Лекарственный препарат (ЛП) Церебролизин, изготавливаемый на основе пептидного экстракта мозга молодых свиней, проявляет нейротрофический и нейропротективный эффекты, важные для восстановления пациентов после ишемического инсульта (ИИ) и терапии деменции [1]. Экспериментальные исследования указали на нейротрофический [2], нейропротективный [3], ноотропный [4, 5], противоболевой и противовоспалительный [6], антиконвульсантный [7] и противоопухолевый [8] эффекты Л.П. Церебролизин. Клинические исследования показали эффективность и безопасность использования Л.П. Церебролизин для терапии острого ИИ [9], после черепно-мозговых травм (ЧМТ) и субарахноидальных кровоизлияний [10], при когнитивных нарушениях [11] и расстройствах аутистического спектра [12], а также подтвердили противовоспалительный и антиоксидантный эффекты [13]. Метаанализы клинических исследований подтвердили целесообразность применения Л.П. Церебролизин в терапии острого ИИ [14], болезни Альцгеймера умеренной тяжести [15] и ЧМТ [16].
Клиническая эффективность Л.П. Церебролизин обусловлена особенностями его пептидного состава. Сравнительное экспериментальное исследование нескольких нейропептидных экстрактов животного происхождения показало, что только Л.П. Церебролизин способствовал улучшению результатов неврологического тестирования в модели ИИ [17]. Нейропластическое действие препарата обусловлено воздействием на нейрональную сигнальную систему фактора роста нервов (ФРН) [18], что отчасти подтверждается результатами нейроцитологических исследований [19]. Анализы пептидного состава препарата, проведенные ранее с использованием стандартных процедур секвенирования белков, указали на наличие в его составе пептидных фрагментов энкефалинов [20], ФРН, орексина, галанина и др. [21].
Таким образом, получение максимально полной информации о пептидном составе представляет собой одно из важнейших направлений фундаментальных исследований Л.П. Церебролизин. Опубликованная к настоящему времени информация о пептидах Л.П. Церебролизин заведомо неполна. Например, полученный ранее масс-спектр Л.П. Церебролизин указал на наличие в его составе десятков тысяч пептидов в диапазоне масс 200—6000 Да с максимальным количеством пептидов в сравнительно «легкой» пептидной фракции (до 1500 Да) [20]. Поэтому для комплексного анализа пептидного состава Л.П. Церебролизин следует использовать высокоточную масс-спектрометрию (МС) с микросеквенированием выделяемых пептидов.
Попытка проведения такого анализа Л.П. Церебролизин была предпринята ранее [22]. Однако данную работу отличает несколько особенностей, которые нельзя не подчеркнуть. Во-первых, авторы приобрели образцы Л.П. Церебролизин в интернет-магазине, не у лицензированного дистрибьютора препарата (в том числе аптека) и не у фирмы-производителя. Следовательно, нельзя исключить того, что в работе [22] изучался не сам Л.П. Церебролизин, а контрафактное изделие.
Во-вторых, в работе утверждается, что методом de novo-секвенирования (программный пакет PEAKS) были установлены последовательности 638 пептидов. Такое весьма малое количество пептидов — довольно странный результат для масштабного протеомного исследования, в котором изучаются десятки тысяч пептидных фрагментов. Чрезвычайно малое количество пептидов указывает на крайне низкую эффективность использованных в работе процедур анализа МС-данных [22].
В-третьих, приводимые примеры аминокислотных последовательностей пептидов подтверждают сделанное выше предположение о возможной контрафактности исследованных авторами [22] образцов. Авторы утверждают, что не нашли в исследованных ими образцах никаких пептидных фрагментов ростовых факторов, а нашли преимущественно фрагменты тубулина, актина и основного миелинового белка. Поэтому, как отметили и сами авторы работы, полученные ими результаты указывают на проблемы, связанные в большей мере с приобретением лекарств по Интернету, чем на пептидный состав Л.П. Церебролизин. Тем не менее данная статья является фактически единственной опубликованной ранее работой, в которой заявляется о применении современных методов протеомики к анализу Л.П. Церебролизин.
