Одной из важных проблем биологии и медицины являются зависимые от возраста заболевания, сопровождающиеся прогрессивной гибелью нервных клеток головного мозга. Исследованию причин и механизмов нейродегенерации посвящено значительное количество работ [1—4], поскольку возрастные изменения мозга являются причиной нарушений функций органов-мишеней. Так, возрастные изменения сенсомоторной коры головного мозга приводят к нарушению когнитивных и двигательных функций, снижению локомоторной деятельности. Исследования молекулярных механизмов инволюционных морфофункциональных изменений коры головного мозга имеют большое значение, так как могут являться базой для разработки фармакологической коррекции старческих нарушений. Особенно актуальны подобные исследования в отношении патологического, или ускоренного старения, обусловленного различными причинами, включая как экологические нарушения, так и генетические заболевания.

В развитии инволюционных изменений большое значение имеет апоптоз клеток, в первую очередь нейронов. Показано, что уровень нейронального апоптоза в различных отделах головного мозга значительно увеличивается при физиологическом старении [5, 6] и при нейродегенеративных заболеваниях [7—10]. Повышение оксидативного стресса при старении является одной из причин программированной клеточной гибели, таким образом, в механизмах инициации и развития апоптоза особое значение имеют связанные с активным кислородом процессы и субстраты, в том числе дыхательные биохимические каскады клетки, митохондриальная активность и др. [11]. Как известно, митохондриальная дисфункция может иметь большое значение в развитии возрастной патологии и нейродегенеративных процессов, в частности апоптоза нейронов [12, 13]. Многие лекарственные препараты, применяемые для лечения заболеваний, связанных со старением, оказывают только симптоматическое действие. Таким образом, необходимо разработать новую стратегию фармакологической коррекции зависимой от возраста патологии, направленную на модуляцию уровня апоптоза клеток, в том числе путем регуляции оксидативного стресса, клеточного дыхания и метаболизма.

В современной медицине такими препаратами являются лекарственные средства на основе соединений янтарной кислоты, например цитофлавин. Цитофлавин является метаболотропным комплексным препаратом, состоящим из янтарной кислоты, рибоксина, никотинамида (витамин РР) и рибофлавина мононуклеотид (витамин В₂) [14]. Цитофлавин широко применяется в клинической практике благодаря своей нейропротективной активности [15, 16]. Мы предположили, что цитофлавин также может участвовать в регуляции апоптоза нейронов при старении. В связи с этим цель настоящей работы – исследование роли цитофлавина в механизмах регуляции апоптоза клеток коры головного мозга при физиологическом и патологическом старении (в условиях сверхэкспрессии HER-2/neu).

Моделью ускоренного (патологического) старения послужили трансгенные мыши линии HER-2/neu, полученные из Italian National Research Center for Aging, разведение их поддерживается в НМИЦ онкологии им. Петрова (Санкт-Петербург), средняя продолжительность жизни таких животных составляет 10—12 мес. Контроль — мыши дикого типа FVB/N. Сверхэкспрессия активированного HER-2/neu у трансгенной самки мышей FVB/N приводит к злокачественной трансформации эпителиальных клеток молочных желез с последующим развитием нескольких аденокарцином молочных желез. Различные зависимые от возраста биохимические и морфофункциональные нарушения у трансгенных мышей HER-2/neu (гиперинсулинемия, гипергликемия, снижение активности антиоксидантной системы и репродуктивной системы) являются биомаркерами преждевременного старения [17]. Таким образом, HER-2/neu не только инициирует малигнизацию эпителиальных клеток молочных желез, но и вызывает гормонально-метаболические изменения, характерные для ускоренного старения [17]. Животных содержали в стандартных условиях вивария при температуре воздуха 18—22 °С и относительной влажности воздуха 50—65%. В ходе эксперимента обеспечивался свободный доступ к воде и корму. Все эксперименты выполняли в соответствии с Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р-53434−2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», приказом Минздрава Р.Ф. от 01.04.16 № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики».

Животные были разделены на две возрастные группы, молодые (2—3 мес) и старые (дикий тип — 18 мес, трансгенные мыши — 10 мес). В каждой возрастной группе были сформированы контрольная и опытная подгруппы (введение цитофлавина) по 6 животных, всего 24 мыши.

В качестве материала исследования использовали сенсомоторную кору головного мозга. Экспериментальным подгруппам двух линий мышей делали внутрибрюшинные инъекции цитофлавина, раствор для внутривенного введения производства «ООО «НТФФ «ПОЛИСАН» (Санкт-Петербург) в дозе 0,014 мл/10 г. Контрольным подгруппам вводили 5% раствор глюкозы также 1 раз в сутки в течение 10 дней. Дозы были рассчитаны на основании терапевтических доз препаратов.

