Введение

Апоптоз представляет собой эволюционно-защитную форму физиологической гибели клеток, необходимую для обновления тканей и поддержания гомеостаза организма, а также клеток сосудистой стенки. К основным путям запуска системы апоптоза относят митохондриальный и рецепторный. Одним из основных представителей митохондриального пути апоптоза является антиапоптотический белок Bcl-2, который, связываясь с проапоптотическим белком Bax, уменьшает выброс цитохрома C в цитозоль с последующей активацией каспаз [1]. Другим механизмом в запуске системы апоптоза является рецепторный путь, который представляет собой взаимосвязь Fas-рецептора с Fas-лигандом (FasL). При этом нужно отметить, что существует растворимая форма Fas-рецептора (sFas), которая препятствует активации данного пути апоптоза [2].

Нарушения в системе регуляции апоптоза могут лежать в основе патогенеза атеросклероза и его осложнений [3, 4]. Однако причины и механизмы реализации системы апоптоза до конца не изучены.

Оксид азота (NO) как высокореактивная молекула играет существенную роль в регулировании многих биологических явлений в эндотелии сосудистой стенки [5].

Существующие в литературе исследования рассматривают NO с позиции его воздействия на воспалительные медиаторы и показатели свертывающей системы крови как поглотителя свободных радикалов, предотвращающего клеточные повреждения в результате ишемии-реперфузии [6]. В настоящее время многие исследователи рассматривают NO, в том числе, в качестве регулятора системы апоптоза. Так, в гладкомышечных клетках (ГМК) сосудистой стенки NO может вызвать апоптоз, активируя K+ каналы, приводя к оттоку и цитозольной потере K+. В некоторых исследованиях показано, что именно цГМФ-зависимый путь является ключевым механизмом, с помощью которого NO индуцирует апоптоз клеток. Кроме того, ряд авторов указали на важность сигнального пути протеинкиназы C и регуляции активности связывания NF-kB для активации апоптоза через NO [7—9].

Экспериментально было установлено, что вышеперечисленные механизмы запуска запрограммированной клеточной гибели NO приводят к активации маркеров апоптоза Bax, р53 и FasL в клетках сосудистой стенки [10, 11]. Однако работ, посвященных динамике и взаимосвязи маркеров апоптоза и NO после гибридных интервенций, а также их роли в развитии рестеноза зоны реконструкции, мы не встретили, анализируя базы данных Pubmed, Elibrary, Scopus и др.

Цели исследования:

1. Комплексная оценка маркеров апоптоза и метаболитов оксида азота у пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей (ОААНК) после гибридных интервенций.

2. Оценка влияния исследуемых показателей на развитие рестеноза зоны реконструкции в послеоперационном периоде.

Материал и методы

Исследование включало 30 пациентов с ОААНК IIБ—III ст. (IIБ — 14 (46,6%), III — 16 (53,4%)), которым проводили гибридные операции.

Возраст пациентов составил 68,3±4,2 года, в гендерном составе преобладали мужчины — 22 (73,3%).

Критерии исключения: возраст пациентов до 40 лет, декомпенсированная сопутствующая патология, ранее выполненные оперативные вмешательства и отказ от участия в исследовании.

Контрольная группа составила 20 здоровых добровольцев. Средний возраст — 62,3±2,5 года, доля мужчин — 75% (15 человек). Сопоставимость исследуемых групп гарантирована по следующим признакам: возраст, гендерный состав, сопутствующая патология (p>0,05).

Сопутствующие заболевания у пациентов с ОААНК: гипертоническая болезнь (69,2%), ишемическая болезнь сердца (50%), хронический бронхит (44,1%), постинфарктный кардиосклероз (19,2%).

Виды проведенных гибридных оперативных вмешательств представлены в таблице. Следует уточнить, что при выполнении проксимального анастомоза бедренно-подколенных либо перекрестных бедренно-бедренных шунтирующих операций выполняли эндартерэктомию из общей бедренной артерии в связи с гемодинамически значимой бляшкой в ее просвете.

Ангиографическая оценка поражения артериального бассейна нижних конечностей

Примечание. ОПА — общая подвздошная артерия, НПА — наружная подвздошная артерия, ПБА — поверхностная бедренная артерия, ПкА — подколенная артерия.

В данном исследовании проводили определение в сыворотке крови показателей апоптоза (sFas и Bcl-2) и дисфункции эндотелия (NO). Сроки определения показателей: перед операцией, в первые часы после операции, на 1, 7, 14, 21 и 30-е сутки после операции. Метод определения Bcl-2 — иммуноферментный анализ с использованием реактивов Human Bcl-2 ELISAKit (Thermo Fisher Scientific, США), sFas — Invitrogene Thermo Fisher (США), NO — StatFax 3200 (Awareness Technolog, Inc.).