Цель исследования — проведение МС-исследования пептидного состава Л.П. Церебролизин с использованием одной из передовых технологий современной протеомики — гибридного масс-спектрометра, соединяющего в себе возможности хроматографического выделения ионов и многомерного МС-анализа.
Материал и методы
В ходе исследования был изучен состав образцов пептидной фракции Л.П. Церебролизин трех различных серий (серия B4RF1A, дата выпуска 06.2018; серия PB2298, дата выпуска 06.2014; серия A4AB1A, дата выпуска 02.2015), приобретенных в государственных аптеках Москвы. Все образцы были с действующим сроком годности, выпущены в течение 4 последних лет и изучены при различных условиях протеомного эксперимента. В целом было проведено 10 независимых протеомных МС-экспериментов.
Процесс экспериментального исследования пептидного состава Л.П. Церебролизин состоял из трех основных этапов: очистки препарата, хроматографического разделения пептидов и МС-анализа пептидной фракции с параллельной идентификацией аминокислотных последовательностей пептидов.
Очистка препарата состояла в отделении липидной фракции и обессоливании для получения очищенной пептидной фракции. Для очистки препарата от липидной фракции использовали модифицированный метод Брокерхоффа—Даусона—Хюбшера [23]. Сначала проводили мягкое щелочное дезацилирование фосфолипидов. Методику отрабатывали на смеси 1 мл протеолипосом из 1—20 мг фосфатидилхолина и 0,05—0,2 мг бацитрацина или грамицидина А. Лиофилизировали 1 мл образца очищенного Л.П. Церебролизин, доливали гексан, метанол (1:1, v/v) и разводили в 2 раза раствором 0,25 М NaOH в метаноле. Инкубировали 45 мин при встряхивании при комнатной температуре, включая 15 мин при t=75 °C. Последовательно добавляли метанол, гексан и воду (1:4:4, v/v), перемешивали и центрифугировали 1 мин при 1000 g. Фракцию с гексаном отделяли, водно-метанольную — нейтрализовали HCl до pH 4—6. К нейтрализованной водно-метанольной фракции добавляли гексан, перемешивали, центрифугировали 1 мин при 1000 g, осторожно отсасывали фракцию с гексаном, не затрагивая осадок на границе раздела фаз. Повторяли процедуру 4 раза. Водно-метанольную фракцию объединяли, лиофилизировали, осадок ресуспендировали сначала в смеси метанол: вода (1:1), супернатант сливали, затем в смеси хлороформ: метанол (1:1), 0,2% ТФУ, супернатанты объединяли, высушивали от хлороформа и обессоливали.
Обессоливание пептидной фракции проводили на мини-колонке при помощи центрифугирования [24]. В мини-колонку 0,75´4,5 см («Raining Instrument», США) наливали 2 мл сефадекса G-10 («Pharmacia», Швеция), декантированного в смеси метанол: вода (85:15, v/v), каплями наливали 160 мкл того же раствора и уравновешивали на центрифуге 1 мин при 1000 g. Процедуру повторяли до тех пор, пока на выходе не оставалось 150 мкл раствора. Каплями 150 мкл образца наносили на гель и центрифугировали, как описано выше. Гель после однократного использования заменяли. После процедуры обессоливания потери белка составляли не более 35%.
Протеомный анализ пептидов
Протеомный анализ пептидов осуществляли высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с использованием системы Ultimate 3000 RSLCnano («Thermo Scientific», США), соединенной с масс-спектрометром Q-exactive HFX («Thermo Scientific», США). МС-орбитальные «ловушки ионов» в составе таких масс-спектрометров работают в режиме высокого разрешения и позволяют проводить идентификацию молекул пептидов и белков небольшого размера. Быстрая скорость сканирования и распараллеливание процессов хроматографирования и МС пептидов позволяют идентифицировать большое число пептидных фрагментов, что важно при анализе лекарственных препаратов со сложным составом.
