Современное состояние морфологической диагностики меланомы кожи

В настоящее время гистологическое исследование, совершаемое врачом-патологоанатомом, считается золотым стандартом диагностики и дифференциальной диагностики меланоцитарных новообразований. Вместе с этим, согласно результатам ряда исследований, от 8 до 20% анализируемых пигментных новообразований расцениваются врачами-патологоанатомами как неоднозначные, что указывает на необходимость дальнейшего совершенствования диагностики меланоцитарных новообразований кожи [1]. К факторам, обусловливающим наличие спорных вопросов как в отношении меланомы кожи, так и некоторых других злокачественных опухолей, относится не только характер субъективной оценки разными специалистами, но и широкий диапазон структурно-морфологических признаков, связанных в том числе с разнообразием молекулярных подтипов новообразований [2]. Кроме того, сохраняется ряд вопросов к прогностической и диагностической ценности иммуногистохимического метода в отношении некоторых видов меланоцитарных новообразований при оценке на основе данного метода уровня пролиферации клеток, характера иммунного ответа или изменений внутриклеточных сигнальных каскадов [3, 4].

Проблемы морфологической диагностики меланомы затрагивают не только вопросы дифференциации с доброкачественными меланоцитарными новообразованиями, но и с другими злокачественными новообразованиями. При гистологическом исследовании меланома способна имитировать структурно-морфологические особенности широкого спектра опухолей, в частности, некоторых лимфом, низкодифференцированной карциномы, опухолей нейроэндокринного генеза [5]. Это связано с тем, что по своим цитологическим характеристикам клетки меланомы достаточно вариабельны и могут иметь широкий спектр морфологических черт — от эпителиоидных до веретенообразных. Это обусловлено особенностями цитоплазмы опухолевых клеток, придающей им светлоклеточные, плазмоцитоидные, рабдоидные, перстневидные и другие черты. Кроме того, имеются данные, указывающие на возможность клеток меланомы частично или полностью подвергаться различным видам дифференцировки — шванновской, фибробластической, миофибробластической, рабдоидной, остеоидной, хондроидной, ганглиозной и гладкомышечной [5].

Иммуногистохимические и молекулярно-биологические методы в диагностике меланомы кожи

Для решения вышеуказанных проблем диагностики меланомы в работе врача-патологоанатома существуют вспомогательные инструменты, основанные на идентификации отдельных молекул-маркеров посредством иммуногистохимического исследования. В частности, в клинической практике используется иммуногистохимическая идентификация белка S100, представляющего собой кислый кальцийсвязывающий белок массой 21 кД, имеющий ядерную локализацию в клетке. Чувствительность позитивного окрашивания на данный маркер при меланоцитарных новообразованиях составляет 97—100%, однако при столь высоком значении чувствительности S100 характеризуется низкой специфичностью, что обусловлено экспрессией данного белка в клетках нервной оболочки, миоэпителиальных клетках, адипоцитах, хондроцитах, клетках Лангерганса, а также клетках целого ряда карцином и сарком [6—11]. В связи с этим обстоятельством рекомендован ряд дополнительных высокоспецифичных для меланомы (95—100%) иммуногистохимических маркеров для параллельной оценки наряду с S100, к которым относятся: белок HMB45 (рис. 1, а), имеющий чувствительность в диапазоне 69—93% (77—100% при первичных меланомах, 56—83% при метастатических), MART-1/Мелан-А с чувствительностью 75—92%, тирозиназа (рис. 1, б) — 84—94%, а также MITF и NKI/C3, уровень чувствительности которых 81—100 и 86—100% соответственно [3]. Кроме того, описаны и другие маркеры для дифференциальной диагностики меланоцитарных новообразований — это MUM-1, меланокортин-1 и SM5-1, но ни один из них еще не продемонстрировал существенных преимуществ и не является строго специфичным, а потому эти молекулы не получили широкого клинического применения [12].

Рис. 1. Экспрессия HMB-45 и тирозиназы в меланоме.

