Результаты и обсуждение

По данным светооптического гистологического исследования, на 10-е сутки после травмы наблюдались выраженные структурные изменения нейронов, глии и капилляров головного мозга с характерным наличием фрагментарного отслоения мягких оболочек головного мозга, их набухание и расслоение диффузно-очаговыми (нередко массивными) скоплениями измененных эритроцитов, формирование вокруг кровоизлияний зон некробиотически измененных нервных клеток, наличие диффузного отека ткани головного мозга. В поле СА1 гиппокампа отмечены участки «выпадения» нейронов — нейрональная депопуляция гиппокампа. При ЧМТ значительно (в 1,4 раза) снижается ЛПН (рис. 1).

Выделено несколько наиболее типичных разновидностей нейронов поля СА1: неизмененные, большие (гипертрофированные) и гиперхромные. Наиболее показательным было увеличение количества нейронов гиперхромного типа на фоне снижения количества неизмененных. Результаты электронно-микроскопического исследования свидетельствуют о значительных деструктивных изменениях в поле СА1 гиппокампа при ЧМТ и нарастании ее гетерогенности. Среди гиперхромных нейронов отмечались как апоптотически измененные, гибнущие клетки, так и активированные (рис. 2). Нередко в ядрах нейронов присутствовали внутриядерные включения, преимущественно фибриллярного типа (рис. 3), что может свидетельствовать о глубоких перестройках ядерных белков и начале необратимых деструктивных процессов в ядре. В цитоплазме нейронов наблюдалась вакуолизация цистерн аппарата Гольджи, серьезным изменениям подвергались Мт. Большую их часть составляли деструктивно измененные и резко отечные, вакуолизированные формы с деструкцией и дискомплексацией крист и поврежденными мембранами (см. рис. 3). Остатки митохондриальных мембран включались в остаточные тельца и гранулы Лф, объем и численность которых увеличивалась от 1 до 4 в контроле до 10 и более при ЧМТ (см. рис. 3).

При применении генной терапии (ЧМТ + Пл) отмечены меньшая интенсивность и распространенность вызванных ЧМТ деструктивно-дистрофических изменений в нейронах. Индукция синтеза APOE3 положительно влияла на состояние нервной ткани и предотвращала развитие зон вторичной дезинтеграции в травмированном мозге. Доля деструктивно измененных Мт в нейронах была меньше, чем в группе ЧМТ — 55 и 70% соответственно (см. рис. 3). Г.не только снижала уровень деструкции Мт, но и изменяла соотношение органелл, находящихся в разном функциональном состоянии: в группе ЧМТ + Пл несколько увеличивалась доля неизменных и функционально активных (умеренно отечных) органелл за счет уменьшения деструктивных форм (резко отечных с начальными стадиями деструкции мембран). Г.оказывала значительно более выраженное влияние на процессы накопления Лф у более молодых животных по сравнению со старыми. Так, у старых крыс доля Лф в цитоплазме снижалась под влиянием лечения с 12% площади в группе ЧМТ до 11% в группе ЧМТ + Пл. При этом у взрослых крыс тормозящее влияние ГТ на накопление Лф было большим: доля Лф составляла 5% площади цитоплазмы в группе ЧМТ + Пл и 8% в группе ЧМТ (см. рис. 3).

При ЧМТ глубокие ультраструктурные изменения выявлялись не только в перикарионах, но и в отростках нервных клеток. Отмечено повреждение более 1/3 миелиновых волокон (рис. 4). Достаточно характерной реакцией является повреждение аксонов в виде их локального отека, деформации осевого цилиндра, его облитерации, а в ряде случаев и отслоения от миелиновой оболочки (с образованием вакуолей между ними), что сочеталось с дезинтеграцией, гомогенизацией и деструкцией внутриклеточных структур нейритов. Наблюдались выраженные изменения цитоскелета — повреждение нейрофиламентов, локальная (реже полная) потеря микротрубочек, приводящее к нарушениям аксонального транспорта.