Один микрограмм пептидной смеси загружали на обогащающую колонку Acclaim µ-Precolumn (0,5×3 mm, размер частиц 5 µm, Thermo Scientific) при потоке 10 мкл/мин в течение 4 мин в изократическом режиме с использованием буфера «С» в качестве подвижной фазы (2% ацетонитрил, 0,1% муравьиная кислота в деионизованной воде). Далее пептиды разделяли на ВЭЖХ-колонке Acclaim Pepmap C18 (75 мкм×150 мм, размер частиц 2 мкм) («Thermo Scientific», США) в градиентном режиме элюирования. Градиент формировали подвижной фазой, А (0,1% муравьиная кислота) и подвижной фазой Б (80% ацетонитрил, 0,1% водный раствор муравьиной кислоты) при скорости потока 0,3 мкл/мин. Колонку промывали 2% подвижной фазой Б в течение 4 мин, после чего линейно увеличивали концентрацию подвижной фазы Б до 35% за 90 мин, затем линейно увеличивали концентрацию фазы Б до 99% за 10 мин, после 10-минутной промывки при 99% буфера Б концентрацию этого буфера линейно снижали до исходных 2% за 6 мин, после этого аналитическую колонку промывали для уравновешивания 2% фазой Б в течение 10 мин. Общая длительность анализа составляла 120 мин.
МС-анализ проводили на масс-спектрометре Q-exactive HFX в режиме положительной ионизации с использование источника NESI («Thermo Scientific», США). Для МС-анализа были установлены следующие параметры настроек: напряжение на эмиттере 2,1 кВ, температура капилляра 240 °C. Панорамное сканирование проводили в диапазоне масс от 300 до 1500 m/z при разрешении 120 000. При тандемном сканировании разрешение устанавливали 15 000 в диапазоне масс от 100 m/z до верхней границы, которая определяется автоматически, исходя из массы прекурсора, но не более 2000 m/z. Изоляцию прекурсорных ионов проводили в окне ±1 Да. Максимальное число разрешенных для изоляции ионов в режиме MS2 было установлено не более 40, при этом граница отсечения для выбора прекурсора для тандемного анализа была установлена как 50 000 единиц, а нормализованная энергия соударения (NCE) равнялась 29. Для тандемного сканирования учитывали только ионы от z=2+ до z=6+ по зарядному состоянию. Максимальное время накопления для прекурсорных ионов составило 50 мс, для фрагментных ионов — 110 мс. Величину AGC для прекурсоров и фрагментных ионов устанавливали 1·106 и 2·105 соответственно. Все измеренные прекурсоры динамически исключались из тандемного MS/MS анализа на 90 с.
Последовательности пептидов определяли программным обеспечением Mascot (http://www.matrixscience.com) с использованием базы данных аминокислотных последовательностей SwissProt и посредством de novo-секвенирования.
De novo-секвенирование пептидов проводили на основании данных диссоциации, вызванной столкновением (CID). При проведении процедуры CID исследуемые ионы пептидов ускоряются в электростатическом поле и сталкиваются с нейтральными частицами (аргон). При столкновении кинетическая энергия преобразуется во внутреннюю энергию, что приводит к фрагментации пептидного иона на более мелкие фрагменты. Эти фрагменты анализируются посредством тандемной МС [25], в результате чего получается CID-масс-спектр молекулярных фрагментов пептида. CID-масс-спектр состоит из «массовой» компоненты (список наблюдаемых масс фрагментов) и «интенсивностной» компоненты (список наблюдаемых интенсивностей фрагментов) [26].
Для получения аминокислотных последовательностей пептидов Церебролизина, для которых были известны только масса, заряд и время хроматографического удержания пептида [20, 21], нами был разработан комплекс программ DNVSEQP для проведения de novo-секвенирования пептидов аминокислотных последовательностей по данным CID. Данные программы основаны, во-первых, на применении теории топологического [27], метрического [28, 29], комбинаторного [30] подходов к анализу «больших данных» [31, 32] и, во-вторых, на теории анализа хемографов [33, 34] к задачам хемоинформатики [35], и в частности к задаче идентификации аминокислотных последовательностей по CID-масс-спектрам.
