Список сокращений

АВМ — артериовенозные мальформации

ANG — ангиопоэтин

MMP — матриксная металлопротеиназа

VEGF — фактор роста эндотелия сосудов

Известно, что церебральные артериовенозные мальформации (АВМ) не являются статичными врожденными образованиями, а могут расти, рецидивировать и даже появляться de novo после «полного» излечения. Сочетание нарушения баланса в выработке фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтинов (ANG), матриксных металлопротеиназ и их рецепторов обусловливает непрерывный ангиогенный процесс в АВМ. Высокий уровень экспрессии этих факторов коррелирует с биологической активностью патологического процесса [1—4].

Цель исследования — изучить динамику факторов ангиогенеза до и после эмболизации церебральных АВМ.

Материал и методы

За период с 2011 по 2017 г. в отделении хирургии сосудов мозга Российского научно-исследовательского нейрохирургического института им. проф. А.Л. Поленова — филиала ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России проводилось изучение уровней VEGF, ANG-2 и ММP-9 в крови 314 пациентов с церебральными АВМ и 33 здоровых добровольцев. Всем пациентам проведена эндоваскулярная эмболизация церебральных АВМ с использованием клеевой (Histoacryl) и неадгезивной (Onyx) композиций. Эмболизацию осуществляли как из трансартериального, так и из трансвенозного доступа: 249 пациентам из 314 проведено от 2 до 7 этапов внутрисосудистого лечения. Средний возраст пациентов составил 34,1±1,4 года (от 18 до 64 лет), возраст здоровых добровольцев — 33,9±2,5 года (от 25 до 52 лет). Оценку первичного ангиогенного статуса (уровней АNG-2, VEGF и ММР-9) проводили перед оперативным лечением (в день операции) и в динамике через 1 сутки после эндоваскулярного вмешательства. Кровь пациентов забирали из вены натощак в вакуумную пробирку с активатором свертывания. Затем пробирку с материалом отправляли в биохимическую лабораторию, где после центрифугирования при 2700 об/мин в течение 20 мин получали сыворотку, которую после аликвотирования отправляли на хранение при температуре –20 °С. Исследование концентрации VEGF, ANG-2 и ММP-9 проводили на иммуноферментном автоматическом анализаторе планшетного типа Personal Lab. (Adaltis, Италия). Для определения уровня VEGF использовали тест-системы Invitrogen (США), а для MMP-9 и ANG-2 — тест-системы Research & Diagnostics Systems, Inc. (США). Для каждой тест-системы производитель в инструкции предложил референсные значения, полученные при исследовании крови 60 здоровых добровольцев. Нами у 33 здоровых добровольцев определены уровни VEGF — 271,2±41,1 пг/мл, ММР-9 — 432,5±48,4 нг/мл и ANG-2 — 2197,7±273,9 пг/мл. Эти данные совпали с диапазоном референсных значений, полученных производителем тест-систем у здоровых добровольцев. Эти значения приняты нами в качестве контрольных. Факт превышения уровня факторов ангиогенеза в крови определяли по выходу за пределы стандартного отклонения результатов, полученных в группе здоровых добровольцев [1, 4].

Результаты

Средний уровень VEGF в сыворотке крови больных с церебральными АВМ до проведения оперативного вмешательства составил 349±22,9 пг/мл; MMP-9 — 596,3±30,4 нг/мл и ANG-2 — 2971,4±80 пг/мл. Повышенный уровень хотя бы одного из исследованных факторов ангиогенеза выявлен у 152 (48,4%) из 314 пациентов с АВМ, у остальных пациентов до операции уровни всех факторов ангиогенеза не отличались от показателей у здоровых добровольцев. Повышение уровня VEGF обнаружено у 151 (48%) из 314 больных и сохранение показателя в пределах контрольных значений у 163 пациентов, повышение уровня MMP-9 выявлено у 147 (46,8%) пациентов, а повышение ANG-2 — у 126 (40,1%).

Не обнаружено связи повышения уровня факторов ангиогенеза с полом, возрастом, наличием сопутствующей патологии, локализацией АВМ (супра- и субтенториально). При анализе ангиографической картины у 89 пациентов выявлено преимущественное дренирование в глубокие вены мозга. При такой локализации дренажа у 54 (60,7%) из них выявлено повышение уровня факторов ангиогенеза: повышенный уровень VEGF обнаружен у 21 (38,9%) из 54 пациентов, ANG-2 — у 22 (40,7%) и MMP-9 — у 19 (35,2%).

