Запуск механизма интегрирования вируса папилломы человека (ВПЧ) возможен при вступлении клетки в фазу митоза [1], что наблюдается в ходе регенерации поврежденного участка эпителия шейки матки при проникновении вируса в пролиферирующие базальные клетки многослойного плоского эпителия (МПЭ) и резервные клетки в ходе их плоскоклеточной метаплазии непрямого генеза [2]. Процесс интеграции вирусной ДНК в ДНК клетки сопровождается потерей функциональной активности вирусного белка Е2, приводящей к повышению синтеза вирусных белков Е6 и Е7 [3—5], повреждающих, соответственно, ген р53 и ген рRb и исключающих активность опухолевых супрессоров эпителия в фазе G1 [6], что может привести к неконтролируемой клеточной пролиферации.

Целью исследования являлась оценка активности пролиферации и апоптоза цервикального эпителия при различной степени интеграции ВПЧ в ДНК клетки.

Проведен анализ результатов цитологического, иммуноцитохимического, гистологического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического методов исследования эпителия шейки матки 60 ВПЧ-инфицированных женщин от 22 лет до 61 года, находившихся на лечении по поводу цервикальной интраэпителиальной неоплазии в Санкт-Петербургском городском клиническом онкологическом диспансере с октября 2010 г. по май 2011 г.

Цитологические препараты соскобов эктоцервикса и эндоцервикса готовили методом жидкостной цитологии и окрашивали по методу Папаниколау.

Для гистологического исследования использовали материал, полученный при электроэксцизии шейки матки, который фиксировали в 10% растворе формалина, обезвоживали в этиловых спиртах восходящей концентрации, заливали в парафиновые блоки. С помощью микротома готовили срезы толщиной 5—6 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином.

В 20 случаях проводили иммуноцитохимические, в 40 — иммуногистохимические исследования с использованием системы детекции «Ultra Vision LP Detection System HRP Polymer & Dab Plus Chromogen» (TL-015-HD) и моноклональных кроличьих антител к Ki-67 (SP6, RM-9106-SO), к p53 (SP5, RM-9105-SO) производства фирмы «Thermo Scientific для Lab Vision Corporation» (США).

Полученные результаты иммуноморфологических исследований, подсчета митозов и многоядерных клеток оценивали при эктопии и интраэпителиальной неоплазии среди клеток всех слоев МПЭ и метаплазированных резервных клеток, при инфильтративном раке — среди опухолевых клеток.

Заключения результатов цитологических исследований формулировали в соответствии с классификацией The Bethesda System for reporting cervical cytologic diagnoses [7], гистологических исследований — в соответствии с последней редакцией гистологической классификации Всемирной организации здравоохранения [8].

Выявление и генотипирование ДНК ВПЧ в соскобе цервикального канала проводили методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на приборе Rotor Gene («Corbett Research», Австралия) с использованием комплектов реагентов ФГУН ЦНИИЭ.

Физический статус ДНК (эписомная и интегрированная формы) ВПЧ 16-го типа (ВПЧ-16) оценивали по соотношению количества вирусных генов Е2/Е7 с учетом стандартного отклонения и коэффициента вариации [9—11].

Расчет степени интеграции ДНК ВПЧ-16 осуществляли по формуле:

(1 – Е2/Е7)×100%,

где Е2 — число копий гена Е2, Е7 — число копий гена Е7.

Степень интеграции ДНК ВПЧ-16 определяли как низкую (1—33%), умеренную (34—66%), выраженную (67—99%) или полную (100%).

Достоверность различий полученных результатов оценивали на основании критерия Фишера с уровнем значимости p<0,05.

В результате морфологического исследования операционного материала у 3 (5%) женщин диагностирована эктопия шейки матки, у 3 (5%) — слабая (CIN1, LSIL), у 12 (20%) — умеренная (CIN2, HSIL), у 26 (43,4%) — тяжелая форма дисплазии (CIN3, HSIL). Интраэпителиальный рак (CIN3, HSIL, Carcinoma in situ — Ca in situ) и плоскоклеточный рак шейки матки (SCC) верифицированы каждый в 8 (13,3%) случаях.

ВПЧ-16 обнаружен в 42 (70%) случаях, его сочетания с папилломавирусами филогенетической группы (ФГГ) α9 — в 15 (25%), с ФГГ α7 — в 3 (5%) случаях.