Хемограф — размеченный конечный граф без петель с кликовым числом не более 3. Множество вершин χ-графа изоморфно множеству атомов молекулы, множество ребер изоморфно множеству химических связей молекулы, а матрица смежности содержит кратности химических связей. Пусть задано множество меток Y (в качестве меток используются химические типы атомов «C», «N», «O» и т. д.), функция разметки вершин μ: V→Y, и определена функция оценки метки w: Y→R. Разновидностью функции оценки метки является функция взвешивания m, вычисляющая атомарную массу для соответствующей метки вершины хемографа.
Пусть X=X (V, E) — хемограф c матрицей смежности M (X)={mij}, соответствующий исследуемому пептиду. Множество Г={(V, E)|V⊂N, E⊂N2}, являющееся множеством всех подграфов бесконечного полного графа G=(N, N2), будем называть множеством всех возможных графов, ∀X∈Г, N — натуральный ряд. Произвольный структурный фрагмент молекулы соответствует некоторому подграфу соответствующего хемографа X — т. е. графу, содержащему некое подмножество вершин данного графа и подмножество инцидентных этим вершинам ребер. Иначе говоря, множество всех структурных фрагментов молекулы изоморфно множеству всех замкнутых подграфов П (X) хемографа X (V, E):
Введем оператор модификации хемографов snx:Гnx→Г, где nx — небольшое натуральное число. В практическом случае nx редко превышает 2, так как вероятности тримолекулярных и тем более тетрамолекулярных реакций близки к нулю. Определим множество модификаций хемографов:
элементы которого соответствуют посттрансляционным модификациям белков, добавлению/удалению ОН-групп и др. Множество возможных МС-фрагментов определяется как S×Г. Соответственно произвольному фрагменту молекулы X, наблюдаемому в ходе проведения МС-эксперимента с CID-расщеплением молекул, соответствует определенный элемент множества S×П (X).
Таким образом, хемографу Х соответствует множество хемографов S×П (X), описывающих возможные фрагменты молекулы Х. Для каждого из этих фрагментов может быть определен инвариант графа — числовая характеристика или упорядоченный список таких характеристик (кортеж), значение которой (которого) одинаково для каждого элемента произвольного класса изоморфных графов. Элементарным будем называть инвариант ι:Г→R; кортеж-инвариантом — инвариант ι:Г→Rn, n≥2. Для каждого элемента a=(v (a), e (a)) множества S×П (X), v (a)={v1(a), v2(a), …, v|v(a)|(a)}, определим аддитивный числовой инвариант хемографа Х как:
так что множеству S×П (X) соответствует кортеж-инвариант ι(X)=(ι(a)|a∈S×П (X)). Молекулярная масса любого элемента a=(v (a), e (a)) вычисляется как частный случай элементарного инварианта i (a) при условии, что функция «w» — суть функция взвешивания «m».
Кортеж-инвариант i (X) соответствует массовой компоненте CID-масс-спектра молекулы X и включает все МС-пики, возможные для X. Экспериментально наблюдаемая массовая компонента CID-масс-спектра молекулы, ιв(X), является подмножеством кортежа ι(X), ιв(X)⊆i (X). Анализ разрешимости/регулярности задачи оценки изоморфизма по кортеж-инвариантам позволяет отобрать наиболее информативные элементы кортежа инвариантов ι(X). Затем, применяя методы машинного обучения на множествах прецедентов ((ι(X), ιв(X))) и получая функцию f: Rn→Rn, ιв(X)=f (ι(X)), становится возможным вычисление массового компонента CID-масс-спектра по кортежу ι(X). Вычисление значений функции f (ι(X)) является ключевым компонентом алгоритма de novo-секвенирования, использованного в настоящей работе.
После получения результатов de novo-секвенирования по всем 10 протеомным экспериментам мы использовали 10-балльную шкалу для полуколичественной оценки содержания пептидов в Л.П. Церебролизин. Данная шкала основана на постулате о том, что чем выше концентрация пептида в исследованных образцах, тем в большем числе протеомных экспериментов данный пептид будет найден. При заданном числе протеомных экспериментов (10 в случае настоящего исследования) баллом оценки содержания заданного пептида является число протеомных экспериментов, в которых пептид с заданной аминокислотной последовательностью был найден.