Контрольные осмотры были проведены через 1 и 1,5 года после операции. Производили физикальный осмотр и дуплексное сканирование. За рестеноз зоны реконструкции принимали гемодинамически значимый стеноз ≥50% в зоне ранее проведенного вмешательства.

Корреляционно-регрессионный анализ полученных результатов проводили с использованием программы SPSS (IBM company, США). Для нахождения точки cut-off (значения маркеров, отклонения от которых ассоциируются с риском рестеноза зоны вмешательства) использовали ROC-анализ. Уровень статистической значимости: p<0,05. Мощность исследования: β=0,8.

Результаты

Исходные значения исследуемых показателей у пациентов с ОААНК: NO — 235,9±32,8 ммоль/л, Bcl-2 — 4,3±0,71 нг/мл, что ниже относительно значений у здоровых добровольцев: NO — 342,3±41,5 ммоль/л (p<0,01), Bcl-2 — 5,3±0,66 (p<0,01) нг/мл. Значения маркера sFas (0,91±0,1 нг/мл) были сопоставимы со значениями здоровых добровольцев (1,1±0,17 нг/мл, p=0,674).

В первые часы после операции у пациентов с ОААНК снизилось количество маркера Bcl-2 до 2,0±0,94 нг/мл (p<0,01). Значения других показателей достоверно не изменились в сравнении с исходным уровнем и составили: sFas — 0,77±0,24 нг/мл (p=0,208), NO — 217,7±52,3 ммоль/м (p=0,07).

К концу 1-х суток количество NO снизилось до 151,8±54,2 ммоль/л (p<0,01) по сравнению с количеством в первые часы после операции. Значения показателей Bcl-2 и sFas в указанный промежуток времени не отличались от значений в первые часы.

На 7-е сутки наблюдали повышение показателя Bcl-2 до 3,97±1,0 нг/мл (p<0,01), NO — до 179,2±43,8 (p=0,008) ммоль/л относительно значений на 1-е сутки. Количество sFas составило 0,87±0,24 нг/мл (p=0,253) и значимо не изменилось в указанный промежуток времени.

На 14-е сутки показатель NO достиг пиковых значений (281,3±58,4 ммоль/л, p<0,01) при незначимом снижении Bcl-2 (3,70±1,1 нг/мл, p=0,175) и sFas (0,78±0,21 нг/мл, p=0,233) относительно значений на 7-е сутки.

На 21-й день отмечено уменьшение sFas до 0,45±0,18 нг/мл (p<0,01) по сравнению с 14-ми сутками.

К концу первого месяца повысились значения маркера sFas до 0,91±0,31 нг/мл (p<0,01) при снижении NO до 216,9±41,5 ммоль/л (p<0,01). Значения Bcl-2 не изменились в сравнении со значениями на 21-е сутки (рис. 1—3).

Рис. 1. Изменения значений маркера апоптоза Bcl-2 в послеоперационном периоде.

Рис. 2. Изменения значений маркера апоптоза sFas в послеоперационном периоде.

Рис. 3. Изменения значений метаболитов оксида азота в послеоперационном периоде.

Первичная проходимость зоны реконструкции через 12 [10; 13] мес составила 70%. У 9 (30%) пациентов в указанный срок развился рестеноз зоны реконструкции. По сопутствующей патологии, исходному ангиологическому статусу и проведенному типу операции эти пациенты не отличались от пациентов без рестеноза зоны реконструкции (p>0,05). У пяти из девяти пациентов была выявлена посттромботическая окклюзия бедренно-подколенного шунта на фоне рестеноза в области дистального анастомоза. При этом зона стентированного сегмента в подвздошных артериях и подколенно-берцовый сегмент были проходимы по данным допплерографии. У всех пяти пациентов была выявлена III ст. заболевания согласно классификации А.В. Покровского-Фонтейна, проведено бедренно-подколенное решунтирование выше щели коленного сустава с компенсацией кровообращения. У четырех пациентов после гибридного вмешательства (стентирование НПА с бедренно-подколенным шунтированием) были обнаружены критические стенозы в НПА до 80%. После дообследования пациентам выполнено повторное стентирование пораженного сегмента (НПА). При контрольной аортоартериографии остаточный стеноз после вмешательства составил менее 30%.