Исследуемых животных декапитировали под золетиловым наркозом (золетил 4 мг/кг), извлекали головной мозг и фиксировали его в 4% формалине, подвергали стандартной гистологической обработке, затем готовили свежезамороженные срезы коры головного мозга (6 мкм).

Для детекции апоптотических клеток в сенсомоторной коре использовали метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling), выявление диаминобензидином («Sileks», Россия). Анализ срезов проводили при помощи световой микроскопии (микроскоп Leica DFC 300 FX, Германия), цветная видеокамера DIC-E (WPI, США), увеличение 40. Подсчет количества TUNEL-позитивных клеток на 4—5 срезах коры мозга у каждой особи, т. е. количество темноокрашенных апоптотических клеток, взятое как среднее на один срез, осуществляли в программе Video Test Software.

Оценивали уровень апоптоз-ассоциированных белков p53 («Abcam», США) —1:1000, CD95 («Abcam», СШA) – 1:1000, Mcl-1 (Abcam plc, «Cambridge», Англия) — 1:500, p-AKT (Thr308) («Cell Signaling», СШA) — 1:1000, p-ERK½ (Thr202/Tyr204) («Cell Signaling», СШA) — 1:1000 и Actin (Abcam plc, «Cambridge», Англия) — 0,5 мкг/1 мл посредством вестерн-блоттинга, после чего подсчитывали содержание каждого белка с помощью программы ImageJ.

Полученные данные обрабатывали статистически с помощью критерия Стьюдента при р<0,05 в программе Microsoft Excel 5.0a.

В настоящее время исследование патологического старения, а именно ускоренного старения, представляет большой интерес как для фундаментальной биологии, так и для практической медицины.

Результаты гистологического анализа показали, что у молодых мышей линии FVB/N уровень клеточной смерти низкий (рис. 1).

По данным литературы [18], AKT- и ERK-каскады являются основными сигнальными путями, обеспечивающими выживаемость клеток коры. Отмечено, что в зависимости от типа клеток и их состояния AKT по-разному влияет на Fas (CD95)-опосредованный апоптоз [19—21]. Так, в работе [21] показано, что при связывании Fas с FasL происходит активация AKT/PKB и одновременно с этим наблюдается повышение гибели эпидермальных клеток Cl41. В другой работе [19] обнаружено, что стимуляция Fas (CD95)-опосредованного апоптоза гепатоцитов осуществляется за счет подавления PDPK1 и mTORC2, следовательно, после снижения фосфорилирования AKT. Выявлено [20], что активируемый путь выживания AKT подавляет внешнерецепторный путь апоптоза в T-клетках. Как показано в нашей работе, достаточно высокое содержание р-AKT и р-ERK в нейронах молодых мышей дикого типа препятствует инициации клеточной смерти, при этом наблюдается низкий уровень проапоптотических белков CD95 (Fas), р53 (рис. 1—3).

У мышей дикого типа на поздних этапах онтогенеза наблюдается снижение уровня p-ERK, возможно, это является причиной повышения экспрессии CD95 и доли апоптотических клеток (см. рис. 1—3). Можно предположить, что при физиологическом старении запуск клеточной смерти осуществляется по внешнерецепторному пути, одной из причин этого является снижение содержания фосфорилированной формы ERK, т. е. уровня активации ERK-пути.

Трансгенные мыши со сверхэкспрессией HER-2/neu являются удобной моделью для исследования патологического старения. HER-2/neu — мембранная тирозинкиназа, контролирующая клеточную пролиферацию и выживание. Амплификация данного белка наблюдается в разных опухолях, особенно часто при раке молочной железы [22, 23].

В нашей работе показано, что в условиях сверхэкспрессии HER-2/neu наблюдается повышение содержания активной, фосфорилированной формы — p-AKT в нейронах коры, т. е. активация сигнального пути AKT, способствующего подавлению клеточной смерти (см. рис. 1, 3). Результатом этого, очевидно, является снижение экспрессии CD95 и p53 (см. рис. 2). Данные литературы подтверждают полученные нами результаты. Так, сигнальный путь AKT, опосредованный рецептором HER-2/neu, способствует пролиферации, миграции и выживанию клеток, следовательно, подавлению апоптоза и в определенных условиях развитию злокачественных образований [24]. Амплификация HER-2/neu активирует AKT, которая может привести к фосфорилированию Mdm2, что приводит к выводу р53 из ядра; далее Mdm2 убиквитинизирует р53, что приводит к его деградации [25].

Основная задача исследования — изучить нейропротективную активность и влияние цитофлавина на механизмы апоптоза на поздних этапах онтогенеза и при сверхэкспрессии HER-2/neu. Несмотря на то что у молодых и старых мышей дикого типа после введения цитофлавина наблюдается высокая экспрессия проапоптотических белков CD95 и p53, не отмечена активация AKT- и ERK-путей выживания и не происходит инициация клеточной смерти.

