Введение

Липопротеид(а) [Лп(а)] является генетически детерминированным фактором риска атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний (АССЗ) и в повышенных концентрациях ассоциируется с сердечно-сосудистыми осложнениями (ССО) у лиц, уже находящихся на оптимальной гиполипидемической терапии [1]. Помимо традиционных факторов риска, Лп(а) и богатые триглицеридами липопротеиды как возможные активаторы локального воспаления в сосудистой стенке могут играть ключевую роль в прогрессии АССЗ, причем независимо от уровня холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС ЛНП) [2, 3].

Локус гена LPA объясняет до 90% вариации концентрации Лп(а), преимущественно за счет количества повторов участка, кодирующего одну из крингловых структур молекулы апо(а). Этот крингл характеризуется высокой степенью гомологии первичной структуры с IV кринглем молекулы плазминогена. Обратная взаимосвязь между размером апобелка(а) и концентрацией Лп(а) не является абсолютной и модифицируется различными полиморфизмами, что в свою очередь приводит к широкой вариабельности концентрации Лп(а) даже при наличии одинаковой изоформы [4]. Несмотря на то что вклад изоформ апо(а) в высокую атеротромбогенность Лп(а) обсуждается давно, этот вопрос остается открытым. Выявленная недавно связь провоспалительных и проатерогенных свойств окисленных фосфолипидов с аллель-специфическими уровнями Лп(а) у здоровых взрослых и детей [5] позволяет предположить, что наличие у человека низкомолекулярного (НМ) фенотипа апо(а) может оказаться дополнительным к повышенной концентрации Лп(а) фактором риска развития сердечно-сосудистых событий. Так, НМ-фенотип апо(а) ассоциируется с тяжелым коронарным атеросклерозом и инфарктом миокарда у пациентов с концентрацией Лп(а) >50 мг/дл, особенно в возрасте до 50 лет [6].

Полученные в последние годы результаты позволяют предполагать, что Лп(а) может являться активатором клеток неспецифического иммунитета [7], в частности нейтрофильных гранулоцитов (нейтрофилов). Как показали экспериментальные и клинические исследования [8, 9], активация нейтрофилов, сопровождающаяся синтезом широкого спектра медиаторов воспаления и тромбообразования, может играть первостепенную роль в дестабилизации атеросклеротических бляшек, прогрессировании АССЗ и развитии тромботических осложнений [10]. В настоящее время больше внимания уделяется изучению нетоза, представляющего собой способ гибели нейтрофилов с образованием внеклеточных сетей из хроматина с включением белков ядра, цитоплазмы и гранул [11]. Образующиеся нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ) обладают токсическими, провоспалительными и протромбогенными свойствами.

Цель исследования — оценить in vitro пронетотическую активность Лп(а), а также изучить взаимосвязь между уровнем Лп(а) и количеством нейтрофилов в крови у больных с ранним дебютом ишемической болезни сердца (ИБС) и повторными эпизодами нефатального инфаркта миокарда (ИМ).

Материал и методы

Данное исследование состояло из экспериментальной и клинической частей. В работе была использована ранее собранная коллекция фрагментов интимы коронарных артерий человека, включающих липофиброзные поражения, удаленных в ходе операций эндартерэктомии у пациентов с ИБС (отдел сердечно-сосудистой хирургии Научно-исследовательского института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии им. акад. Е.И. Чазова» Минздрава России) [12]. Фрагменты замороженных образцов атеросклеротических бляшек массой около 10 мг гомогенизировали в фосфатно-солевом буфере (pH=7,4), содержащем смесь ингибиторов протеиназ P2714 («Sigma», США), с помощью гомогенизатора MT-30K («Miulab», Китай). Гомогенаты центрифугировали 20 мин при 13 400 g и 4 °С. Супернатант замораживали и хранили при –45 °С. Содержание эластазы в гомогенатах определяли методом иммуноферментного анализа с помощью набора ELISA Kit for Elastase 2, Neutrophil («Cloud-Clone Corp», Китай). Содержание Лп(а) в гомогенатах, а также в образцах плазмы и сыворотки крови человека определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа [13]. Общий белок определяли по методу Бредфорда, калибровку строили по препарату раствора альбумина (Протеин-Ново, «Вектор-Бест», Россия). Концентрацию Лп(а) и эластазы в бляшках пересчитывали на 1 мг общего белка.