Результаты
Результаты МС-экспериментов наиболее удобно представить в виде двумерных (2D) масс-спектрограмм. Каждая точка 2D-спектрограммы соответствует пептиду; по оси «X» отложено значение молекулярной массы этого пептида, а по оси «Y» — значение хроматографического «времени удержания» пептида (которое характеризует скорость прохождения пептида через хроматографическую колонку).
Объединенная 2D-масс-спектрограмма пептидной фракции Л.П. Церебролизин (рис. 1),
Кластерный анализ пиков плотности на объединенной 2D-масс-спектрограмме легкой пептидной фракции Л.П. Церебролизин подтвердил, что почти 90% всех зарегистрированных пептидов Л.П. Церебролизин находятся в диапазоне достаточно низких молекулярных масс (400…600 Да, кластер II; 400…800 Да, кластер I). Пептиды кластера II, характеризующиеся высокими значениями времени удержания (т.е. времени прохождения через хроматографическую колонку менее 5000 с), были преимущественно гидрофобными пептидами без установленной биологической функции.
Мы идентифицировали 14 635 пептидов, соответствующих 1643 белкам протеома свиньи, которые участвуют в функционировании нейронов (рис. 2).
Для оценки биологических ролей установленных пептидов мы провели их сравнение с белками протеома человека. Идентифицированным 14 635 пептидам соответствовали 23 334 аннотации пептидов протеома человека. Аннотации протеома человека были получены на основании анализа данных UNIPROT [36]. Экспертный анализ полученных аннотаций показал, что секвенированные пептиды Л.П. Церебролизин могут являться пептидами-миметиками соответствующих пептидов в протеоме человека. Так, 13 997 аннотаций соответствовали пептидам-миметикам, которые могут ингибировать 275 киназ человека, в том числе CDK1, CDK2, TGFBR2, ABL1, GSK3-beta, MTOR. Дополнительно 5657 найденных аннотаций соответствовали 405 пептидным фрагментам из более чем 300 биологически активных пептидов (в том числе нейротрофических нейропептидов). Еще 1967 аннотаций соответствовали пептидам-миметикам, потенциально ингибирующим проапоптотические ферменты-каспазы CASP1, CASP3 и CASP6.
Одним из важнейших результатов настоящего исследования является подтверждение полученных ранее данных [21] о наличии в пептидном составе Л.П. Церебролизин фрагментов нейротрофических факторов (табл. 1).
Настоящее исследование позволило идентифицировать в составе Л.П. Церебролизин 405 пептидных фрагментов, соответствующих известным биологически активным пептидам, в том числе антибактериальным пептидам (дефенсины, гистатины, и др.), иммуномодуляторным пептидам (гранулин, мансерин и др.), пептидам, регулирующим усвоение жиров (спексин, гастрин, обестатин и др.), вазоактивным пептидам (эндотелин, VIP и др.) (табл. 2).
Обсуждение
Использование современных математических методов de novo-секвенирования позволило получить уникальную информацию о пептидном составе Л.П. Церебролизин. Для сравнения в настоящей работе с использованием только стандартного программного обеспечения для белковой МС (пакет MASCOT) нами были установлены последовательности 2221 пептида, что более чем в 3 раза больше, чем число пептидов, установленных ранее [22]. С использованием разработанных нами процедур de novo-МС-секвенирования были получены последовательности 14 635 пептидов Л.П. Церебролизин.
Анализы пептидного состава препарата, проведенные ранее с использованием стандартных процедур секвенирования белков, указали на наличие в составе Л.П. Церебролизин пептидных фрагментов энкефалинов (YGGFL, GGFLR, YGGFM), ФРН (GEFSV, NSYCTTT), орексина (CCRQK), галанина (WWLNSAGY) и др. [21]. В настоящем исследовании подтверждено наличие этих пептидных фрагментов, установлено присутствие других пептидных фрагментов перечисленных нейротрофических факторов и получены полуколичественные оценки содержания этих пептидов в Л.П. Церебролизин.