Проанализирована связь между клиническим типом течения АВМ и уровнем факторов ангиогенеза. Эпилептический тип течения АВМ отмечен у 119 пациентов, кровоизлияния из АВМ выявлены у 172 пациентов, у 23 пациентов АВМ обнаружены при обследовании по поводу головной боли. У 102 (59,3%) из 172 пациентов с геморрагическим типом течения уровень ММР-9 оказался повышенным.

Проанализированы данные 152 ранее не оперированных пациентов, у которых выявлены до операции повышенные уровни факторов ангиогенеза. В этой группе пациенты распределились следующим образом: 12 (7,9%) больных с небольшими АВМ I—II градации по Spetzler—Martin, 98 (64,5%) — с АВМ III градации по Spetzler—Martin и 42 (27,6%) — с АВМ IV—V градации. Следовательно, наибольшее число больных (64,5%) с высокими уровнями факторов роста выявлено среди пациентов с АВМ III градации по Spetzler—Martin. В группах с небольшими АВМ (по Spetzler—Martin I—II) и с большими и гигантскими АВМ (по Spetzler—Martin IV—V) количество пациентов с повышенными VEGF, ММР-9 было сопоставимым. Вместе с тем у 19 (45,2%) из 42 пациентов с большими и гигантскими АВМ (по Spetzler—Martin IV—V) выявлен повышенный уровень ANG-2, что оказалось почти в 2 раза чаще, чем у больных с небольшими АВМ (по Spetzler—Martin I—II) — у 3 (25%) из 12 пациентов. Эти данные согласуются с результатами, обнаруженными при анализе структуры дренирования АВМ: повышенный уровень ANG-2 отмечен у 40,7% пациентов с наиболее часто встречающимся при больших и гигантских АВМ глубоким типом венозного дренирования. Проанализировано, как ведут себя повышенные уровни факторов ангиогенеза после эмболизации в зависимости от градации мальформации по Spetzler—Martin. Анализировали каждый этап операции в отдельности. После частичной эмболизации у 2 (16,7%) из 12 пациентов с небольшими АВМ (по Spetzler—Martin — I—II) выявлен рост уровня ММР-9 выше дооперационного. В то же время в группе больных с АВМ III градации по Spetzler—Martin число пациентов с ростом уровня этого фактора после операции достигает 58,2% (57 из 98 больных). Повышение уровня ММР-9 после операции продолжалось у 24 (57,1%) из 42 пациентов с АВМ IV и V градациями по Spetzler—Martin.

В группе пациентов с небольшими АВМ (по Spetzler—Martin — I—II) после частичной эмболизации число больных с продолжающимся ростом уровня VEGF составило 33% (4 из 12 больных). В группе больных с АВМ III градации по Spetzler—Martin число пациентов с дальнейшим повышением этого фактора составило 37,8% (37 из 98 больных), в группах больных с большими и гигантскими АВМ (по Spetzler—Martin—IV—V) динамика была аналогичной — 35,7%.

Таким образом, частичная эмболизация АВМ ведет к дальнейшему повышению уровня ММР-9 примерно у 50% больных с большими и гигантскими АВМ, уровень VEGF примерно у 30% больных во всех группах по Spetzler—Martin продолжает нарастать. У 47 (30,9%) из 152 больных в кровоснабжении АВМ участвовала наружная сонная артерия. Повышенный уровень VEGF выявлен у 23 (48,9%) из этих пациентов, MMP-9 — у 19 (40,4%) и ANG-2 — у 9 (19%). Далее, при включении наружной сонной артерии в кровоснабжение АВМ между этапами эмболизации, еще у 36 из 139 пациентов с частично эмболизированными АВМ (у 13 из 152 больных АВМ выключена тотально за один этап), обнаружен существенный рост уровней факторов ангиогенеза. Между этапами эмболизации, при появлении нового афферента АВМ, продолжали увеличиваться еще до повторной операции повышенные изначально уровни VEGF у 21 (58,3%) из 36 пациентов, а также MMP-9 — у 15 (41,7%) и ANG-2 — у 9 (25%). При анализе ангиографической картины в динамике между этапами операции у 65 пациентов с АВМ, в структуре которых не появлялись новые афференты из наружной сонной артерии, повышенный уровень VEGF продолжал увеличиваться еще до повторной операции у 18 (27,7%) пациентов, MMP-9 — у 17 (26,1%) и ANG-2 — у 8 (12,3%).