В культуре нейтрофильных гранулоцитов, выделенных из крови здоровых доноров, была изучена способность Лп(а) активировать клетки. Для получения нейтрофильных гранулоцитов образцы крови доноров в цитратном антикоагулянте наслаивали на двойной градиент плотности стерильных растворов фиколла-верографина («ПанЭко», Россия) в соответствии с протоколом¹. Клетки ресуспендировали в среде X-vivo («Lonza», США) с добавлением 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, по 50 Ед/мл пенициллина и стрептомицина, смеси неэссенциальных аминокислот («Thermo Fisher Scientific», США) и 1% аутологичной сыворотки и высаживали в планшеты, предварительно покрытые полилизином («Sigma-Aldrich», Германия).

В культуру клеток вносили препараты Лп(а) до конечной концентрации 100 мкг/мл; триглицерид-богатые липопротеиды (ТБЛ) (3,3 мкмоль/мл ХС), в контрольные образцы (позитивный контроль) вносили 50 нмоль/л форболмиристатацетата («Sigma-Aldrich», Германия). Формирование НВЛ наблюдали в течение 3 ч при 37 °С в атмосфере 5% CO₂. Клетки фиксировали формалином при комнатной температуре и окрашивали ДНК-красителем DAPI («Thermo Fisher Scientific», США). Образцы анализировали с помощью флюоресцентной микроскопии (LEICA CTR5000, Nikon TI-2).

В клиническую часть исследования — продольное исследование с ретроспективным сбором данных — были включены 90 пациентов в возрасте 60±9 лет с ранним дебютом ИБС через ИМ (у мужчин до 55 лет, у женщин до 65 лет). Для всех пациентов был собран анамнез, выполнен клинический анализ крови с определением лейкоцитарной формулы, проведены измерения липидного профиля и концентрации Лп(а), определен фенотип апобелка(а). Сведения о ССО, включающих нефатальный ИМ, за период наблюдения после манифестации ИБС были получены из анализа медицинской документации. Из исследования были исключены пациенты с тяжелыми сопутствующими заболеваниями, влияющими на прогноз: хронической почечной/печеночной недостаточностью, злокачественными новообразованиями, аутоиммунными и инфекционными заболеваниями (вирус иммунодефицита человека, гепатиты B и C), психическими отклонениями, злоупотреблением алкоголем, а также с отказом от участия в исследовании. Кроме того, из исследования были исключены пациенты, находившиеся в период наблюдения на терапии, влияющей на концентрацию Лп(а) (ингибиторы PCSK9, аферез липопротеидов), и пациенты с уровнем Лп(а), не позволяющим провести фенотипирование апобелка(а) (<4 мг/дл).

Протокол исследования был одобрен независимым Этическим комитетом клинических исследований ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии им. акад. Е.И. Чазова» Минздрава России (НМИЦ кардиологии им. акад. Е.И. Чазова), протокол №251 от 25.11.19. Ретроспективно из медицинской документации при первичной госпитализации на момент дебюта ИБС для всех 90 пациентов собраны показатели липидного спектра. Концентрация Лп(а), результаты анализа крови с лейкоцитарной формулой были доступны только для 45 пациентов.

