В настоящее время проблема злоупотребления алкоголем не теряет своей значимости [1], что вызвано не только формированием зависимости от него, но и широким спектром последствий для организма человека [2].

Характерными для алкоголизма являются системные изменения, объяснить которые можно нарушениями в микроциркуляторном русле, которое страдает в первую очередь, так как осуществляет транспорт алкоголя ко всем органам. Этому предположению соответствует поражение сосудистых стенок при хронической алкогольной интоксикации, подробно описанное патологоанатомами [2], которое остается недостаточно изученным, в том числе в отношении механизма развития. Исследований эндотелия в наркологии недостаточно. Встречаются лишь единичные работы, в которых подтверждаются изменения отдельных эндотелийзависимых лабораторных показателей у больных алкоголизмом [3—8], которые указывают только на наличие эндотелиальной дисфункции. В связи с этим изучение функционального состояния эндотелия и степени его повреждения при алкоголизме остается одним из важных аспектов исследования патогенеза этого заболевания.

Одним из основных объективных клеточных маркеров повреждения эндотелия могут выступать циркулирующие в периферической крови эндотелиальные клетки [9]. Этот показатель отражает повышение процессов апоптоза и некроза в эндотелии [10]. Установленное повышение содержания циркулирующих эндотелиальных клеток в крови больных при патологических состояниях, как правило, выступало неблагоприятным фактором. У здоровых людей количество циркулирующих эндотелиальных клеток очень мало, так как в норме процесс обновления эндотелия медленный, а нежизнеспособные клетки быстро удаляются из кровотока ретикулоэндотелиальной системой [10].

Цель настоящего исследования — изучение содержания субпопуляций циркулирующих эндотелиальных клеток в крови у больных алкоголизмом при синдроме отмены алкоголя, неосложненном и осложненном делирием.

Обследовали 30 пациентов (22 мужчины и 8 женщин) с синдромом зависимости от алкоголя 2-й стадии. Все они проходили стационарное лечение в Забайкальском краевом наркологическом диспансере Читы в 2016—2017 гг. во время развития у них синдрома отмены алкоголя — неосложненного алкогольного абстинентного синдрома (ААС) или осложненного алкогольным делирием (АД). В соответствии с МКБ-10 состояние пациентов в первом случае соответствовало рубрике F10.302 (17 человек), во втором — рубрике F10.40 (13 человек).

Возраст пациентов находился в диапазоне от 21 года до 40 лет (средний возраст 31,5±1,2 года). Длительность злоупотребления алкоголем составила в среднем 9,0±1,1 года; при ААС — 7,5±1,0 года; при АД — 11,4±2,1 года (р>0,05).

Забор крови для исследования проводили в день поступления больного в стационар — в состоянии синдрома отмены, и повторно через 2 нед после терапии — в конце постабстинентного состояния.

Контрольную группу составили 22 здоровых (15 мужчин и 7 женщин) в возрасте от 21 года до 38 лет (средний возраст 27,9±1,4 года); по полу и возрасту группа контроля не отличалась от группы больных (р>0,05).

Критериями включения в исследование являлись возраст от 18 до 40 лет, отсутствие грубой соматической патологии, такой как вирусные гепатиты, цирроз печени, заболевания сердца, гипертоническая болезнь и симптоматические артериальные гипертензии, эндокринная патология, злокачественные новообразования, хроническая обструктивная болезнь легких с дыхательной недостаточностью, хроническая почечная и печеночная недостаточность, воспалительные заболевания любой этиологии (острые, хронические в стадии обострения).

Лабораторную часть исследования осуществляли в биохимической лаборатории НИИ молекулярной медицины Читинской государственной медицинской академии.

Для определения количества циркулирующих эндотелиальных клеток в цельной крови и уровня экспрессии поверхностных маркеров проводили окрашивание клеток флюоресцентно-меченными антителами к CD34, CD105, CD146, CD45. Для выявления живых и мертвых клеток использовали ионный краситель 7-AAD. Окрашивание проводили при температуре +4 °С в течение 15 мин. Во всех опытах использовали рекомендованное производителем количество антител. Для лизирования эритроцитов использовали коммерческий лизирующий/фиксирующий раствор OPTILYSE С («Beckman Coulter»). Окрашенные клетки не отмывали и подвергали цитофлюорометрическому анализу.

В работе применяли цитометр Cytomics FC-500 фирмы «Beckman Coulter», укомплектованный лазером длиной волны 488 нм и стандартными фильтрами. На диаграмме малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния выделяли область событий, которые по значению этих параметров соответствовали живым лейкоцитам. CD45^–CD 146⁺-клетки, окрашенные флюоресцентно-меченными антителами, а также долю экспрессирующих CD34- и CD105-клеток выявляли по уровню флюоресценции в соответствующих каналах. При каждом цитометрическом измерении анализировали не менее 500 000 событий. Данные обрабатывали с помощью программ CXP Cytometer и Kaluza («Beckman Coulter»).

