в организме мышей, не только блокирует усиление работы генов защитных белков в условиях окислительного стресса, но также приводит к падению уровня транскрипции ряда генов в условиях нормы. Таким образом, Nrf2 участвует в поддержании базального уровня транскрипции некоторых из своих генов-мишеней [6].

Цель настоящего исследования — изучение влияния мексидола на экспрессию Nrf2 в коре лобной доли больших полушарий головного мозга крыс в норме и при односторонней окклюзии общей сонной артерии.

Исследование было выполнено на 64 половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 220—300 г, которые были распределены в 5 групп. Работа с животными осуществлялась согласно правилам лабораторной практики (приказ Минздрава России № 199н от 01.04.16).

Животные 1-й группы (n=6) получали дистиллированную воду перорально 3 раза в день в течение 14 сут (норма). Крысам 2-й группы (n=5) вводили мексидол в форме суспензии на дистиллированной воде перорально в расчете 100 мг на 1 кг массы 3 раза в день в течение 14 сут [7]. В 3-й группе (n=5) мексидол вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 120 мг/кг [8]. Крысам 4-й группы (n=24) вводили дистиллированную воду 3 раза в день в течение 14 сут, а затем моделировали окклюзию общей сонной артерии и продолжали вводить дистиллированную воду в том же режиме до конца эксперимента (группа контроля окклюзии). Животные 5-й группы (n=24) на протяжении 14 сут до окклюзии общей сонной артерии и после окклюзии до конца эксперимента получали мексидол перорально в дозе 100 мг/кг 3 раза в день (группа мексидол). Обследование 4-й и 5-й групп включало 4 серии — через 4, 12 ч и на 5-е и 12-е сутки после моделирования патологии (по 6 животных на каждую временну´ю точку).

Окклюзию общей сонной артерии моделировали под эфирным наркозом. Производили вскрытие кожи и мягких тканей шеи животных, выделяли правую общую сонную артерию и накладывали на нее лигатуру с последующим послойным ушиванием раны. В конце эксперимента животные подвергались эвтаназии декапитацией под эфирным наркозом. Для оценки экспрессии Nrf2 и биохимических исследований забирали образцы коры лобной доли головного мозга.

Экспрессию Nrf2 определяли иммуногистохимическим методом. Образцы коры фиксировали в 10% растворе забуференного нейтрального формалина, обезвоживали растворами этилового спирта возрастающей концентрации, просветляли ксилолом и заключали в парафин. Далее производили демаскировку антигенов тканей путем нагревания в 10-мМ цитратном буфере (рН 6,0) на водяной бане. Эндогенную пероксидазу блокировали 3% раствором перекиси водорода. Затем срезы инкубировали с первичными антителами к Nrf2 (поликлональные антитела кролика к Nrf2, 100 мкг, Biorbyt orb11165) в разведении 1:50 по стандартной методике. Для иммунного окрашивания использовали полимерную систему детекции с пероксидазной меткой Novolink («Leica microsystems», Германия). Микропрепараты фотографировали с помощью цифровой камеры ЛОМО ТС-500 (ув. 400). Оценивали 10 репрезентативных участков (10 фотографий) в каждом гистологическом препарате. Изображения анализировали с помощью медицинской программы обработки цифровых изображений ImageJ. Определяли общее количество Nrf2-позитивных ядер в поле зрения и относительную площадь ядер в поле зрения. Дополнительно гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином.

Выраженность окислительного стресса в гомогенате коры головного мозга крыс анализировали по концентрации конечных продуктов пероксидации, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-реактивных продуктов) [8], уровню небелковых сульфгидрильных (SH)-групп — субстратов свободнорадикального окисления [9], активности антиоксидантных ферментов — глутатионпероксидазы (G-per) [10] и глутатион-S-трансферазы (G-tr) [11]. Повышение концентрации ТБК-реактивных продуктов, снижение содержания сульфгидрильных групп и активности G-per и G-tr является свидетельством развития окислительного стресса.