Клинический анализ крови проводился на приборе Cell-Dyn 3700 («Abbott», США) в отделении клинической лабораторной диагностики НМИЦ кардиологии им. акад. Е.И. Чазова. Концентрацию показателей липидного спектра (общий холестерин (ОХС), триглицериды (ТГ), холестерин липопротеидов высокой плотности (ХС ЛВП) в сыворотке крови измеряли ферментативным колориметрическим методом с использованием реактивов Биокон на приборе Multiskan Go («Thermo Fisher Scientific», США), ХС неЛВП рассчитывали по формуле: ХС неЛВП = ОХС – ХС ЛВП, ммоль/л. Уровень ХС ЛНП (ммоль/л) рассчитывали по формуле Мартина—Хопкинса [14]. Ремнантный холестерин, отражающий содержание ТБЛ, рассчитывали по формуле РемнантХС = ОХС – ХС ЛНП – ХС ЛВП. Уровень корригированного ХС ЛНП (ХС ЛНП_корр), учитывающего ХС, входящий в состав частицы Лп(а), рассчитывали согласно формуле: ХС ЛНП_корр = ХС ЛНП – 0,3 · Лп(а)/38,7, ммоль/л, где концентрация Лп(а) в мг/дл.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ MedCalc 15.8 (Остенде, Бельгия). Применялись стандартные методы статистического анализа: тест Колмогорова—Смирнова, Краскела—Уоллиса, критерий Манна—Уитни, критерий χ², корреляционный анализ по Спирмену и Пирсону. Для оценки взаимосвязей исследуемых показателей с ССО использовали многофакторный логистический регрессионный анализ, анализ выживаемости с применением кривых Каплана—Мейера и модели пропорциональных рисков Кокса. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

В гомогенатах атеросклеротических бляшек содержание апо(а) составляло 0,04 [0,02—0,06] мг/мг белка, а эластазы нейтрофилов — 20,7 [4,4—38,3] нг/мг белка (данные представлены как медиана и интерквартильный размах). Была обнаружена положительная связь между концентрацией Лп(а) и содержанием нейтрофильной эластазы (r=0,54, p=0,0005). В первичной культуре нейтрофилов, выделенных из крови здоровых доноров, в отсутствие стимуляторов морфология клеток не менялась. В присутствии форболмиристатацетата >90% клеток в течение 3 ч образовывали НВЛ. При добавлении Лп(а) в конечной концентрации 100 мкг/мл также наблюдали формирование НВЛ — в нетоз вступало 65% [50—70%] клеток (данные представлены как медиана и минимум-максимум). При добавлении фракции ТБЛ обнаруживались только единичные нетозы (рис. 1).

Рис. 1. Активация нейтрофильных гранулоцитов в культуре в отсутствие стимуляторов (а) в контроле, присутствии (б) 50 нМ форболмиристатацетата (PMA), (в) Лп(а) 100 мкг/мл и (г) ТБЛ 3,3 мкмоль/мл по ХС.

Ув. 400, краситель DAPI. Приведены данные одного из трех экспериментов.

Включенные в клиническую часть исследования пациенты перенесли первый ИМ в возрасте 45±6 лет для мужчин и 51±6 лет для женщин. Все больные были разделены на две группы в зависимости от исходной концентрации Лп(а): более (n=70) или менее (n=20) 30 мг/дл.

Группы не отличались по клинико-лабораторным показателям в момент как включения в исследование, так и манифестации ИБС (табл. 1).

Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика больных в момент включения в исследование (follow up) и при манифестации ИБС

Примечание. ХС ЛНП_корр — холестерин липопротеидов низкой плотности, корригированный по уровню липопротеида(а). Данные представлены как n (%), среднее ± стандартное отклонение или медиана [интерквартильный разброс]; * — p<0,05.

В общей когорте пациентов не выявлено значимых взаимосвязей между концентрацией Лп(а) и содержанием нейтрофильных гранулоцитов крови как на момент включения в исследование, так и при манифестации ИБС (r=0,017, p=0,9 и r=0,024, p=0,8). Также не отмечено корреляционных взаимосвязей между содержанием нейтрофильных гранулоцитов и другими показателями липидного профиля, за исключением ремнантного ХС, отражающего содержание ТБЛ, как при наблюдении, так и при манифестации ИБС (r=0,23; p=0,03 и r=0,40; p=0,006). При этом данная зависимость была характерна только для пациентов, имевших концентрацию Лп(а) ≥30 мг/дл (r=0,30; p=0,01 и r=0,47; p=0,004). Как в момент манифестации ИБС, так и при включении в исследование содержание нейтрофилов в крови значимо различалось в зависимости от содержания ТБЛ только у пациентов с Лп(а) ≥30 мг/дл (рис. 2).