Существенные изменения касались Мт аксонов: на фоне гипертрофии части органелл отмечались явления дискомплексации их крист, а также резкий отек. Наблюдались нарушения миелиновых оболочек в виде их расслоения, дезагрегации, нарушения ламелярной структуры, формирования вздутий и выпячиваний. Кроме того, происходили деструктивные изменения части синапсов. Локальные повреждения аксолеммы вызывают высвобождение кальция, что ведет к интрааксональным нарушениям цитоскелета и Мт, а также межнейрональных связей. Кроме того, повреждения Мт могут также приводить к высвобождению цитохрома С, что в свою очередь активирует каталазы и играет определенную роль в процессах апоптоза нейронов. При применении ГТ (ЧМТ + Пл) отмечена меньшая интенсивность и распространенность деструктивно-дистрофических изменений, вызванных ЧМТ. В частности, структура аксонов в группе ЧМТ + Пл была повреждена в меньшей степени, чем в группе ЧМТ. Нормализация касалась как структуры осевого цилиндра, его цитоскелета и Мт, так и миелиновых оболочек. Реже встречались проявления отека и деформации аксонов. Доля поврежденных миелиновых волокон составляла 22%, тогда как в группе ЧМТ она доходила до 35% (рис. 5).

Иммуногистохимическое исследование апоптоза. При ЧМТ структура пирамидного слоя гиппокампа нарушается, в нем появляются локальные истончения с «выпадением» нейронов (вследствие их гибели и элиминации). Г.предотвращала гибель части нейронов травмированного мозга, и ЛПН гиппокампа была на 12% больше в группе ЧМТ + Пл, чем в группе ЧМТ. Также улучшался качественный состав нейронной популяции — в меньшей степени росло число гиперхромных нейронов, что было более выражено у старых крыс. Отмеченное нами уменьшение количества нейронов при ЧМТ тесно связано с процессами апоптоза, которые, скорее всего, происходят в первые дни после травмы [14]. Исследование, выполненное с помощью TUNEL-метода, показало, что на 10-е и даже на 5-е сутки после травмы наблюдается низкий уровень апоптоза у животных во всех исследованных группах: количество клеток, находящихся в состоянии апоптоза, составляло не более 4,4% общего количества клеток (рис. 6).

Выраженность апоптотических процессов в мозге значительно увеличивалась с возрастом. У интактных старых крыс АИ был в 5—6 раз выше, чем у взрослых, что наблюдалось во всех экспериментальных группах (см. рис. 6). Максимальный уровень апоптотической гибели нейронов и глии наблюдался при травме (группа с ЧМТ), что было особенно демонстративно у старых животных. При этом разница с интактным контролем была более выражена у взрослых крыс: АИ возрастал у них в среднем в 6 раз, тогда как у старых животных — в 2,6 раза.

Во всех экспериментальных группах апоптотические процессы после ЧМТ оказались более интенсивными через 5 сут, чем через 10 сут, что свидетельствует о постепенном затухании апоптотической активности. Впрочем, различия между показателями АИ на 5-е и 10-е сутки были достоверными только у взрослых животных групп ЧМТ и ЧМТ + Пл, что, по нашему мнению, связано с лучшей способностью к восстановлению нервной ткани и блокированием процессов апоптоза у взрослых по сравнению со старыми животными. АИ в группе ЧМТ рос в большей степени у взрослых особей, чем у старых.