В зависимости от радикальности эмболизации 314 исследованных пациентов разделены на подгруппы: 86 больным выполнена тотальная внутрисосудистая эмболизация АВМ с использованием различных эмболизатов и их комбинаций (Onyx, Histoacryl), 228 пациентам произведена частичная внутрисосудистая эмболизация АВМ. Результат достигали за 1—7 этапов операции.

Проведен анализ динамики факторов ангиогенеза после каждого этапа операции в отдельности, в зависимости от выбранного эмболизата, в группе из 152 больных с повышением одного или нескольких факторов ангиогенеза. У пациентов этой группы 49 АВМ тотально эмболизированы, у 103 больных мальформации выключены частично. У 84 (55,3%) из 152 пациентов произведена эмболизация АВМ с использованием неадгезивной композиии Onyx, 68 (44,7%) — с применением клеевой композиции Histoacryl.

У 9 (10,7%) больных, эмболизированных с помощью неадгезивной композиции Onyx, в результате операции за один этап достигнуто тотальное выключение АВМ. При этом после операции наблюдалось снижение повышенных уровней всех факторов ангиогенеза до контрольных значений. После частичного выключения АВМ отмечалось дальнейшее повышение уровня VEGF у 24 (33,8%) из 71 пациента, а у 47 больных повышенный уровень после операции не увеличивался. Дальнейший рост повышенного уровня ММР-9 выявлен у 28 (39,4%) из 71 больного, у 43 он оставался на прежнем уровне. Дальнейший рост повышенного уровня ANG-2 наблюдался у 13 (18,3%) пациентов, в 58 случаях он оставался практически неизменным.

Таким образом, после каждого этапа частичной эмболизации АВМ с применением неадгезивной композиции Onyx дальнейший рост повышенных до операции одного или нескольких факторов ангиогенеза отмечен у 52 (77,7%) из 71 пациента.

Тотальная эмболизация с применением клеевой композиции Histoacryl за один этап выполнена 4 (5,9%) из 68 пациентов, у которых также после операции отмечено возвращение уровня всех факторов ангиогенеза к контрольным значениям. После каждого этапа частичной эмболизации АВМ с применением клеевой композиции Histoacryl отмечено дальнейшее нарастание уровня повышенных факторов ангиогенеза: содержание VEGF у 19 (29,7%) из 64 больных продолжало повышаться, у 45 пациентов оставалось практически на дооперационном уровне, содержание ANG-2 продолжало расти лишь у 8 (12,5%) из 64 больных. Среди пациентов с повышенным до операции уровнем ММР-9 превышение дооперационного уровня ММР-9 после операции получено у 29 (45,3%) из 64 больных.

Таким образом, после эмболизации с применением клеевой композиции Histoacryl продолжался рост повышенных до операции уровней одного или нескольких факторов ангиогенеза у 56 (87,5%) из 64 пациентов. То есть наибольшую склонность к повышению после операции, вне зависимости от эмболизата, продемонстрировала ММР-9, что выявляется более отчетливо при эмболизации АВМ с применением клеевой композиции Histoacryl.

Проанализированы результаты тотальной эмболизации церебральных АВМ у 86 из 314 пациентов. Для полного выключения АВМ понадобилось от 1 до 7 этапов эмболизации. При этом 42 (48,8%) больных имели АВМ I—II градации по Spetzler—Martin, 40 (46,5%) — АВМ III градации по Spetzler—Martin и 4 (4,7%) — IV градации по Spetzler—Martin. У 49 (56,9%) из 86 пациентов с тотально эмболизированными АВМ до первой операции выявлено базовое повышение уровня одного или нескольких факторов роста (рисунок). На рисунке показано, как изменяется уровень VEGF после эмболизации. У 13 из 49 пациентов с АВМ, тотально выключенной за один этап (1), уровень VEGF статистически значимо снижается (p<0,001). У 30 из 49 пациентов с АВМ, тотально выключенной за 2—7 этапов (2), уровень VEGF после тотальной эмболизации также снижается (p<0,05) (у пациентов этой группы уровни факторов ангиогенеза до начала лечения сравнивались с таковыми после тотальной эмболизации). У 6 пациентов с АВМ III—IV градации по Spetzler—Martin с ангиографически тотально эмболизированными АВМ уровень VEGF несколько нарастает. При дальнейшем анализе выявлено, что у этих больных при контрольной ангиографии, проведенной через 5—8 мес после операции, отмечено остаточное заполнение АВМ, в связи с чем потребовалась повторная эмболизация.