Рис. 2. Содержание нейтрофилов в крови (млн/мл) при (а) манифестации ИБС и (б) включении в исследование в подгруппах пациентов в зависимости от концентрации Лп(а) и уровня ремнантного ХС больше или меньше медианы.

При манифестации медиана (Me) ремнантного ХС составила 0,63 ммоль/л, при включении в исследование — 0,56 ммоль/л.

С момента манифестации ИБС до включения в исследование, несмотря на проводимое лечение, у 29 пациентов развился повторный нефатальный ИМ.

Концентрация Лп(а) (89 [43; 160] мг/дл против 67 [27; 101] мг/дл, p=0,07), но неремнантного ХС (0,58 [0,45; 0,70] ммоль/л против 0,57 [0,44; 0,70] ммоль/л, p=0,98), была достоверно выше у пациентов, перенесших повторный ИМ. При анализе кривых выживаемости Каплана—Мейера повторный ИМ наступал раньше у больных с повышенной концентрацией Лп(а) или НМ фенотипом апо(а) (табл. 2).

Таблица 2. Выживаемость без инфаркта миокарда в зависимости от уровня Лп(а) или фенотипа апо(а)

Примечание. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, в скобках указан доверительный интервал (ДИ). ^# — p<0,1; * — p<0,05; ** — p<0,005.

Анализ выживаемости пропорциональных рисков Кокса, основанный на клинических данных, собранных ретроспективно, показал, что при увеличении концентрации Лп(а) на 1 мг/дл риск повторного нефатального ИМ увеличивался на 0,5% (отношение рисков (ОР) 1,005; 95% ДИ 1,001—1,010; p=0,02) с поправкой на пол и возраст манифестации ИБС. При введении в ту же модель концентрации ремнантного ХС риск возрастал уже на 0,6% при увеличении концентрации Лп(а) на 1 мг/дл (ОР 1,006; 95% ДИ 1,002—1,011; p=0,008). Однако разделение по уровню Лп(а) с границей отсечения 30 мг/дл демонстрировало только тенденцию к увеличению ассоциированного с ним риска (рис. 3, а). Наличие у пациента НМ фенотипа апобелка(а) приводило к увеличению риска повторного ИМ в 2,6 раза (ОР 2,6 (1,1—5,8); p=0,02) (рис. 3, б). И концентрация Лп(а), и фенотип апо(а) являлись независимыми факторами риска повторного ИМ, что было продемонстрировано при одновременном введении в модель и концентрации Лп(а) (ОР 1,01 (1,00—1,01); p=0,04), и фенотипа апо(а) (ОР 2,28 (1,00—5,20); p=0,05).

Рис. 3. Кривые выживаемости без повторного инфаркта миокарда с поправкой на пол и возраст манифестации в зависимости от повышенной концентрации Лп(а) (а) или фенотипа апо(а) (б).

ВМ — высокомолекулярный, НМ – низкомолекулярный.

Содержание нейтрофилов у пациентов с эпизодом повторного нефатального ИМ было достоверно выше при первичной госпитализации в момент манифестации ИБС (5,2 [4,1; 6,8] млн/мл против 3,9 [3,0; 5,1] млн/мл, p=0,03), но не отличалось в стабильном состоянии в момент включения в исследование (4,8 [4,0; 5,6] млн/мл против 4,5 [3,8; 5,5] млн/мл, p=0,7). Сочетание у пациентов повышенной концентрации ремнантного ХС на фоне гиперЛп(а) или НМ фенотипа апобелка(а) значимо увеличивало риск развития повторного нефатального ИМ (рис. 4). Риск развития повторного нефатального ИМ у пациентов с НМ фенотипом апобелка(а) и концентрацией ремнантного ХС ≥0,63 ммоль/л увеличивался трехкратно по сравнению с больными с ВМ фенотипом апобелка(а) и концентрацией ремнантного ХС <0,63 ммоль/л (2,8 (95% ДИ 1,0—8,1); p=0,05).

