Исследование PD-L1-статуса рака молочной железы с использованием моноклонального антитела SP142 и перспективы для определения лечебной тактики

Генетические и молекулярные нарушения являются фактором для запуска иммунного ответа организма. Опухолевые клетки характеризуются накоплением множества генетических поломок (неоантигенов) и отсутствием нормального функционирования [1]. Именно накопление неоантигенов является триггерной точкой для запуска иммунного ответа на опухоль посредством их презентации в главном комплексе гистосовместимости I (MCHI) на поверхности клетки и распознавания CD8+ Т-лимфоцитами [2].

Одна из многих молекул, отвечающих за ингибирование таких фаз, как активация лимфоцитов и непосредственное уничтожение опухолевой клетки, — рецептор запрограммированной клеточной гибели 1 (PD-1) и его лиганд PD-L1 [2].

Крупное клиническое исследование Impassion 130 показало прекрасные результаты применения блокаторов PD-L1 (атезолизумаба) при тройном негативном раке молочной железы (ТН РМЖ). PD-L1-позитивными считали карциномы с окрашиванием 1% и более иммунных клеток от площади опухоли. Медианы безрецидивной и общей выживаемости при добавлении чек-поинт-ингибитора к наб-паклитакселу увеличивались на 1,7 и 3,7 мес соответственно. Помимо увеличения средней продолжительности жизни, 2-летняя выживаемость пациентов с метастатическим ТН РМЖ составила 53,5% [3]. Данное обстоятельство диктует необходимость тестирования пациентов для определения статуса PD-L1 и дальнейшего назначения иммунотерапии.

Кроме того, привлекает внимание группа больных с люминальным В, HER2-негативным РМЖ. При прогрессировании процесса на фоне проводимой химио- и гормонотерапии представляется интересным изучить PD-L1-статус для возможного обсуждения предпосылок к иммунотерапии.

Материал и методы

Исследование проведено на операционном материале 72 пациентов с тройным негативным (45 случаев) и люминальным B, HER2-негативным РМЖ (27). Часть больных (n=31) получали неоадъювантное химиотерапевтическое лечение. Пациентов с выраженным опухолевым регрессом в исследование не включали. В 38 случаях выявлены метастазы в регионарных лимфатических узлах. Все образцы ткани были зафиксированы в забуференном 10% растворе формалина в течение 6—72 ч, обезвожены, обезжирены и пропитаны парафином по стандартному протоколу. Гистологическое исследование для уточнения варианта, стадии, градации или остаточной опухолевой нагрузки проводили на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Определение остаточной опухолевой нагрузки выполняли по системе RCB [4]. Для установления биологического подтипа рака провели иммуногистохимическое исследование в автоматизированном режиме с антителами к ER (clone SP1), PgR (clone 1E2), HER2 (clone 4B5), Ki-67 (clone 30−9) на парафиновых срезах толщиной 4 мкм и cистемой детекции UltraView Universal DAB Detection Kit с использованием стейнера Ventana Bench Marсk Ultra. В 7 случаях отрицательный HER2-статус был подтвержден при помощи гибридизации in situ методом SISH (с набором Inform Her2 Dual ISH DNA Probe Cоctail Assay (Roche-Ventana).

Иммуногистохимическое исследование PD - L 1-статуса

Использовали тестовую систему VENTANA PD-L1 (SP142). Для каждого случая изготовляли срез для негативного контроля. Срез окрашивали по протоколу, аналогичному основному исследованию, однако в качестве первичных антител использовали реагент негативного контроля VENTANA Rabbit Monoclonal Negative Control Ig.

После процесса депарафинизации и демаскировки антигенов кроличьи моноклональные антитела PD-L1 (SP142) в рабочем разведении наносили на подготовленные срезы с блока первичной опухоли и регионарного метастаза. После инкубации с первичным антителом или реагентом негативного контроля применяли систему детекции OptiView DAB IHC Detection Kit с амплификатором OptiView Amplification Kit. Последним этапом проводили докрашивание гематоксилином. Все этапы реакции проводили в автоматизированном режиме на иммуногистохимическом стейнере Ventana Bench Marck Ultra по рекомендованному протоколу производителя реагентов.

В качестве контроля использовали препараты клеточных линий, прилагаемые к набору, и ткань нормальной миндалины как внутрилабораторный позитивный контроль. После проведения реакции ткань миндалины должна была содержать умеренно или сильно окрашенные лимфоциты и макрофаги в герминативных центрах, диффузное окрашивание ретикулярных клеток крипт, неокрашенные лимфоциты в межфолликулярном пространстве и эпителий, покрывающий миндалину. Анализ препаратов РМЖ проводили только при наличии адекватного окрашивания контрольных образцов.

Оценка статуса

Для оценки PD-L1-статуса всех типов рака применяли методику, рекомендуемую сегодня для оценки ТН РМЖ [5].