При применении ГТ (ЧМТ + Пл) наблюдалась положительная динамика процесса клеточной гибели — снижение АИ по сравнению с группой ЧМТ и на 5-е, и на 10-е сутки после травмы. Г.оказалась более эффективной в группе взрослых животных. Под влиянием плазмидного вектора на 5-е сутки после травмы у взрослых животных АИ снижался в 1,25 раза, а на 10-е сутки — в 1,20 раза по сравнению с группой ЧМТ. В то же время у старых животных он снижался в 1,13 раза на 5-е сутки и в 1,09 раза на 10-е сутки. Возможно, у старых крыс эффект был ниже благодаря предсуществующим возрастным морфофункциональным изменениям нервной ткани. Высокая вариативность значений АИ в этих группах не позволяет утверждать достоверность такого снижения под влиянием генной терапии. Одновременно, учитывая наши данные по ЛПН, которая была в 1,17 раза больше в группе ЧМТ+Пл, чем в группе ЧМТ, а также показатели по улучшению некоторых структурных характеристик нервной ткани, можно говорить о тормозящем влиянии ГТ на апоптотические процессы и положительном влиянии на морфофункциональное состояние нейронов поля СА1 гиппокампа.

Характерной чертой указанных изменений гиппокампа при ЧМТ является наличие значительно выраженного глиоза. В группе ЧМТ + Пл он был менее выражен.

Морфометрический анализ макроглии показал значительный рост ЛПГ (суммарно астро- и олигодендроцитов) (рис. 7). ЧМТ вызвала наибольший рост ЛПГ (на 41%), при ГТ (ЧМТ + Пл) он был менее выражен (на 8%).

По данным электронно-микроскопического исследования, у крыс группы ЧМТ отмечены выраженные дистрофические изменения глии: значительное накопление Лф (от 1—4 гранул в цитоплазме у контрольных животных до 10 и более при ЧМТ) и вакуолизация цистерн аппарата Гольджи. В глиоцитах количество гранул Лф увеличивалось в большей степени, чем в нейронах, при этом резко возрастал и объем гранул. Наблюдалось также увеличение количества и размеров остаточных телец. Важным компонентом изменения нервной ткани при ЧМТ является перераспределение внутри- и межклеточной жидкости, что проявлялось отеком отростков астроцитов (особенно выраженным в перивазальных участках и в некоторых случаях он оказывался очень масштабным), очаговым или диффузным отеком тел глиоцитов, а также нейронов и их отростков.

При применении ГТ (ЧМТ + Пл) отмечена меньшая интенсивность и распространенность деструктивно-дистрофических изменений, вызванных ЧМТ. Морфометрический анализ показал, что ГТ способствовала меньшему накоплению Лф в глиоцитах — количество его гранул было в 3 раза больше, чем в контроле, тогда как в группе ЧМТ — в 6 раз. Однако явления отека оставались значительными, особенно в области ножек астроцитов в перикапиллярной зоне.

При ЧМТ также имела место гиперплазия и гипертрофия микроглиоцитов. На ультраструктурном уровне отмечалось наличие крупных макрофагоподобных клеток с многочисленными крупными электронно-плотными везикулами. Морфометрический анализ ЛПМ продемонстрировал признаки ее активации в гиппокампе травмированных животных. Значительный рост ЛПМ во всех экспериментальных группах по сравнению с контрольными животными отражает пролиферацию микроглии и миграцию ее клеток к очагу повреждения. Рост ЛПМ происходил значительно интенсивнее, чем рост ЛПГ.— в 4,5 раза (см. рис. 7). При Г.Т. (ЧМТ + Пл) наблюдалась тенденция к торможению роста ЛПМ.

Иммуногистохимическое исследование нейронов и астроцитов (двойное иммуномечение). Характерным проявлением поражения гиппокампа при тяжелой диффузной ЧМТ в эксперименте стала активизация нейрон-глиальных отношений. Данные флуоресцентного иммуногистохимического конфокально-микроскопического исследования подтвердили факт потери нейронов (снижения плотности расположения NeuN-позитивных нейронов) в гиппокампе. Были обнаружены гипертрофия тел астроцитов, рост их объема, увеличение количества и размеров их отростков, разветвленность которых усиливалась, а характер ветвления изменялся со звездчатого на кустистый (рис. 8). При этом тела астроцитов приближались к слою нейронов, увеличивалась площадь контакта нейронов и астроцитов, отростки астроцитов часто проникали между нейронами пирамидного слоя. Г.положительно влияла на структуру и ультраструктуру гиппокампа, в том числе уменьшая количество астроцитов в радиальном слое и нормализуя их структуру (форма ветвления отростков в группе ЧМТ + Пл была преимущественно звездчатой, как в контроле).

