Для лечения метастатического колоректального рака (КРР) наряду с хирургическим удалением опухолевых очагов применяется химиотерапия, что позволяет значительно улучшить прогноз данного заболевания. В настоящее время стандартными схемами лечения являются цитотоксические препараты (оксалиплатин или иринотекан) в комбинации с 5-фторурацилом и лейковорином [1]. Препарат 5-фторурацил блокирует образование тимидилатной кислоты и таким образом синтез ДНК, а лейковорин стабилизирует его связывание с тимидилатсинтазой. Оксалиплатин - цитотоксический препарат, являющийся производным платины, взаимодействует с ДНК, образуя внутри- и межспиральные сшивки, что блокирует ее синтез и последующую репликацию [2]. Иринотекан - цитотоксический препарат из группы камптотецинов, механизм действия которого основан на ингибировании топоизомеразы I, ядерного фермента, поддерживающего и модулирующего структуру ДНК [3]. В ответ на повреждения ДНК в опухолевых клетках происходит индукция апоптоза.

Несмотря на то что применение цитотоксических препаратов значительно улучшило безрецидивную выживаемость пациентов с метастатическим КРР, для повышения эффективности терапии в настоящее время применяются таргетные препараты, как правило, в комбинации со стандартной химиотерапией. Их действие направлено на ингибирование клеточного цикла и путей репарации ДНК, индукцию апоптоза опухолевых клеток [4]. Так, в настоящее время для лечения метастатического КРР применяется таргетный анти-VEGF препарат, представляющий собой моноклональное антитело, связывающееся с сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF) и ингибирующее его активность, подавляющее ангиогенез и таким образом рост и метастатическое прогрессирование опухоли [5]. Кроме того, последние исследования свидетельствуют о его проапоптотической активности, также основанной на блокировании VEGF, который ингибирует внутриклеточные сигнальные пути, запускающие апоптоз [5-7].

Апоптоз, или запрограммированная смерть клеток, наблюдается при различных физиологических и патологических состояниях и играет важную роль в патогенезе опухолей. Апоптоз - это механизм, с помощью которого многие химиотерапевтические средства оказывают цитотоксическое действие на опухолевые клетки. Тем не менее злокачественные клетки приобретают устойчивость к этому механизму воздействия благодаря измененной экспрессии или мутации генов, участвующих в процессе апоптоза. Кроме того, чувствительность опухолевых клеток к цитотоксическим препаратам зависит от баланса между про- и антиапоптотическими молекулами [1].

Про- и антиапоптотические белки, члены семейства Bcl-2, играют основную роль в индукции апоптотического каскада. Проапоптотические белки, регулируемые геном-супрессором опухолевого роста p53, включают Bik, Bak, Bax, PUMA. p53 и Bax являются детерминантами ответа опухолевых клеток на воздействие цитотоксическими препаратами [2, 8]. Высокий уровень экспрессии Bax, сопровождающийся усиленной индукцией апоптоза, коррелирует с эффективностью данных препаратов при раке различной локализации [9]. В исследованиях, проведенных на культурах клеток КРР, показано, что воздействие оксалиплатина и иринотекана приводит к усилению апоптоза, увеличению количества экспрессирующих клеток Bax и p53 [4, 8, 10], а также снижению экспрессии ингибирующих апоптоз Bcl-2 и Bcl-xl [11]. К усиленной экспрессии Bax приводит и воздействие таргетного анти-VEGF препарата [6].

Среди ингибиторов апоптоза, к которым относят Bcl-2, Mcl-1, XIAP, FLIP [6], в аденокарциномах желудочно-кишечного тракта отмечается повышенная экспрессия протоонкогена Bcl-2. Существует большое количество исследований на культурах клеток КРР, демонстрирующих, что повышенная экспрессия Bcl-2 вызывает устойчивость к воздействию цитотоксических препаратов [12].

Одним из регуляторов апоптоза является опухолевый супрессор PML, локализующийся в ядре клетки, иногда в виде макромолекул, получивших название PML-ядерных телец [13-15]. PML контролирует индукцию апоптоза, подавление роста и старение клеток в ответ на онкогенные стимулы и повреждение ДНК [13]. PML обнаруживается в нормальных тканях, но его экспрессия снижается или полностью исчезает в опухолях, причем его количество уменьшается с прогрессией заболевания. Так, по данным C. Gurrieri [13], при КРР он отсутствовал в 65% метастатических очагов в печени и в 44% первичных опухолей. Способность PML контролировать апоптоз клеток, подвергшихся повреждению ДНК или воздействию проапоптотических стимулов, объясняет тот факт, что его исчезновение приводит к развитию опухолей.