Рис. 4. Кривые выживаемости без повторного инфаркта миокарда с поправкой на пол, возраст манифестации и дозу статинов в зависимости от уровня ремнантного ХС и (а) концентрации Лп(а) или (б) фенотипа апо(а).

Обсуждение

Несмотря на достижения современной медицины, ИБС и последующие ССО у лиц в возрасте до 55 лет по-прежнему остаются серьезной проблемой [15]. Сейчас не вызывает сомнений, что повышенная концентрация Лп(а) является одним из наиболее важных генетически детерминированных факторов риска развития АССЗ [16].

В свою очередь повышенная концентрация ремнантного ХС, отражающего содержание ТБЛ, связана с системным низкоинтенсивным воспалением [17]. Присутствие Лп(а) в диапазоне флотации ТБЛ и отсутствие ясности в вопросе сборки частицы Лп(а) [18] позволяют предположить возможную взаимосвязь между ТБЛ и Лп(а) как факторами развития ССЗ.

С использованием морфологического и иммуногистохимического подходов Лп(а) выявлен в атеросклеротических бляшках человека, начиная от липидной полосы и вплоть до ее разрыва [19]. В силу особенностей строения Лп(а) механизмы его атеротромбогенности могут быть крайне разнообразны и включать воздействие Лп(а) на иммунные клетки [7].

Наши эксперименты in vitro продемонстрировали, что Лп(а) может активировать нейтрофильные гранулоциты с образованием НВЛ. Кроме того, нами выявлена корреляция между концентрациями Лп(а) и нейтрофильной эластазы в гомогенатах атеросклеротических бляшек.

Иммуногистохимический анализ содержания нейтрофилов и НВЛ в атеросклеротических бляшках различных морфологических типов [20] показал, что наибольшее количество нейтрофилов и НВЛ обнаружено в бляшках с признаками кровоизлияния, тромбоза и эрозии. Периваскулярная ткань, находящаяся в непосредственной близости от осложненной бляшки, также содержала НВЛ. Содержание НВЛ выявлялось в каждом пятом образце тромбов, ассоциированном с развитием ИМ, и было связано с неблагоприятным прогнозом, что косвенно подтверждает возможный вклад НВЛ в «дестабилизацию» атеросклеротических бляшек [21]. Количество НВЛ в составе коронарных тромбов значительно превышало таковое в составе тромбов глубоких вен, а также сгустков, полученных при свертывании крови здоровых доноров in vitro [22].

Большинство имеющихся исследований направлено на оценку Лп(а)-ассоциированного риска ССЗ в условиях первичной профилактики, и относительно немного работ касается повторяющихся ССО у лиц с ССЗ в условиях вторичной профилактики [23]. Особенностью нашего исследования было включение больных с ранним развитием ИБС, манифестировавшей нефатальным ИМ. Уровень Лп(а) у такой категории больных исходно был значимо выше, чем у пациентов без стенозирующего атеросклероза [24] или в европейской популяции в целом [23, 25], что, на наш взгляд, объясняется отсутствием у молодых людей других факторов риска ССЗ, накапливающихся с возрастом и маскирующих причинно-следственную связь с Лп(а). У данной категории пациентов как концентрация Лп(а), так и НМ фенотип апобелка(а) оказались независимыми предикторами повторного нефатального ИМ. В первые 3 года с момента манифестации ИБС повторный ИМ развился в среднем на 3,3 или 4,5 мес раньше у больных с повышенной концентрацией Лп(а) или НМ фенотипом апо(а) соответственно. Наши результаты находят подтверждение в исследовании PROMIS (Pakistan Risk of the Myocardial Infarction Study), включившем более 9 тыс. больных с ИМ и 9 тыс. лиц контрольной группы, показавшем, что как размер апо(а) изоформы, так и концентрация Лп(а), являлись независимыми факторами риска ИМ [26].

В нашем исследовании сочетание повышенной концентрации Лп(а) на фоне НМ фенотипа апо(а) значимо увеличивало риск повторного ИМ, несмотря на проводимую гиполипидемическую терапию и коррекцию модифицируемых факторов риска АССЗ. Воспалительная инфильтрация бляшки иммунными клетками является одним из основных факторов ее нестабильности [27]. Доля окисленных фосфолипидов, являющихся стимулами для врожденной иммунной системы, ассоциируется с меньшими изоформами апо(а) [5] и может оказаться ключевым фактором, определяющим высокую «атеротромбогенность» Лп(а).