Выявленное нарушение цитоархитектоники поля СА1 гиппокампа является морфологическим субстратом когнитивных нарушений при травматических поражениях головного мозга.

Исследование двигательной функции. В связи с тем что после ЧМТ значительная часть старых животных погибала, а состояние выживших часто было неудовлетворительным, их не использовали для функциональных исследований, результаты которых приведены ниже. Вместе с тем при введении плазмидного вектора после ЧМТ (группа ЧМТ + Пл) значительно больше их доживало до 10 сут (дня забоя).

Исследования неврологических нарушений у крыс при экспериментальной ЧМТ по шкале двигательной дисфункции (рис. 9) показало, что животные, у которых выполнялась липосомальная трансфекция ткани головного мозга плазмидным вектором с геном APOЕ3, в посттравматическом периоде продемонстрировали по сравнению с крысами группы ЧМТ более быстрый регресс неврологической симптоматики и быстрое восстановление нарушенных функций — силы и объема рефлекторных движений передних и задних конечностей и координации движений. Сумма баллов по шкале оценки двигательной дисфункции на 3-и и 4-е сутки после травмы у пролеченных животных была достоверно выше, чем у крыс в группе с ЧМТ: (24,0±3,81) баллов на 3-и сутки после травмы по сравнению с (17±2,95) баллами в группе ЧМТ (p=0,02); (26,4±3,36) баллов на 4-е сутки после травмы по сравнению с (19,8±3,27) баллами в группе ЧМТ (p=0,02).

Исследование когнитивных функций. Оценка влияния генной терапии на динамику расстройств пространственной памяти у крыс с ЧМТ показала, что у контрольных животных «время поиска» платформы в течение посттравматического периода быстро сокращалось (рис. 10). В группе ЧМТ «время поиска» уменьшалось более медленными темпами и во все сроки исследования достоверно превышало этот показатель в контрольной группе: (74,2±4,32) с против (17,2±3,27) с на 8-е сутки (p=0,01); (64,2±4,21) с против (16,2±2,49) с на 9-е сутки (p=0,01); (61,2±4,32) с против (9,6±2,41) с на 10-е сутки после травмы (p=0,01). В группе с ЧМТ+Пл трансфер гена APOЕ3 способствовал более быстрому регрессу когнитивных нарушений, в частности снижению дефицита пространственной памяти и способности к обучению. На 8-е сутки эксперимента значение показателя «время поиска» в опытной группе составляло (49,0±6,21) с по сравнению с (74,2±4,32) с в группе ЧМТ (p=0,01); на 9-е сутки — (34,8±3,96) с по сравнению с (64,2±4,21) с (p=0,01) и на 10-е сутки — (30,2±3,96) с по сравнению с (61,2±4,32) с (p=0,01).

Развитие молекулярной биологии и генетики в последние десятилетия дало возможность по-новому оценить динамику структурно-функциональных изменений при ЧМТ. Стало общепринятым, что патологические изменения при травме головного мозга являются «не отдельными событиями, а процессами, запущенными в движение механическим воздействием. Эти процессы не завершаются в сколько-нибудь обозримые сроки после травмы» [15]. В настоящее время доказано, что первичные повреждения мозга развиваются в течение относительно непродолжительного времени. Они сменяются процессом, который получил название «отсроченная клеточная смерть». При этом количество нервных клеток, погибающих в результате вторичных повреждений, может значительно превышать таковое в результате первичной травмы. С учетом этого вклад «отсроченной клеточной смерти» в развитие неврологического дефицита представляется весьма существенным, и протяженность периода вторичной гибели нервных клеток определяет существование так называемого «терапевтического окна», что позволяет проводить лечебные мероприятия, способствующие обеспечению нейропротекции [16, 17].