Механизмы действия нейротрофических факторов, приведенных в табл. 1, были подробно рассмотрены ранее [20, 21]. ФРН активирует рецепторы TrkA, LNGFR и необходим для восстановления сетей нейронов с повреждениями, возникающими вследствие ИИ или ЧМТ. Известны модельные пептиды, включающие пептид GEFSV (119—123), проявляющие ФРН-подобную активность [37]. Найденные в настоящем исследовании пептидные фрагменты ФРН, образующиеся при неспецифическом протеолизе протеома свиньи в процессе производства ЛП Церебролизин, относились:
1) к фрагментированному пропептиду ФРН (аминокислоты 19—121, используя нумерацию последовательности Q29074 в базе данных UNIPROT), в том числе пептиды VLFSTQ 75—80, PPVAAD 82—87, PDLEAS 91—96, DLEASG 92—97 и др. (рис. 3);
2) к сигнальному пептиду ФРН (NVPAGH 13—18 и др.);
3) к зрелой молекуле ФРН (пептиды GEFSV 119—123, NSYCTTT 187—192).
Как было показано ранее [21], пептиды Л.П. Церебролизин GEFSV и NSYCTTT могут взаимодействовать с рецептором TrkA, участвующим в осуществлении нейротрофических эффектов ФРН.
Энкефалины YGGFL и YGGFM — эндогенные опиоидные пептидные нейротрансмиттеры, поддерживающие множество нейрофизиологических функций, в том числе регенерацию нейронов. Орексин увеличивает уровни экспрессии нейротрофина-3 [38], поддерживая выживание и дифференциацию нейронов. Пептид CCRQK может иметь важное значение для взаимодействия орексина-А с рецепторами [20]. Галанин модулирует секрецию ацетилхолина, серотонина и норадреналина [39], необходим для «спраутинга» аксонов [40].
Помимо подтверждения результатов предыдущих исследований состава Л.П. Церебролизин, настоящий анализ указал на наличие в его составе пептидов-миметиков, которые могут ингибировать 275 киназ человека (в том числе CDK1, CDK2, TGFBR2, ABL1, GSK3-beta, MTOR). Ингибирование киназ GSK3-beta и MTOR соответствует нейротрофическому и нейропротективному действию Л.П. Церебролизин, а ингибирование киназ CDK1, CDK2, TGFBR2, ABL1 — противоопухолевому действию препарата [8].
Заметим, что в табл. 1 приведены полуколичественные оценки числа пептидов. Определение точного количества отдельных пептидов по МС-данным является сложной исследовательской задачей. Решение этой задачи становится еще более сложным в случае исследования пептидных препаратов природного происхождения (в которых количество индивидуальных пептидов может существенно варьировать). Поэтому в настоящей работе мы использовали 10-балльную шкалу для полуколичественной оценки содержания пептидов в Л.П. Церебролизин.
Также следует отметить, что результаты, полученные в настоящей работе, косвенно указывают на возможную контрафактность образцов, исследованных в работе В. Gevaert и соавт. [22]. Например, в образцах Л.П. Церебролизин, исследуемых нами ранее [20, 21], более 5 лет назад, равно как и в настоящей работе, были найдены многочисленные пептидные фрагменты различных нейротрофических факторов. И наоборот, среди приводимых в работе В. Gevaert и соавт. [22] пептидов нами были подтверждены только три пептидных фрагмента актина: TEAPLNPK, DFEQEM (в составе более длинного фрагмента LCYVALDFEQEMATAASSSSLEK) и VAPEEHP (в составе VAPEEHPVLLTEAPLNPK), в то время как остальные 600 пептидов, приводимые В. Gevaert и соавт. [22], не были идентифицированы. Наш опыт анализа пептидного состава препаратов показывает, что такая низкая степень соответствия состава и очевидное преобладание пептидных фрагментов актина характерны именно для низкостандартизированных экстрактов тканей головного мозга (каковым Л.П. Церебролизин не является [7]).