По результатам ПЦР эписомная форма вирусной ДНК выявлена у 9 (15%) пациенток. Низкая степень интеграции обнаружена в 33 (55%) случаях, умеренная — в 10 (16,7%), выраженная — в 3 (5%), полная — в 5 (8,3%; таблица).

В отличие от результатов, полученных другими авторами [12], в препаратах эктопии и CIN1 клеток с экспрессией Ki-67 нами не обнаружено. При CIN2 (см. рисунок, а)

Метафазу (см. рисунок, в), телофазу и анафазу (см. рисунок, г) наблюдали в препаратах тяжелой дисплазии при низкой интеграции в 2,6±0,2% атипичных клеток, умеренной — в 1,3±0,1%, полной — в 2,5±0,2%. В случае Ca in situ митозы выявлены при эписомной форме в 2,6±0,2% опухолевых клеток, при низкой степени интеграции — в 3,4±0,2%, при умеренной — в 2,9±0,2%. В случаях SCC митозы обнаружены в 8,2±0,3% клеток рака при низкой и в 7,3±0,3% — при выраженной степени интеграции.

Патологические митозы, представленные к-митозами (см. рисунок, д), наблюдали при SCC в 2,7±0,2% опухолевых клеток при низкой и в 2,8±0,2% — при выраженной формах интеграции ДНК ВПЧ, что составило соответственно 30,6±0,5 и 27,9±0,4% от общего числа всех митозов и было выше данных литературы [15].

Двуядерные койлоциты (см. рисунок, е) — производные нарушения цитотомии, обнаружены во всех наблюдениях эктопии, CIN1, CIN2, в 90,9% случаев тяжелой дисплазии, в 87,5% — Ca in situ, в 66,7% — SCC, соответственно. В 55,9% исследований CIN3 их дополняли трехядерные и более (до 12 ядер) койлоциты. Многоядерные клетки парабазального слоя в препаратах эктопии и CIN1 не выявлены. Их наблюдали в 58,3% случаев CIN2, в 73,1% случаев тяжелой дисплазии, в 62,5% случаев Ca in situ(см. рисунок, ж) и в 87,5% случаев SCC. Численность многоядерных клеток парабазального слоя увеличивалась при эписомной форме ДНК ВПЧ с 16,7±0,4% в препаратах тяжелой дисплазии до 18,9±0,4% при SCC, при низкой интеграции — с 4,4±0,2% при CIN2 до 10,6±0,3% при SCC. В случаях умеренной, выраженной и полной степени интеграции при CIN2 и CIN3 они не обнаружены, а в случаях выраженной и полной интеграции при SCC их количество не превышало 1,2±0,1%.

Экспрессия р53 в 88,9% исследований эписомной формы отсутствовала. Ее выявили только в одном случае SCC в 0,01% опухолевых клеток, что подтверждает опубликованные ранее данные [16]. При низкой интеграции ДНК ВПЧ р53 выявлен в половине случаев CIN1 в 1,5±0,1% атипичных клеток, в 20% случаев CIN2 — в 1,5±0,1% клеток, в 7,1% случаев тяжелой дисплазии — в 0,1±0,03% клеток (см. рисунок, з), в половине наблюдений Ca in situ в 0,6±0,1% опухолевых клеток и в 20% случаев SCC — в 1,1±0,01% клеток рака. При умеренной, выраженной и полной интеграции ДНК ВПЧ экспрессию р53 не наблюдали.

Совместная экспрессия Ki-67 и p53 отмечена при низкой интеграции в 8,3% случаев CIN2, в 7,7% случаях тяжелой дисплазии, в 25% случаях Ca in situ и в 37,5% случаях SCC. Численность клеток с экспрессией Ki-67 превышала численность клеток с p53 при CIN2 в 4,5 раза, при тяжелой дисплазии — в 17,5 раза, при Ca in situ — в 7 раз, при SCC — в 3,4 раза.

В результате анализа результатов проведенных исследований установлено, что частота выявления маркеров пролиферации не связана с выраженностью интеграции ДНК ВПЧ-16. Количество клеток с экспрессией Ki-67, с митозами и с их нарушениями напрямую связано со степенью изменений цервикального эпителия. Экспрессия р53 отмечена лишь при эписомной форме и низкой степени интеграции ДНК ВПЧ-16.