Хотя апоптоз является одним из основных механизмов противоопухолевого действия цитотоксических и таргетных анти-VEGF препаратов, существующие публикации посвящены изучению апоптоза под действием этих препаратов либо в эксперименте [7], либо при различных локализациях [6, 16], но не при колоректальном раке. Изучение соотношения экспрессии про- и антиапоптотических белков помогло бы объяснить чувствительность опухолевых очагов к данным препаратам. Выявление прогностических маркеров эффективности химиотерапии тем или иным препаратом является очень важным, так как КРР - гетерогенное заболевание с различными биологическими и клиническими проявлениями. Поэтому в данной работе мы исследовали воздействие цитотоксических и таргетных анти-VEGF препаратов на некоторые механизмы апоптоза.

В исследование включены 84 пациента ФГБУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского» РАМН с метастазами КРР в печени, которым было произведено хирургическое удаление метастатического очага. Из них 35 пациентов (мужчин - 14, женщин - 21; возраст от 27 до 72 лет, медиана возраста - 57 лет) получали предоперационную терапию цитотоксическими препаратами в качестве первой линии.

14 больным (мужчин - 7, женщин - 7; возраст от 46 до 75 лет, медиана возраста - 57 лет) была проведена комбинированная цитотоксическая и таргетная анти-VEGF-терапия также в качестве первой линии. Группу контроля составили 35 пациентов с метастазами в печени (мужчин - 20, женщин - 15; возраст - от 39 лет до 71 года, медиана возраста - 59 лет), у которых химиотерапию не применяли. Было проведено иммуногистохимическое (ИГХ) исследование операционного материала метастазов в печени.

Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (pH 7,4), после проводки на гистопроцессоре образцы заливали в парафин. Для гистологического и ИГХ-исследования изготавливали срезы толщиной 3-4 мкм. Для исследования срезы монтировали на высокоадгезивные предметные стекла (Polysine Slides, «Gerhard Menzel GmbH»). Депарафинирование и ИГХ-исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max, Leica. Использовали первичные антитела к Bax («Santa Cruz Biotechnology», клон B-9; разведение 1:150), PML («Santa Cruz Biotechnology», клон PG-M3; разведение 1:100) и Bcl-2 («Dako», клон 124; разведение 1:200).

Препараты исследовали с помощью световой микроскопии. Интенсивность окрашивания при иммунопероксидазной реакции оценивали полуколичественным методом. Для визуализации изображения использовали цифровую камеру (Leica).

Полученные данные проанализированы с помощью программы Statistica 8.0. Сравнительный анализ выполнен с использованием χ²-критерия Пирсона, точным методом Фишера. Статистическую значимость принимали при p<0,05. Анализ выживаемости проводили методом Каплана-Мейера и Log-rank-тестом.

В нашей работе проведено исследование изменения экспрессии индукторов (Bax, PML) и ингибиторов (Bcl-2) апоптоза под действием различных химиотерапевтических препаратов и в контрольной группе. В метастатических очагах КРР в печени выявлялась цитоплазматическая экспрессия Bax. Тип экспрессии Вcl-2 в позитивных клетках был преимущественно цитоплазматический, в отдельных опухолевых железистых эпителиальных клетках выявлялась более интенсивная реакция в участках цитоплазмы вокруг ядер и окраска ядерных мембран. Для анализа данных типы экспрессии Bax и Bcl-2 были объединены в 2 группы: со сниженной и повышенной экспрессией. Экспрессия PML оценивалась как положительная при выявлении окрашивания 10-50% ядер, а также более 50% ядер, отрицательная - при отсутствии окрашивания ядер опухолевых железистых эпителиальных клеток.