Результаты настоящего исследования также указали на присутствие в исследованных образцах Л.П. Церебролизин 405 пептидных фрагментов, соответствующих антибактериальным пептидам дефенсинам и гистатинам, иимуномодуляторным пептидам гранулина и мансерина, пептидам спексина, гастрина, обестатина, регулирующим усвоение жиров, и вазоактивным пептидам эндотелин и VIP.
Синэнкефалин (пептиды KELLQL, LLQLSK) является синергистом энкефалинов, пептид PACAP — вазоактивный нейротрансмиттер и нейромодулятор. Нейроэндокринный регуляторный пептид-1 подавляет соль-индуцированную или ангиотезин-2-индуцированную секрецию вазопрессина в гипоталамусе и гипофизе [41]. Галаниноподобный пептид поддерживает эффекты галанина, а нейропептид глицин-глутаминовая кислота — энергетический метаболизм нейронов. Нейропептид К проявляет гипотензивное и ноотропное действие, также регулируя энергетический метаболизм ЦНС [42]. Нейропептид нейромедин-В32 регулирует рост нейронов, уровни глюкозы, артериальное давление и посредством фактора CREB проявляет ноотропные эффекты [43]. Нейромедин-S поддерживает циркадианный ритм, регулирует синтез других пептидных гормонов и проявляет нейротрофическое действие [44].
Перспективным направлением дальнейших исследований пептидного состава Л.П. Церебролизин представляется выявление пептидов, которые встречаются в образцах Л.П. Церебролизин наиболее часто, модулируют активность кинома человека, тем самым усиливая нейротрофические эффекты препарата и противоопухолевую защиту, характеризуются мультитаргетным воздействием (ингибирование одним пептидом одновременно нескольких киназ и т. п., что является одной из основ плейотропного эффекта ЛП Церебролизин) и также оказывают противовоспалительное действие.
Заключение
Несмотря на существование доказательной базы и результаты многочисленных экспериментальных исследований, точные механизмы фармакологического действия Л.П. Церебролизин заслуживают детального изучения, так как остаются «за кадром» для большинства неврологов. de novo-секвенирование пептидной фракции Л.П. Церебролизин, проведенное в настоящей работе на основе данных гибридной МС, позволило установить аминокислотные последовательности 14 635 пептидов, ассоциированных с функционированием нейронов. Одним из важнейших результатов является подтверждение наличия в составе Л.П. Церебролизин активных нейропептидных фрагментов Leu- и Мет-энкефалинов, орексина, нейропептида VF, галанина и ФРН. Кроме того, впервые в составе Л.П. Церебролизин идентифицировано 8953 пептида, которые могут являться модуляторами кинома человека (в том числе киназ CDK1, CDK2, TGFBR2, GSK3, MTOR) и ингибиторами проапоптотических и провоспалительных каспаз CASP1, CASP3 и CASP6. Данные результаты вносят существенный вклад в понимание широкого спектра фармакологического действия Л.П. Церебролизин (прежде всего нейротрофического, нейропротективного и противовоспалительного эффектов).
Работа выполнена по гранту 18−07−00944 РФФИ.
Хромато-масс-спектрометрические измерения выполнены с использованием оборудования ЦКП «Протеом человека» (ИБМХ), математические расчеты и анализ полученных пептидов — с использованием международных баз данных и оборудования ФИЦ ИУ РАН.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
Сведения об авторах
Громова Ольга Алексеевна — e-mail: unesco.gromova@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-7663-710X
Торшин Иван Юрьевич — https://orcid.org/0000-0002-2659-7998
Згода Виктор Гаврилович — e-mail: victor.zgoda@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-4532-4274
Тихонова Ольга Валентиновна — e-mail: ovt.facility@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-2810-566X
Как цитировать:
Громова О.А., Торшин И.Ю., Згода В.Г., Тихонова О.В. Комплексный протеомный анализ «легкой» пептидной фракции препарата Церебролизин. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2019;119(8):75-83. https://doi.org/10.17116/jnevro201911908175
Автор для корреспонденции: Громова Ольга Алексеевна — e-mail: unesco.gromova@gmail.com