Как известно, рецептор смерти CD95, относящийся к семейству рецепторов TNF, может участвовать в других клеточных реакциях, помимо апоптоза. Так, лигирование Fas/CD95 стимулирует пролиферацию первичных астроцитов через механизм, зависящий от активации caspase-8 и последующей фосфориляции ERK. Сaspase-8-опосредованная активация ERK зависит от влияния FasL, в частности от дозы агониста FasL, при низкой дозе наблюдается пролиферация первичных астроцитов плода, а при высокой — апоптоз [26]. Антиапоптотический эффект TNF может быть связан с активацией IkB (ингибитор kB-киназы-NF-kB; сигнальный каскад, связанный с NF-kB) и MAPK-EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) путей выживания [27, 28].

При действии цитофлавина количество TUNEL-позитивных клеток у молодых мышей дикого типа не изменяется, очевидно, это объясняется высоким содержанием антиапоптотического белка Mcl-1 (рис. 4).

После инъекций цитофлавина у молодых трансгенных животных выявлена активация CD95, р53 при одновременном снижении содержания р-AKT и p-ERK, хотя это не изменяет уровень гибели клеток коры мозга, что, скорее всего, объясняется экспрессией антиапоптотического белка Mcl-1 (см. рис. 1—4), амплификация которого часто связана с опухолевой прогрессией [29].

В отличие от молодых у старых HER-2/neu-мышей цитофлавин приводит к снижению содержания р-AKT и p-ERK, повышению экспрессии проапоптотических белков CD95, р53 и, соответственно, к возрастанию уровня апоптоза.

Можно заключить, что проапоптотическая активность цитофлавина зависит от биохимического состояния клетки. В условиях сверхэкспрессии HER-2/neu механизм действия исследуемого препарата осуществляется посредством подавления AKT- и ERK-сигнальных путей.

У молодых мышей линии FVB/N в коре головного мозга уровень клеточной смерти низкий. У старых мышей FVB/N возрастает количество гибнущих клеток, апоптоз протекает по внешнерецепторному пути, очевидно, вследствие снижения активности AKT- и ERK-каскадов выживания. У трансгенных мышей вне зависимости от возраста сигнальный путь AKT, опосредованный рецепторами HER-2/neu, способствует низкому уровню апоптоза клеток коры головного мозга. У мышей дикого типа (FVB/N) при введении цитофлавина наблюдается повышение экспрессии антиапоптотического белка Mcl-1, способствующего подавлению гибели клеток коры мозга у старых животных при отсутствии изменений у молодых. У молодых HER-2/neu-трансгенных мышей при действии цитофлавина не наблюдается запуск апоптотического каскада, очевидно, в связи с возрастающей экспрессией Mcl-1. При патологическом старении (животные со сверхэкспрессией HER-2/neu) цитофлавин обладает проапоптотическим действием за счет подавления AKT- и ERK-путей и активации внешнерецепторного и р53-зависимого пути.

Таким образом, можно заключить, что цитофлавин обладает выраженным нейропротективным действием на изученной модели (физиологическое и ускоренное старение). Выявлено, что влияние цитофлавина на уровень апоптоза нейронов неоднозначно и зависит от генетической линии животных. Так, это умеренная стимуляция апоптоза в случае низкого его уровня у HER-2/neu-мышей с высоким уровнем канцерогенеза и уменьшение высокого уровня апоптоза у старых животных дикого типа, что предупреждает нейродегенерацию. Данные эффекты могут быть использованы в клинической медицине.

Работа выполнена при поддержке Гос. задания по теме № АААА-А18−118012290371−3.

Соблюдение этических стандартов

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Настоящая статья не содержит результатов каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.Д.Б., Ю.О.С., Д.Л.Т.

Сбор и обработка материала — Е.Д.Б., Ю.О.С.

Статистическая обработка — Е.Д.Б., Ю.О.С.

Написание текста — Е.Д.Б., Ю.О.С., Д.Л.Т.

Редактирование — Е.Д.Б., Д.Л.Т.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Сведения об авторах:

Бажанова Е.Д.— https://orcid.org/0000-0002-9763-504X, e-mail: bazhanovae@mail.ru;

Соколова Ю.О. — e-mail: yulya.kozlova@mail.ru;

Теплый Д.Л. — e-mail: physiology-agu@mail.ru

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Бажанова Е.Д., Соколова Ю.О., Теплый Д.Л. Влияние цитофлавина на процессы апоптоза нейронов коры головного мозга у мышей на модели физиологического и патологического старения. Архив патологии. 2019;81(4):-65. https://doi.org/10.17116/patol201981041