Полученные результаты обрабатывали с помощью программ Statistica 7.0 («StatSoft», США) и SPSS Statistics ver. 20 (IBM, США). Для оценки статистической значимости различий между показателями использовали критерий Крускела—Уоллиса. Попарные сравнения выполняли с помощью критерия Манна—Уитни. Для анализа корреляции между экспрессией Nrf2 и показателями свободнорадикального статуса ткани головного мозга животных использовали коэффициент корреляции Спирмена (r). Результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Me [Q₁; Q₃]).

В коре лобной доли головного мозга крыс Nrf2-позитивно окрашивались ядра клеток и гематоэнцефалический барьер. В исследовании не проводили дифференцировку клеток на нейроны и клетки глии, а подсчитывали общее число и относительную площадь иммунопозитивных ядер клеток в 4-м слое коры лобной доли головного мозга животных. Площадь Nrf2-позитивно окрашенного гематоэнцефалического барьера не анализировалась.

Однократное внутрибрюшинное введение мексидола и курсовое пероральное использование тестируемого препарата в течение 14 сут не влияло на количество и площадь Nrf2-позитивных ядер, а также на концентрацию ТБК-реактивных продуктов, уровень небелковых SH-групп, активность G-tr и G-per в гомогенате коры головного мозга крыс, данные показатели достоверно не отличались от значений нормы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение мексидола интактным животным не влияет на экспрессию Nrf2 и оксидантный статус клеток коры головного мозга.

Количество Nrf2-позитивных ядер клеток коры лобной доли больших полушарий головного мозга у контрольных крыс (4-я группа) при окклюзии общей сонной артерии достоверно не изменялось на протяжении всего эксперимента (в течение 12 сут наблюдения после моделирования) по сравнению с показателями интактных животных. При этом относительная площадь Nrf2-позитивных ядер клеток увеличивалась через 4 ч от момента окклюзии на 77,2% (p=0,032) и на 5-е сутки эксперимента на 88,3% (p=0,032) (см. рисунок).

Профилактическое введение мексидола в течение 14 сут до моделирования окклюзии общей сонной артерии с последующим введением на протяжении всего эксперимента в течение 12 сут также не приводило к статистически значимому увеличению количества Nrf2-позитивных ядер клеток. Относительная площадь Nrf2-позитивных ядер клеток при введении мексидола увеличивалась через 4 ч после окклюзии общей сонной артерии на 104,1% (р=0,008) и оставалась повышенной до конца эксперимента (до 12 сут после окклюзии) по сравнению с показателями нормы (см. рисунок).

При этом через 4 ч и на 12-е сутки относительная площадь Nrf2-позитивных ядер клеток коры лобной доли больших полушарий головного мозга крыс, получавших мексидол, превосходила показатели контрольных животных на 15,2% (р=0,032) и 57,1% (р=0,056) соответственно. Кроме того, на 12-е сутки количество Nrf2-позитивных ядер у животных, получающих мексидол, превосходило аналогичный показатель у контрольных крыс на 43,6% (р=0,032) (см. рисунок).

Концентрация ТБК-реактивных продуктов по сравнению с показателями нормы (1-я группа) увеличивалась в гомогенате коры через 4 ч от момента окклюзии на 30,4% (р=0,052), нормализовалась через 12 ч от момента пережатия артерии и вновь повышалась на 5-е и 12-е сутки на 50,8% (р=0,004) и 60,6% (р=0,002) соответственно. Концентрация небелковых SH-групп в гомогенате головного мозга животных снижалась по сравнению с показателями нормы через 4 ч и на 5-е сутки окклюзии на 28,1% (р=0,017) и 39,8% (р=0,004) соответственно. Активность G-per снижалась через 4 ч после пережатия сонной артерии на 18,9% (р=0,065), через 12 ч — на 22,9% (p=0,036), активность G-tr повышалась на 35,8% (р=0,009) через 4 ч от момента окклюзии по отношению к уровню нормы (см. таблицу).