На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли площадь опухоли (TS). При этом TS включает все жизнеспособные клетки инвазивного РМЖ и окружающую их воспалительную инфильтрацию (IS). Очаги карциномы in situ долек и протоков, а также участки некроза исключали из подсчета (рис. 1).

Рис. 1. Методика определения площади опухоли. 1 — голубая линия — участки, включенные в подсчет (участки инвазивной карциномы с окружающей воспалительной инфильтрацией); красная линия: 2 — очаги некроза, которые исключаются из площади опухоли, 3 — участки карциномы in situ тоже исключаются из площади опухоли, ×100.

При наличии множества разрозненных опухолевых очагов TS складывается из всех участков. Нормальные ткани, доброкачественную патологию, элементы воспалительной инфильтрации, не связанные с опухолью, исключали из подсчета. Рутинное окрашивание помогает отличить процессы, имитирующие опухоль.

Для оценки экспрессии PD-L1 в регионарных метастазах в соответствии с правилами по интерпретации результатов [5] необходимо отличать воспалительную инфильтрацию, являющуюся частью иммунного ответа опухоли на лечение, и предсуществующую ткань лимфатического узла. Ввиду объективных трудностей в этом процессе за IS принимаются только те лимфоциты, которые непосредственно прилегают к опухолевым клеткам (рис. 2).

Рис. 2. Методика определения площади опухоли для метастаза. 1 — иммунные клетки, расположенные в непосредственной близости от опухоли; 2 — позитивно окрашенные иммунные клетки, расположенные в предсуществующей ткани лимфатического узла, ×100.

Образцы негативного контроля использовали для выявления и дифференцировки таких артефактов, как неспецифическое окрашивание, отложения пигментов (рис. 3).

Рис. 3. Реакция с негативным контролем. В центре изображения участок отложения пигмента, ×200.

На срезах, окрашенных антителами к PD-L1, оценивали долю TS, занятую позитивно окрашенными иммунными клетками. Позитивным считается точечное или линейное, темно-коричневое, полное или частичное мембранное окрашивание как одиночных клеток, так и воспалительных инфильтратов (рис. 4).

Рис. 4. Позитивная иммуногистохимическая реакция с антителами к PD-L1, ×200.

В подсчет не включали опухолевые клетки (окрашенные и неокрашенные); фоновое окрашивание стромы, нервных стволов; лимфоциты, прилежащие к участкам карциномы in situ; лимфоциты, находящиеся в просвете крупных сосудов. В случае затруднения дифференцировки между опухолевыми и иммунными клетками необходимо сравнить препараты, окрашенные гематоксилином и эозином и антителами к PD-L1.

Позитивный PD-L1-статус опухоль получала при наличии окрашенных иммунных клеток, занимающих 1% и более площади опухоли.

Статистический анализ проводили при помощи расчета критерия χ².

Результаты

Из 72 больных, включенных в исследование, позитивный PD-L1-статус оказался у 30 (41,7%), из них первичной опухоли у 26 (36,1%). Из 38 изученных метастазов позитивный статус отмечен в 18 (47,4%) случаях.

У больных, получавших неоадъювантное лечение химиотерапевтическими препаратами, в целом реже выявляли положительный PD-L1-статус (25,8% против 53,7%; p=0,018) (рис. 5),

Рис. 5. Сравнение частоты выявления позитивного PD-L1-статуса пациентов, получавших и не получавших неоадъювантное лечение.

однако следует отметить, что в случае с более высокой остаточной опухолевой нагрузкой (RCBIII по сравнению с RCBII) чаще выявляли позитивный PD-L- статус (p=0,002) (рис. 6).

Рис. 6. Сравнение частоты выявления позитивного PD-L1-статуса пациентов с различной степенью остаточной опухолевой нагрузки (RCB).

В ТН-карциномах позитивный статус встречался чаще, чем в люминальных В, HER2-негативных (46,7% против 33,3%), однако статистической значимости это не достигло (p=0,267). Примерно 2/3 PD-L1-позитивных опухолей (20 случаев; p=0,31) оказались высокой степени злокачественности (G3).

Подробное распределение данных представлено в таблице.

Позитивный PD-L1-статус опухолей молочной железы

Обсуждение

Полученные результаты показали различный PD-L1-статус первичной опухоли и метастазов. Гетерогенность РМЖ — хорошо известный феномен. К сожалению, не всегда в метастазе оказывается тот же клон опухолевых клеток, который преобладает в первичном очаге [6—8]. В исследовании оказалось 4 случая с отрицательным PD-L1-статусом первичного очага и позитивным статусом метастаза. Помимо этого, у одного из пациентов с позитивным первичным очагом исследованный метастаз оказался негативным. Таким образом, в 6,94% случаев статус первичного очага и метастаза различался. Схожие данные получили Н. Wang и соавт. [9] при исследовании колоректального рака. Они пришли к выводу, что экспрессия PD-L1 в метастатическом колоректальном раке должна рассматриваться как независимый фактор при назначении иммунотерапии.