При сравнении значений исследуемых показателей было отмечено, что у пациентов с рестенозом зоны реконструкции после операции в первые часы было выражено снижение маркера Bcl-2 (p=0,002), на 1-е сутки — Bcl-2 (p=0,0002) и NO (p=0,002), к концу 1-го месяца — NO (p=0,02). На 7-е сутки у пациентов без рестеноза было повышено количество Bcl-2 (p<0,01) и NO (p<0,01), на 14-е сутки — NO (p<0,01), на 21-е сутки снижено значение sFas (p=0,01) относительно значений у пациентов без данного осложнения (рис. 4, 5).

Рис. 4. Сравнение значений метаболитов оксида азота у пациентов с рестенозом и без рестеноза в зоне вмешательства.

Рис. 5. Сравнение значений маркеров апоптоза Bcl-2 и sFas у пациентов с рестенозом и без рестеноза в зоне вмешательства.

Корреляционный анализ показал, что у пациентов с рестенозом зоны реконструкции наблюдается прямая взаимосвязь между количеством NO и Bcl-2 на 1-е сутки (r=+0,769, p=0,015). У пациентов без данного осложнения отмечена прямая корреляционная взаимосвязь между NO и Bcl-2 на 7-е сутки (r=+0,584, p=0,005), обратная зависимость между NO и sFas (r= –0,62, p=0,003) на 14-е сутки, NO и sFas (r= –0,633, p=0,002) на 21-е сутки.

ROC-анализ свидетельствует, что пороговое значение маркера Bcl-2 в точке cut-off составляет 1,87 нг/мл. При количестве Bcl-2 на первые часы после операции равном или ниже порогового значения прогнозируем рестеноз зоны реконструкции. Чувствительность (Se) и специфичность (Sp) метода — 58,8 и 88,9% соответственно. Диагностическая эффективность метода — 76,6% (рис. 6).

Рис. 6. Зависимость значений маркера Bcl-2 в первые часы после операции и рестеноза зоны реконструкции.

В отношении метаболитов NO на 14-е сутки после операции пороговое значение, которое ассоциируется с развитием рестеноза зоны вмешательства, составило ≤240,4 нг/мл (Se и Sp метода — 88,8 и 100% соответственно). Диагностическая эффективность метода — 96,6% (рис. 7).

Рис. 7. Зависимость значений метаболитов оксид азота на 14-е сутки после операции и развития рестеноза зоны реконструкции.

Для маркера sFas на 21-е сутки после операции пороговое значение в точке cut-off составило ≥0,82 ммоль/л (Se и Sp метода — 88,8 и 71,4% соответственно). Диагностическая эффективность метода — 76,6% (рис. 8).

Рис. 8. Влияние значений sFas на 21-е сутки после операции на развитие рестеноза зоны реконструкции.

Обсуждение

Несмотря на достижения в технике и технологиях оперативных вмешательств на магистральных артериях нижних конечностей, рестеноз продолжает оставаться наиболее частой причиной неудовлетворительных результатов реконструктивно-восстановительных вмешательств в отделенном послеоперационном периоде. В настоящее время остается много нерешенных вопросов касательно патофизиологических механизмов, лежащих в основе развития данного осложнения. В моделях на животных (крысы, кролики, свиньи) с помощью моделирования баллонной ангиопластики либо различных видов обходных шунтирующих вмешательств была доказана превалирующая роль системы апоптоза и дисфункции эндотелия в патогенезе атеросклеротического поражения сосудистой стенки и его осложнений. Так, C.D. Leville и соавт. [12] показали, что применение трансретиноевой кислоты приводило к снижению пролиферации клеток при увеличении количества маркеров апоптоза в зоне гиперплазии неоинтимы венозных шунтов в течение первой недели после операции, способствуя уменьшению рестеноза зоны реконструкции. В результате отдельных исследований удалось обнаружить проапоптотический белок p53 в небольшом количестве в образцах сосудистой стенки с зоной рестеноза после проведенных операций. Авторы пришли к выводу, что повышенное количество белка p53 приводит к уменьшению толщины гиперплазии неоинтимы до 80% за счет снижения включения тимидина в пролиферирующие ГМК неоинтимы [13]. В свою очередь, M. Sata и соавт. [14] показали, что аденовирусная доставка проапоптотического маркера FasL в сосудистую стенку приводит к уменьшению рестеноза после баллонной ангиопластики за счет подавления воспалительной реакции в области травмы. Интересен факт, что NO, высвобождаемый из ГМК, способствует экспрессии Fas-рецептора [15]. FasL может оказывать протективное воздействие на клетки эндотелия, ослабляя при этом ишемически-реперфузионные повреждения после запуска кровотока. Таким образом, можно сделать вывод, что FasL ингибирует воспалительные реакции в стенке сосуда, выполняя атеропротективную функцию. С другой стороны, изменения в экспрессии FasL и Fas могут быть признаком дисфункции эндотелия.