Применение мексидола до и после моделирования окклюзии общей сонной артерии с профилактической и лечебной целями оказывало нейропротективное действие, о чем свидетельствует снижение выраженности окислительного стресса в гомогенате головного мозга крыс.

На фоне мексидола происходила нормализация уровня ТБК-реактивных продуктов и небелковых SH-групп, на протяжении всего эксперимента эти показатели статистически значимо не отличались от значений нормы (1-я группа). Активность G-per по сравнению с нормой снижалась через 12 ч и на 5-е сутки после пережатия общей сонной артерии на 26,8% (р=0,004) и 19,8% (р=0,03) соответственно, активность G-tr уменьшалась через 12 ч на 17,6% (р=0,052). Концентрация ТБК-реактивных продуктов у животных, получавших мексидол, была достоверно ниже значений крыс группы контроля оккклюзии (4-я группа) на 5-е и 12-е сутки на 31,9% (р=0,082) и 24,3% (р=0,002) соответственно. Уровень небелковых SH-групп у животных 5-й группы (мексидол) превышал значения группы контроля окклюзии через 4 ч на 81,2% (р=0,032), на 5-е сутки на 72,8% (р=0,004) и на 12-е сутки на 49,7% (р=0,004). Активность G-per у крыс, получавших мексидол, была ниже показателей 4-й группы на 5-е сутки окклюзии на 22,2% (p=0,016), активность G-tr — через 4 ч после пережатия артерии на 27,1% (р=0,03) (см. таблицу).

У контрольных животных наблюдалась прямо пропорциональная зависимость между количеством Nrf2-позитивных ядер клеток и активностью G-per (r=0,44, p=0,052) и обратно пропорциональная зависимость между количеством Nrf2-позитивных ядер клеток и уровнем небелковых SH-групп (r=−0,489, p=0,028).

У животных, получавших мексидол, наблюдалась прямо пропорциональная зависимость между относительной площадью Nrf2-позитивных ядер клеток и концентрацией ТБК-реактивных продуктов (r=0,538, p=0,014).

В условиях нормы Nrf2 находится в комплексе с белком-репрессором Keap 1, который, с одной стороны, способствует убиквитированию (присоединению молекулы убиквитина в качестве метки) и протеосомальной деградации Nrf2, а с другой — предотвращает его проникновение из цитоплазмы в ядро [12].

Механизмы изменения экспрессии Nrf2 под действием ксенобиотиков в настоящее время активно изучаются. Принципиально в этом процессе выделяются следующие стадии [13]: 1) ксенобиотики подвергаются метаболизму с образованием супероксида и связанных с ним свободных радикалов; 2) образование свободных радикалов приводит к активации цитозольных факторов; 3) активированные цитозольные факторы катализируют модификацию Nrf, который связывается с антиоксидант-респонсивным элементом в промоторах разных генов антиоксидантных/детоксицирующих ферментов; 4) повышение транскрипции генов этих ферментов.

Кроме того, ряд ксенобиотиков способен напрямую связываться с белком-репрессором Keap1 и вызывать диссоциацию комплекса Keap1—Nrf2 с последующей транслокацией транскрипционного фактора в ядро и взаимодействием с последовательностями антиоксидант-респонсивного элемента промоторов генов-мишеней.

В настоящем исследовании установлено, что однократное и курсовое введение мексидола интактным крысам не влияет на количество и относительную площадь Nrf2-позитивных ядер клеток в коре лобной доли больших полушарий головного мозга животных. Полученные результаты свидетельствуют о том, что тестируемый препарат не влияет на экспрессию Nrf2 у интактных животных. Курсовое и однократное введение мексидола также не оказало существенного влияния на свободнорадикальный статус клеток коры лобной доли больших полушарий головного мозга крыс — концентрацию ТБК-реактивных продуктов (конечных продуктов пероксидации), уровень небелковых SH-групп (субстратов свободнорадикального окисления), активность антиоксидантных ферментов G-tr и G-per, что согласуется с полученными результатами по экспрессии Nrf2.