При ИГХ-исследовании экспрессии проапоптотического белка Bax в метастатических очагах в печени пациентов, получавших предоперационную цитотоксическую терапию, а также комбинированную терапию с таргетным анти-VEGF препаратом, выявлено, что в обеих группах не отмечалось случаев отсутствия данного маркера в отличие от группы нелеченых пациентов, в которой у 9% больных экспрессии не обнаружено. Сниженная экспрессия выявлена у 40% (14 случаев) пациентов, получавших терапию цитотоксическими препаратами, у 71% (10 случаев) - комбинированную терапию цитотоксическими и анти-VEGF препаратами, и у 69% (24 случая) пациентов из группы контроля (см. рисунок, а).

Сравнение экспрессии Bax в группе пациентов, получавших терапию цитотоксическими препаратами, с группой нелеченых пациентов показало, что повышенная экспрессия данного маркера достоверно чаще встречалась после проведенной химиотерапии (р=0,01). При сопоставлении содержания данного маркера в метастазах КРР в печени после проведения сочетанной терапии цитотоксическими и таргетным анти-VEGF препаратами с контрольной группой достоверных различий не получено (р=0,5). При этом экспрессия Bax была статистически значимо повышена при проведении только цитотоксической химиотерапии (без анти-VEGF) при сравнении данной группы с группой пациентов, получавших сочетанную химиотерапию (р=0,04).

ИГХ-исследование антиапоптотического белка Bcl-2 выявило его сниженную экспрессию у большинства пациентов, получавших химиотерапевтическое лечение: у 27 (77%) в группе леченных цитотоксическими препаратами и у 11 (79%) человек в группе получавших сочетанную терапию. В то время как в контрольной группе выявлено примерно одинаковое количество пациентов со сниженной и повышенной экспрессией данного маркера (54 и 46% соответственно) (см. таблицу, рисунок, в, г).

Сопоставление экспрессии Bcl-2 в метастазах КРР в печени в группе пациентов, получавших терапию цитотоксическими препаратами, с группой нелеченых пациентов показало, что в первой группе достоверно чаще встречалась его сниженная экспрессия (р=0,04). Сравнительный анализ содержания данного маркера после проведения сочетанной терапии цитотоксическими и таргетным анти-VEGF препаратами с контрольной группой достоверных различий не выявил (р=0,1), так же как и сравнение его экспрессии в двух группах пациентов, получавших химиотерапевтическое лечение (р=0,6).

Нами было проанализировано соотношение экспрессии маркеров Вах/Всl-2 в метастазах КРР в печени. Больные были разделены на 4 группы на основании иммуногистохимических особенностей реакции с антителами к Вах и Bcl-2: Вах(–)/Bcl-2(–), Вах(–)/Bcl-2(+), Вах(+)/Bcl-2(–), Вах(+)/Bcl-2(+). Сравнение соотношения экспрессии Вах/Всl-2 в группах пациентов, получавших химиотерапевтическое лечение, и контрольной группе статистически достоверных различий не выявило. Отмечено лишь, что у пациентов, не проходивших химиотерапию, чаще выявлялось подавление этого пути апоптоза как за счет снижения содержания обоих маркеров (37% случаев), так и вследствие повышенной экспрессии Bcl-2 при сниженной - Bax (34% случаев).

Анализ экспрессии PML в метастазах КРР в печени выявил, что у пациентов, получавших терапию только цитотоксическими препаратами и не проходивших химиотерапевтического лечения, данный маркер не определялся в 57% (20 больных) и 69% (24 больных) случаев соответственно. Воздействие таргетной анти-VEGF терапии привело к уменьшению количества таких случаев до 29%. В группе сравнения установлена положительная экспрессия данного маркера у 31% (12 человек) больных, в группе леченных цитотоксическими препаратами - у 43% (15 человек) пациентов. При добавлении к терапии таргетного препарата отмечено увеличение количества таких случаев до 71% (10 пациентов) (см. таблицу, рисунок, г, д).

Сопоставление экспрессии PML в группе пациентов, подвергшихся терапии цитотоксическими препаратами, с группой пациентов, не получавших химиотерапевтического лечения, статистически значимой разницы не выявило (р=0,22), хотя отмечено некоторое увеличение случаев положительной экспрессии. Напротив, при добавлении к терапии анти-VEGF препарата достоверно чаще выявлялась положительная экспрессия PML по сравнению с группой контроля (р=0,01). При этом сравнение двух групп пациентов, получавших химиотерапевтическое лечение, между собой показало более частое выявление данного маркера при применении сочетанной терапии, хотя статистической достоверности не получено (р=0,06).