В ходе нашего исследования было показано, что гибридное оперативное вмешательство приводит к активации системы апоптоза. Причем в первые часы и сутки после вмешательства запускается преимущественно митохондриальный путь, что выражается в снижении антиапоптотического маркера Bcl-2. Это может быть обусловлено тем, что при выполнении шунтирующих вмешательств совместно с баллонной ангиопластикой/стентированием артерий нижних конечностей происходит повреждение клеток всех слоев артериальной стенки, а маркеры именно митохондриального пути вырабатываются и оказывают свое воздействие как на эндотелиальные, так и на ГМК сосудистой стенки. Помимо этого к запуску системы апоптоза приводит выброс провоспалительных цитокинов, а также окислительный стресс, что наиболее выражено в первые часы после операции.

Активированная система апоптоза клеток ведет к их гибели и, следовательно, уменьшению медиаторов, которые эти клетки вырабатывают. Это приводит к значимому снижению метаболитов NO к концу 1-х суток, что подтверждено данными корреляционного анализа.

На 7-е сутки наблюдается возвращение к исходным значениям показателей двух путей гибели клеток, что свидетельствует об окончании первой волны апоптоза. Успешно проведенное оперативное вмешательство устраняет турбулентные потоки и ведет к появлению ламинарного кровотока. На этом фоне с конца 1-х суток происходит постепенное повышение метаболитов оксида азота до максимальных значений на 14-е сутки, что, на наш взгляд, способствует запуску второй волны апоптоза в пролиферирующих клетках. Погибшие клетки артериальной стенки в результате апоптоза за счет высвобождения цитокинов усиливают ответную пролиферацию клеток из медии в интиму для преодоления клеточного дефицита. На экспериментальных моделях K. Walsh и соавт. [16] было доказано, что именно запуск второй волны апоптоза ограничивает пролиферацию клеток сосудистой стенки, чтобы предотвратить формирование гиперплазии неоинтимы. Активация рецепторного пути апоптоза во вторую волну, выражающаяся в снижении ингибитора данного пути — sFas, связана с тем, что, в отличие от ГМК, эндотелиальные клетки устойчивы к Fas-опосредованному апоптозу за счет синтеза ими белка FLIP, ингибирующего активацию системы апоптоза. Данный путь апоптоза запускается в пролиферирующих ГМК формирующейся гиперплазии неоинтимы, при этом не препятствуя восстановлению эндотелия в зоне операционной травмы сосудистой стенки. Выявленная корреляционная взаимосвязь между NO и sFas как на 14, так и на 21-е сутки дает возможность предположить, что именно NO является одним из индукторов второй волны апоптоза, который и ограничивает пролиферацию клеток сосудистой стенки в ответ на операционную травму.

Пациенты с рестенозом зоны реконструкции через 12 [10; 13] мес имели более выраженное снижение маркера Bcl-2 в сравнении с первыми часами и первыми сутками после операции. Это приводит к значительной гибели клеток сосудистой стенки и, следовательно, меньшему повышению метаболитов оксида азота на 7 и 14-е сутки, несмотря на успешно выполненное оперативное вмешательство. На наш взгляд, незначительное повышение NO не смогло привести к запуску второй волны апоптоза, направленной на ограничение компенсаторного пролиферативного процесса, что выражалось в повышенном количестве sFas на 21-е сутки.

К ограничениям работы следует отнести малый размер выборки, а также то, что пока исследованы показатели апоптоза и дисфункции эндотелия в сыворотке крови, но необходимо изучить их экспрессию во всех слоях сосудистой стенки с помощью иммуногистохимического метода. Также необходимо проанализировать взаимосвязь исследуемых показателей с маркерами пролиферации клеток, такими как тромбоцитарный фактор роста ВВ и эндотелиальный фактор роста не только у пациентов после гибридных вмешательств, но и после открытых и эндоваскулярных операций.

Заключение

1. Гибридное оперативное вмешательство ведет к активации маркеров различных путей апоптоза в послеоперационном периоде, оказывающих воздействие на дисфункцию эндотелия.

2. Значения маркеров Bcl-2≤1,82 нг/мл в первые часы, NO≤240,4 мкмоль/мл на 14-е сутки и sFas≥0,82 нг/мл на 21-е сутки после гибридных вмешательств ассоциируются с риском рестеноза зоны реконструкции.

Этика. Одобрено этическим комитетом РязГМУ им. И.П. Павлова (протокол №7 от 03.03.20).

Финансирование. Работа выполнена при поддержке исследовательского гранта Президента Российской Федерации (№МК-1214.2022.3).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.