Количество Nrf2-позитивных ядер клеток коры лобной доли больших полушарий головного мозга у контрольных крыс при окклюзии общей сонной артерии достоверно не изменялось на протяжении всего эксперимента (в течение 12 сут после окклюзии) по сравнению с показателями интактных животных. При этом относительная площадь Nrf2-позитивных ядер клеток увеличивалась через 4 ч от момента окклюзии и на 5-е сутки эксперимента. Эти результаты свидетельствуют об увеличении экспрессии изучаемого транскрипционного фактора только в Nrf2-позитивных клетках лобной коры при окклюзии общей сонной артерии. Полученные результаты подтверждаются данными литературы [14]. Например, показано, что при окклюзии средней мозговой артерии у мышей экспрессия Nrf2 значительно повышается с максимумом через 8 ч после реперфузии.

Профилактическое введение мексидола в течение 14 сут до моделирования окклюзии общей сонной артерии с последующим введением на протяжении всего эксперимента также не приводило к статистически значимому увеличению количества Nrf2-позитивных ядер клеток в лобной коре. В то же время относительная площадь Nrf2-позитивных ядер клеток при введении мексидола увеличивалась через 4 ч после окклюзии общей сонной артерии и оставалась повышенной до конца эксперимента (до 12 сут после окклюзии) по сравнению с показателями интактных крыс. При этом у крыс, получавших мексидол, через 4 ч и на 12-е сутки относительная площадь, а на 12-е сутки также количество Nrf2-позитивных ядер клеток коры лобной доли больших полушарий головного мозга превосходили показатели контрольных животных, что свидетельствовало о способности мексидола повышать экспрессию Nrf2 в условиях гипоксии.

Предположительно, мексидол обладает несколькими механизмами действия. В условиях гипоксии происходят обратимое подавление электрон-транспортной функции митохондриального ферментного комплекса I и компенсаторная активация митохондриального ферментного комплекса II, субстратом которого является сукцинат [3], входящий в состав мексидола. Фумарат, образующийся в результате окисления сукцината, способен стимулировать экспрессию Nrf2 за счет инактивации Keap1 [15, 16].

Моделирование гипоксии приводило к развитию окислительного стресса в лобной коре головного мозга крыс, о чем свидетельствовали повышение уровня ТБК-реактивных продуктов (конечных продуктов пероксидации) и снижение активности G-per (антиоксидантного фермента) по сравнению с показателями интактных животных, что в свою очередь могло запустить процесс повышения экспрессии Nrf2.

Таким образом, на основе анализа полученных результатов можно сделать следующие выводы.

1. Мексидол не является прямым стимулятором экспрессии транскрипционного фактора Nrf2, однако в условиях циркуляторной гипоксии он способствует активации его синтеза.

2. Однократное внутрибрюшинное введение крысам мексидола в расчете 120 мг на 1 кг массы и его курсовое пероральное введение в дозе 100 мг на 1 кг массы 3 раза в день в течение 14 сут не влияют на экспрессию транскрипционного фактора Nrf2 в клетках коры лобной доли головного мозга животных.

3. При односторонней окклюзии общей сонной артерии происходит повышение экспрессии Nrf2 в клетках коры лобной доли головного мозга крыс через 4 ч и на 5-е сутки с момента пережатия артерии по сравнению с показателями нормы.

4. Пероральное введение мексидола по 100 мг на 1 кг массы 3 раза в день в течение 14 сут до и после моделирования односторонней окклюзии общей сонной артерии приводит к повышению экспрессии Nrf2 в клетках коры лобной доли головного мозга крыс через 4 ч и до 12 сут после окклюзии по сравнению с показателями нормы, через 4 ч и на 12-е сутки по сравнению со значениями контроля окклюзии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: alekseyshulkin@rambler.ru