Следовательно, если на послеоперационной ангиографии мы видим полностью выключенную АВМ, а уровень VEGF после операции остается повышенным, требуется выполнение контрольной ангиографии через полгода для оценки радикальности эмболизации. Отсутствие нормализации VEGF после эмболизации может являться критерием нерадикального выключения АВМ.

Обсуждение

В исследовании предпринято изучение уровней факторов ангиогенеза VEGF, MMP-9 и AGP-2 у больных с АВМ до и после эндовасулярной эмболизации, выполнявшейся в один или несколько этапов, для уточнения молекулярных механизмов роста церебральных АВМ. Таким образом выявлено, что среди пациентов с геморрагическим типом течения АВМ чаще всего встречаются больные с повышением уровня ММР-9. Обнаруженные нами данные подтверждаются работами R. Starke и соавт., показавшими, что уровни MMP-9 в плазме у больных с разрывами АВМ были значительно выше по сравнению с таковыми при АВМ без разрыва и продолжали увеличиваться сразу после операции [1]. При включении в кровоснабжение АВМ афферентов из наружной сонной артерии (т.е. при появлении нового афферента АВМ и новообразованной сосудистой сети между этапами эмболизации) отмечен рост уровня VEGF между этапами операции у 58,3% (по сравнению с 27,7% пациентов без появления новых афферентов). У 98 (64,5%) из 152 пациентов с повышенными до операции уровнями факторов ангиогенеза имелись АВМ III градации по Spetzler—Martin.

В нашем исследовании у 189 из 314 больных до операции не отмечалось повышения уровня факторов роста, и дальнейшее обследование не входило в задачу данного исследования. Тем не менее следует отметить, что доля пациентов с АВМ III градации по Spetzler—Martin в этой группе составила 39,2% (74 больных). Среди пациентов с АВМ III градации по Spetzler—Martin отмечена самая большая доля (64,5%) больных с высоким уровнем VEGF. Наиболее вероятно, что именно у пациентов этой группы АВМ склонна к дальнейшему росту, так как сверхэкспрессия VEGF вызывает чрезмерное развитие аномальных кровеносных сосудов с нарушением специфичности эндотелиальных клеток (как в артериях, так и в венах) и ухудшением конструкции стенки сосуда при образовании АВМ [2, 3]. В группах с небольшими АВМ (по Spetzler—Martin — II—I) и с большими и гигантскими АВМ (по Spetzler—Martin — IV—V) число пациентов с повышенными VEGF, ММР-9 было сопоставимым. В то же время почти в 2 раза чаще (у 45,2% больных) выявлялся повышенный уровень ANG-2 при больших и гигантских АВМ (по Spetzler—Martin — IV—V) по сравнению с 25% пациентов с небольшими АВМ (по Spetzler—Martin — I—II). Именно для пациентов с гигантскими мальформациями характерно наличие нескольких расширенных венозных дренажей, осуществляющих венозный отток в глубокие вены мозга. Полученные данные соответствуют, на наш взгляд, тому факту, что в периваскулярной области вокруг больших и гигантских церебральных АВМ обнаружена сверхэкспрессия ANG-2, обеспечивающая формирование аномально расширенных вен без зрелой структуры стенок [4, 5].

Наиболее важными явились результаты оценки показателей ангиогенного статуса в зависимости от радикальности проведенных эндоваскулярных вмешательств.

Частичная эмболизация АВМ, независимо от эмболизата, ведет к дальнейшему повышению уровня ММР-9 у больных с большими и гигантскими АВМ, уровень VEGF примерно у 30% больных всех групп по Spetzler—Martin продолжает нарастать, повышенный уровень ANG после операции повышается незначительно. Наличие феномена послеоперационного роста АВМ после частичной эмболизации объясняется, с одной стороны, наличием ангиографически негативного, скрытого компартмента АВМ, с другой стороны, тем, что примерно у 50% больных с АВМ, возможно, существуют генетические механизмы, предрасполагающие к образованию новых сосудов, активно принимающих участие в возобновлении кровоснабжения мальформации [6].