Оценивали число (на 500 000 лейкоцитов в 1 мкл) циркулирующих эндотелиальных клеток (circulating endothelial cells, СЕС), количество живых и мертвых циркулирующих эндотелиальных клеток (circulating endothelial cells Living/Dead, CEC Living/Dead), число ростковых (молодых) эндотелиальных клеток (endothelial cells progenitors, ЕСР) и число активированных эндотелиальных клеток (activated endothelial cells, АЕС).

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с применением пакета анализа Microsoft Excel 2007 и пакета прикладных статистических программ Statistica-10. При описании количественных результатов исследования использовали медиану со стандартным отклонением (Me±SD). Данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного (25-й и 75-й перцентили) интервала. Для сравнения двух независимых выборочных совокупностей применяли непараметрический U-критерий Манна—Уитни. Для сравнения связанных между собой показателей (одна группа в динамике) использовали непараметрический критерий W Вилкоксона. Различия считали достоверными при показателе p<0,05.

В работе соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации и Правилами клинической практики в Российской Федерации. Исследование одобрено в локальном этическом комитете Читинской государственной медицинской академии. От всех обследованных получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

В ходе проведения исследования выявлено, что в состоянии отмены алкоголя общее количество циркулирующих эндотелиальных клеток — CEC (CD146+CD45–) — превышает контрольные значения более чем в 5 раз. При этом данные изменения наблюдали как у пациентов с неосложненным синдромом отмены алкоголя, так и у больных с АД, что свидетельствует о выраженной дисфункции и, возможно, повреждении эндотелия у пациентов в обеих группах. Стоит отметить, что рост числа CEC произошел в основном за счет увеличения в периферической крови больных алкоголизмом субпопуляции живых эндотелиальных клеток (CEC-Living), число которых также кратно превышало показатели в группе контроля независимо от вида синдрома отмены, различия являлись достоверными (табл. 1).

Как видно из табл. 1, у пациентов с АД до терапии отмечено более значительное увеличение содержания CEC-Living, что может косвенно свидетельствовать о тяжести сосудистых расстройств при этом состоянии, в отличие от неосложненного синдрома отмены.

Выявлено, что при синдроме отмены алкоголя в крови пациентов появляются мертвые циркулирующие эндотелиальные клетки (CEC-Dead), которые практически отсутствуют у представителей контрольной группы.

Можно предположить, что этому способствуют повышенное внутрисосудистое артериальное давление и высокая скорость кровотока у больных в состоянии отмены алкоголя; последнее было установлено в наших исследованиях при изучении микроциркуляции у больных алкоголизмом инструментальным методом [11]. Поэтому данные факторы могут приводить к механическому повреждению эндотелиоцитов и их быстрой гибели.

У пациентов с алкоголизмом в остром состоянии в крови также появляются активированные эндотелиальные клетки (АЕС), которые отсутствовали у здоровых. Установлено увеличение содержания субпопуляции ростковых эндотелиальных клеток (ЕСР) в основной группе (особенно при неосложненном синдроме отмены алкоголя) в сравнении с контрольной группой. Вероятно, повышение содержания этих субпопуляций циркулирующих эндотелиальных клеток носит компенсаторный характер у пациентов при синдроме отмены алкоголя, отражая процесс восстановления баланса между повреждением эндотелия и его регенерацией, так как ЕСР и АЕС участвуют в процессах восстановления и поддержания стабильности эндотелия.

В табл. 2 представлены

Установлено, что количество циркулирующих эндотелиальных клеток — CEC (CD146+CD45–) при неосложненном состоянии отмены через 2 нед существенно снижается (p=0,035), хотя остается выше контрольных значений. У больных, перенесших АД, такого не наблюдается, содержание CEC (CD146+CD45–) в 5—6 раз превышает показатели в контрольной группе и значимо отличается от их числа у пациентов с простым синдромом отмены (p=0,031). Это свидетельствует как о большей тяжести эндотелиальной дисфункции/повреждении эндотелия в патогенезе АД, так и о продолжительном действии патологических факторов на эндотелий, в результате изменения содержания CEC сохраняются даже в постабстинентном состоянии.

При этом в процессе терапии через 2 нед существенно снижается содержание субпопуляции CEC-Living как у больных с неосложненным синдромом отмены (p=0,038), так и у пациентов, перенесших АД (p=0,005), хотя и остается превышение над показателями группы контроля (см. табл. 2).