Таким образом, в нашем исследовании выявлены отсутствие либо ослабление экспрессии проапоптотических белков Bax и PML и повышенная экспрессия антиапоптотического белка Bcl-2 в метастазах КРР в печени у большинства пациентов, не получавших химиотерапевтического лечения, что свидетельствует о подавлении механизмов, запускающих апоптоз опухолевых клеток. Известно, что экспрессия Bax и PML снижается или полностью исчезает в опухолях, причем их количество уменьшается с прогрессией заболевания. Так, по данным F. Pietrantonio [17], Bax не выявлялся в 51% метастазов КРР в печени, а в исследовании C. Gurrieri [13] PML отсутствовал в 65% метастатических очагов в печени и в 44% первичных опухолей. Экспрессия ингибитора апоптоза Bcl-2, напротив, усиливается уже на ранних стадиях развития КРР [12].

Терапия цитотоксическими препаратами привела к статистически значимому увеличению экспрессии активатора апоптоза Bax, снижению содержания ингибитора апоптоза Bcl-2 и небольшому повышению экспрессии PML, контролирующего индукцию апоптоза, т.е. цитотоксические препараты активируют апоптоз опухолевых клеток в метастазах КРР в печени. Исследования, посвященные влиянию изучаемых нами химиотерапевтических препаратов на данные маркеры апоптоза при КРР in vivo, в литературе не представлены. Тем не менее наши данные согласуются с результатами других авторов, полученными на культурах клеток КРР, в которых показано, что воздействие оксалиплатина и иринотекана приводит к увеличению количества экспрессирующих клеток Bax и усилению апоптоза [4, 8, 10], а также снижению экспрессии ингибиторов апоптоза Bcl-2 и Bcl-xl [11].

Исследование активатора апоптоза Bax в метастазах в печени пациентов, получавших сочетанную терапию, продемонстрировало, что его содержание было практически таким же, как и в контрольной группе, т.е. таргетный анти-VEGF препарат не оказывал на него никакого влияния. Анализ экспрессии ингибитора апоптоза Bcl-2 после проведения сочетанной цитотоксической и анти-VEGF-терапии показал снижение его содержания по сравнению с группой контроля, хотя статистически достоверной разницы не получено, возможно, из-за малочисленности группы леченых пациентов. Добавление к цитотоксической терапии анти-VEGF препарата привело к более частой положительной экспрессии PML, участвующего в индукции апоптоза, по сравнению с группой контроля и группой пациентов, получавших только цитотоксическую химиотерапию. В литературе нам не удалось найти данных о влиянии таргетных анти-VEGF препаратов на экспрессию данных участников апоптоза в эпителиальных опухолях. Лишь в исследованиях J. Bogusz (2013), проведенных на культуре клеток неэпителиальной опухоли, получены иные данные, свидетельствующие о том, что воздействие таргетного анти-VEGF препарата приводит к усиленной экспрессии Bax [6].

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о подавлении механизмов, запускающих апоптоз опухолевых клеток в метастазах КРР в печени у пациентов, не получавших химиотерапевтического лечения, в результате снижения экспрессии проапоптотических белков Bax и PML и повышения содержания антиапоптотического белка Bcl-2. Цитотоксические препараты активируют апоптоз опухолевых клеток в метастазах КРР в печени, достоверно увеличивая экспрессию активатора апоптоза Bax и снижая содержание ингибитора апоптоза Bcl-2, а также несколько повышая экспрессию PML, контролирующего индукцию апоптоза. Сочетанная терапия цитотоксическими и анти-VEGF препаратами не оказала статистически значимого влияния на Bax и Bcl-2, но также привела к усилению апоптоза опухолевых клеток за счет увеличения экспрессии индуктора апоптоза PML. Понимание механизмов элиминации опухолевых клеток путем апоптоза под действием химиотерапевтических препаратов позволит объяснить степень их эффективности и выявить маркеры для определения чувствительности к тем или иным препаратам.

Работа выполнена в рамках проекта, поддержанного Российским фондом фундаментальных исследований, №14-04-00844.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.М.П., М.И.С.

Сбор и обработка материала: Е.М.П., М.И.С., Д.Н.Ф., О.Г.С.

Статистическая обработка данных: М.И.С.

Написание текста: Е.М.П.

Редактирование: О.Г.С.