Согласно исследованиям последних лет, ТБЛ также являются фактором риска АССЗ, поскольку способны проникать в интиму сосуда, связываться с ее компонентами и вызывать местное воспаление [27, 28].

Присутствие Лп(а) во фракциях ТБЛ было обнаружено достаточно давно [29]. В нашей работе было показано, что пациенты с высоким уровнем ТБЛ на фоне повышенной концентрации Лп(а) или наличия НМ фенотипа апо(а) имеют максимальный риск возникновения повторного ИМ уже после манифестации ИБС. Эффективность одновременной оценки концентрации Лп(а) и ремнантного ХС для прогнозирования риска ССЗ, особенно у пациентов с ХС ЛНП <2,6 ммоль/л, была продемонстрирована в недавней работе [30]. Наличие легкой или умеренной триглицеридемии (ТГ ≥1,7 ммоль/л) также ассоциировалось с четырехкратным увеличением шансов ИБС у больных с концентрацией Лп(а) <30 мг/дл и с десятикратным — на фоне гиперлипопротеидемии(а) [31].

Прямых взаимосвязей между содержанием нейтрофилов в крови при проведении ретроспективного анализа с риском повторного ИМ не обнаружено, это может быть следствием широкой вариабельности данного показателя, а также незначительной доли нейтрофилов, циркулирующих в крови. В нашем исследовании было продемонстрировано, что только у пациентов, имеющих повышенную концентрацию Лп(а), содержание нейтрофилов в крови ассоциировалось с концентрацией ТБЛ.

Можно предположить, что цепь взаимосвязанных событий от повышенной концентрации Лп(а) и ТБЛ до повышенного риска повторного ИМ может быть следующей: ТБЛ, особенно на фоне гиперлипопротеидемии(а) и НМ фенотипа апо(а), способствуют развитию локального воспаления в сосудистой стенке, что в свою очередь вызывает миграцию туда нейтрофилов и других иммунных клеток, способствующих образованию нестабильных атеросклеротических бляшек.

Таким образом, Лп(а) может способствовать активации нейтрофилов, а повышенное содержание ТБЛ в плазме крови может быть ассоциировано с увеличением содержания циркулирующих нейтрофилов. Сочетание этих факторов может усиливать вклад нейтрофилов в развитие коронарного атеросклероза и ССО.

Ограничением нашего исследования являлось небольшое число включенных пациентов, что диктует необходимость продолжения работы. Данные анализа крови с подсчетом лейкоцитарной формулы были доступны из медицинской документации только для 45 пациентов, что не позволило провести анализ пропорциональных рисков Кокса. Ограничение чувствительности метода фенотипирования апо(а) привело к исключению из исследования пациентов с концентрацией Лп(а) <4 мг/дл.

Заключение

Увеличение концентрации Лп(а) и низкомолекулярный фенотип апо(а) повышают риск раннего развития повторного нефатального ИМ, особенно на фоне более высокого уровня триглицерид-богатых липопротеидов. Содержание в крови нейтрофилов напрямую не связано с концентрацией Лп(а), но коррелирует с уровнем ремнантного ХС у больных с Лп(а) ≥30 мг/дл. Результаты экспериментов in vitro демонстрируют, что Лп(а) может являться активатором нейтрофилов, а его концентрация в бляшке ассоциируется с содержанием в ней нейтрофильной эластазы. Сочетание повышенной концентрации Лп(а) и триглицерид-богатых липопротеидов может усиливать вклад нейтрофилов в развитие коронарного атеросклероза и ССО.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РНФ, проект 22-25-00051.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹Долгушин И.И., Рыжкова А.И., Савочкина А.Ю., Шишкова Ю.С. Способ выделения нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови. Патент на изобретение. Номер патента 2 431 836. Дата госрегистрации 18.02.10.