При неосложненном синдроме отмены алкоголя другие субпопуляции циркулирующих эндотелиальных клеток остаются повышенными относительно контрольных значений, но не претерпевают значимых изменений в динамике через 2 нед терапии. В том числе это касается содержания ЕСР и АЕС, которые участвуют в процессах восстановления эндотелия.

У пациентов, перенесших АД, через 2 нед выявлены некоторые особенности. На фоне снижения содержания в кровотоке живых эндотелиальных клеток (CEC-Living) наблюдается кратный рост содержания субпопуляции мертвых эндотелиальных клеток (CEC-Dead) в постабстинентном периоде, различия являются достоверными (p=0,044). По этому показателю больные с делирием значимо отличаются от пациентов с неосложненной абстиненцией (p=0,048). Поскольку в норме нежизнеспособные эндотелиальные клетки быстро удаляются из кровотока ретикулоэндотелиальной системой, можно предположить, что у больных при синдроме отмены алкоголя с делирием наблюдаются более выраженные системные нарушения функций эндотелия. Поэтому полученные результаты демонстрируют продолжение действия патологических факторов на эндотелиоциты в постабстинентном состоянии при перенесенном АД, что, вероятно, требует соответствующей медикаментозной коррекции у этой группы пациентов.

Кроме того, при АД выявлено значимое (p=0,040) повышение через 2 нед уровня ростковых эндотелиальных клеток (ЕСР), что, вероятно, носит компенсаторный характер, отражая усиление процессов восстановления эндотелия. Но такого роста явно недостаточно, так как показатели не отличаются от таковых в группе больных с неосложненным состоянием отмены. Данное обстоятельство также является неблагоприятным фактором при АД.

Содержание субпопуляции активированных эндотелиальных клеток (АЕС) при синдроме отмены с делирием не претерпевает изменений в процессе терапии, не отличается от показателей при неосложненном синдроме отмены, но не снижается до уровня контрольных значений.

Исследование показало, что при синдроме отмены алкоголя полной нормализации содержания изучаемых показателей крови пациентов за 2 нед лечения не происходило, при этом более значимые изменения сохранялись у пациентов, перенесших АД.

Таким образом, у больных алкоголизмом при синдроме отмены алкоголя (неосложненном и осложненном делирием) выявляются признаки повреждения эндотелия, которое носит выраженный, распространенный характер и подтверждается изменением содержания в периферической крови циркулирующих эндотелиальных клеток.

Общие изменения в остром состоянии до лечения пациентов заключались в росте содержания СЕС, в первую очередь за счет субпопуляции CEC-Living. Появлялась субпопуляция CEC-Dead, свидетельствующая о выраженном повреждении эндотелия. Отмечался рост ECP (CD146+CD34+) и AEC (CD146+CD105+), что предположительно носило компенсаторный характер, способствуя восстановлению эндотелия.

В постабстинентном периоде через 2 нед терапии все изучаемые параметры сохранялись выше контрольных показателей, претерпевая положительные изменения при неосложненном синдроме отмены алкоголя в виде существенного снижения уровня СЕС в крови за счет субпопуляции CEC-Living, другие показатели значимо не изменялись. После перенесенного АД также наблюдали значимое снижение содержания в крови пациентов субпопуляции CEC-Living, но сохранялось высоким содержание СЕС, в первую очередь за счет роста в динамике субпопуляций CEC-Dead и ECP (CD146+CD34+). Выявленные более существенные изменения состояния эндотелия при АД свидетельствуют о тяжести патологических процессов в микроциркуляции при данном состоянии, которые носят пролонгированный характер.

Поэтому определение количества циркулирующих эндотелиальных клеток и их субпопуляций может рассматриваться в качестве раннего диагностического маркера повреждения эндотелиальной стенки у пациентов в состоянии отмены алкоголя.

Исследование не имело спонсорской поддержки, выполнено в рамках государственного задания Минздрава России на осуществление научных исследований и разработок.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Сахаров Анатолий Васильевич – д.м.н., доцент, заведующий кафедрой психиатрии, наркологии и медицинской психологии ФГБОУ ВО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России; e-mail: sawt@list.ru; https://orcid.org/0000-0001-8835-6607

Голыгина Светлана Евгеньевна – ассистент кафедры психиатрии, наркологии и медицинской психологии ФГБОУ ВО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России; e-mail: svetagolygina@yandex.ru

Терешков Павел Петрович – к.м.н., заведующий биохимической лабораторией НИИ молекулярной медицины ФГБОУ ВО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России; e-mail: tpp6915@mail.ru

*e-mail: sawt@list.ru