В настоящее время проведены лишь единичные исследования по оценке связи степени RCB и экспрессии PD-L1. В 2017 г. опубликовано исследование, по данным которого экспрессия PD-L1 в опухолях молочной железы, не достигших полного морфологического регресса (pCR), является неблагоприятным прогностическим фактором для таких пациентов [10]. Наши результаты не противоречат этим данным, так как высокий уровень остаточной опухолевой нагрузки также неблагоприятно влияет на прогноз. В то же время в исследовании американских коллег [11] показано, что позитивный статус PD-L1 материала, полученного до проведения неоадъювантной химиотерапии, является залогом лучшего ответа опухоли на лечение. Однако данное сопоставление не совсем корректно ввиду того, что исследование было проведено на материале, полученном до начала лечения, к тому же на биопсийном, что подразумевает меньший объем исследуемой опухоли.

У больных, получавших неоадъювантное лечение химиотерапевтическими препаратами, реже выявляли положительный PD-L1-статус. Это соответствует данным L. Emens и соавт. [12], проводивших исследование безопасности и эффективности монотерапии атезолизумабом. В их работе у пациентов, получавших терапию первой линии, отмечена лучшая выживаемость, чем второй и последующих: медиана выживаемости в 1-й группе составила 17,6 мес по сравнению с 7,3 мес во 2-й группе. Однако такая закономерность не была выявлена при исследовании рака яичников. По данным S. Mesnage и соавт. [13], экспрессия PD-L1 усиливается под воздействием неоадъювантной химиотерапии.

Самое крупное исследование экспрессии PD-L1 SP142 на полных срезах — IMpassiom130 выполнено на 902 препаратах. Согласно данным L. Emens и соавт. [14], позитивный PD-L1-статус выявляли в 41% случаев. Мы получили схожие данные: в ТН РМЖ количество пациентов с позитивным статусом достигло 46,7%. В отличие от наших коллег в настоящее исследование включили и пациентов с люминальным B, HER2-негативным РМЖ. Безусловно, у таких больных прогноз лучше, чем у пациентов с ТН-раком, однако среди гормонопозитивных карцином также встречаются случаи с быстрым прогрессированием и низкой чувствительностью к проводимой терапии [15]. По нашим результатам, частота встречаемости пациентов, которые потенциально могут ответить на иммунотерапию блокаторами чек-поинт-ингибиторами, в гормонопозитивных раках ниже, однако данный вывод не достиг статистической значимости. В то же время D. Dill и соавт. [16] получили статистически значимые данные на большей выборке. Стоит отметить, что данное исследование выполнено на TMA-матрицах, в результате авторы применили другой метод оценки PD-L1-статуса, учитывающий меньший объем опухоли.

Большинство исследователей [16, 17] сходятся в том, что позитивный PD-L1-статус чаще выявляется у низкодифференцированных раков, однако в нашем исследовании эти данные не получили статистического подтверждения. Вероятнее всего, это связано с малой выборкой.

Заключение

Мы считаем, что очень важен факт различия PD-L1-статуса первичной опухоли и метастаза. Возможно, с учетом полученных данных следует уточнять статус не только первичного очага, но и клинически значимых метастазов, особенно если в первичной опухоли был получен отрицательный результат. Также исследование показало, что больные с люминальным В, HER2-негативным РМЖ с прогрессированием заболевания на стандартных схемах терапии могут иметь шанс на хороший результат при использовании блокаторов чек-поинт-ингибиторов иммунитета. Особый интерес представляют также данные о связи PD-L1-статуса с остаточной опухолевой нагрузкой, которые могут повлиять на выбор лечебной тактики в адъювантном режиме.

Участие авторов:

Концепция и дизайн — Г. А.Ф., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Сбор и обработка информации — О.А.К., Л.В.М.

ИГХ-исследование — О.А.К., Л.Э.З.,.Ю.Ю.А.

Написание текста — О.А.К., Л.В.М., Ю.Ю.А.

Редактирование — Г. А.Ф., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Франк Г.А. — https://orcid.org/0000-0002-3719-5388;

Кузнецова О.А. — https://orcid.org/0000-0002-9721-6355, e-mail: aolga@list.ru;

Завалишина Л.Э. — https://orcid.org/0000-0002-0677-7991;

Андреева Ю.Ю. — https://orcid.org/0000-0002-4559-3730;

Москвина Л.В. — https://orcid.org/0000-0001-8670-1366

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Франк Г.А., Кузнецова О.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Москвина Л.В. Исследование PD-L1-статуса рака молочной железы с использованием моноклонального антитела SP142 и перспективы для определения лечебной тактики. Архив патологии. 2019;81(5):5-10. https://doi.org/10.17116/patol2019810515