Выполнение тотальной эмболизации АВМ приводило к обратному результату: больных с повышенными показателями уровней ангиогенных факторов после тотальной эмболизации не было. Всем пациентам с тотально эмболизированными АВМ выполнена контрольная ангиография через 6—11 мес после завершения лечения, подтвердившая радикальность выключения АВМ. У 6 пациентов при послеоперационной ангиографии мы выявили полностью выключенную АВМ, а уровень VEGF через сутки после операции остался повышенным. При выполнении контрольной ангиографии через полгода обнаружено остаточное функционирование мальформации, поэтому потребовался еще один этап эмболизации. Таким образом, отсутствие нормализации факторов ангиогенеза после эмболизации может являться критерием нерадикального выключения АВМ.

АВМ являются динамическим объектом с постоянным ремоделированием сосудов, обусловленным неоангиогенезом, который регулируется гемодинамической перестройкой, гипоксией и воспалением после вмешательства [6]. Изучение патогенеза церебральных АВМ и выяснение молекулярных механизмов их роста необходимо. Наибольший интерес представляют исследования динамических моделей, таких как линии культур эндотелиальных клеток из резецированных АВМ, а также исследование динамики факторов ангиогенеза в крови пациентов на фоне проводимого лечения. Наши результаты подтверждают большое значение роли ангиогенеза в патофизиологии АВМ головного мозга, так как дисбаланс факторов роста способствует прогрессированию и росту мальформаций [7]. Высокий уровень в крови VEGF, АNG-2 и ММР-9 у больных с церебральными АВМ может быть важным инструментом прогнозирования течения заболевания, определения риска кровоизлияния из АВМ, выбора оптимальной хирургической тактики.

Выявление факторов, предрасполагающих к дальнейшему росту АВМ, должно служить сигналом к максимально возможно радикальному и ускоренному удалению этих образований, в том числе с использованием комбинированной методики — тотального удаления мальформации после предварительной эмболизации [8].

Заключение

Дальнейшее изучение молекулярных механизмов роста артериовенозных мальформаций обеспечит новый взгляд на фундаментальную биологию этих сосудистых пороков, указав путь к оптимальному лечению. Возможно, в будущем полученные знания о роли ангиогенеза в патогенезе артериовенозных мальформаций позволят сочетать эндоваскулярную эмболизацию с применением антиангиогенных препаратов или эмболизацию с использованием материала, покрытого антиангиогенными факторами.

Участие авторов

Концепция и дизайн исследования — Р.Л.

Сбор и обработка материала — Р.Л., Д.Н.

Статистическая обработка — Р.Л.

Написание текста — Р.Л.

Редактирование — Г.С., П.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комментарий

Статья посвящена изучению факторов ангиогенеза у больных с артериовенозными мальформациями до и после эндоваскулярного лечения. Ранее авторами был опубликован обзор литературы на эту тему. Актуальность и новизна исследования не подлежат сомнению, так как оно касается фундаментальных проблем формирования и биологического поведения патологии, которая, хотя и относится к редкой, вызывает существенные нарушения работы мозга. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе динамики артериовенозных мальформаций, открывает путь к модификации и улучшению качества лечения. Следует подчеркнуть, что опубликованных аналогичных исследований в отечественной литературе нет, и авторы являются пионерами подобных работ в России.

Работа выполнена на большом клиническом материале — обследовано 314 больных с церебральными артериовенозными мальформациями до и после эндоваскулярного лечения. Всем больным выполнено однотипное исследование. Разнообразие артериовенозных мальформаций и их клинического течения позволило проводить сопоставление полученных результатов в разных группах больных.

Показано, что из трех изученных факторов ангиогенеза примерно у 50% больных до операции отмечается повышение уровня хотя бы одного из них. Получены определенные корреляции уровня изменений каждого фактора с морфологическими характеристиками АВМ. После операции изменения этих факторов разнонаправлены — происходят как их повышение, так и нормализация. Авторы попытались определить существование закономерностей этих изменений. Наиболее определенный вывод сделан в отношении изменений до и после эмболизации: при полном выключении АВМ происходит быстрая нормализация всех изученных факторов.

Несомненно, работа вызывает много вопросов, и, прежде всего, в связи с уровнем доказательности полученных данных. Статистическая значимость различий при сопоставлении групп приводится только для показателя VEGF до и после эмболизации. В этой связи некоторые выводы воспринимаются как излишне категоричные.

Тем не менее в целом работа представляет несомненный интерес не только для биологов, но и для практикующих нейрохирургов и неврологов.

О.Б. Белоусова (Москва)