а — иммуногистохимическая реакция с антителами HMB-45, ×100; б — иммуногистохимическая реакция с антителами к тирозиназе, ×200.

Наряду с дифференциальной диагностикой меланомы иммуногистохимический метод применяется для определения прогностических факторов, которые представляют маркеры клеточной пролиферации Ki-67 (рис. 2, а, б) и PCNA (рис. 2, в, г). Экспрессия данных белков является предиктором неблагоприятного прогноза для пациентов, она связана с более низкой выживаемостью, так как положительно коррелирует с такими морфологическими показателями, как толщина опухоли по Бреслоу, уровень инвазии по Кларку, изъязвление, лимфоваскулярная инвазия, количество митозов [13, 14]. Ki-67 в отличие от PCNA обладает наилучшей индивидуальной чувствительностью и специфичностью, хотя имеются сообщения о неоднозначных результатах использования обоих маркеров [15 —17]. Описаны попытки применения в дифференциальной диагностике 5-hmC (5-гидроксиметилцитозин), экспрессия которого снижается при меланоме по сравнению с диспластическими невусами, кератиноцитами и лимфоцитами. Показатели чувствительности и специфичности такого дифференциально-диагностического метода составляют 92,7 и 97,7% соответственно, однако сообщается, что приведенные характеристики чувствительности и специфичности определения 5-hmC также недостаточны для использования данной молекулы в качестве единственного анализируемого маркера [18].

Рис. 2. Результаты иммуногистохимического исследования невуса и меланомы.

а — экспрессия Ki-67 в ткани невуса, ×100; б — экспрессия Ki-67 в меланоме, ×200; в — экспрессия PCNA в меланоме, ×200; г — экспрессия PCNA в меланоме, ×400.

Учитывая обозначенные выше проблемы, сохраняется потребность в эффективных альтернативных маркерах диагностики и дифференциальной диагностики меланомы для использования в рутиной практике, учитывающих множество вариантов развития и прогрессии опухоли, которые в конечном итоге лежат в основе формирования вне- и внутриопухолевой гетерогенности.

В отношении неморфологических методов, обладающих перспективными характеристиками для диагностики меланомы кожи или применяющихся в клинической практике с целью прогнозирования течения и исхода заболевания, сообщается об оценке уровня белка PMEL (также называемого SILV, gp100 или ME20M) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в ткани свежезамороженных биоптатов, где уровень его экспрессии значительно ниже в клетках меланомы по сравнению с меланоцитарными невусами [19]. Безусловно, в данном аспекте следует отметить и определение уровня лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови в качестве прогностического фактора меланомы, а также исследование мутационного статуса протоонкогена BRAF, являющегося предиктором терапевтического ответа при BRAF-позитивных меланомах [20]. Однако до сих пор не выделено абсолютно эффективного молекулярного и/или биохимического диагностического маркера в этой области.

Применение анализа профилирования экспрессии генов в практической онкологии

В последние десятилетия были достигнуты значительные достижения в технологии секвенирования ДНК и РНК, генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов, количественной оценки матричных и некодирующих РНК, анализа молекулярных путей, а также получены значительные успехи в области интегративной биоинформатики. Новые знания значительно расширили понимание молекулярных основ возникновения и прогрессирования опухолей, индивидуального ответа пациентов на лечение.

Для определения молекулярных фенотипов опухолей в современных исследованиях используются различные технологии профилирования экспрессии генов (рис. 3). Благодаря современным молекулярно-генетическим подходам стало возможным провести изучение полного профиля РНК, кодируемого геномом отдельной клетки в специфическое время или в специфических условиях, а также исследовать совокупность всех транскриптов РНК, продуцируемых геномом, — кодирующих: рибосомальных, матричных или информационных, транспортных и ядерных, а также не кодирующих РНК, являющихся регуляторами экспрессии генов, к которым относятся микроРНК, малые интерферирующие, малые ядерные, малые ядрышковые и другие РНК.

Рис. 3. Иерархическая кластеризация результатов экспрессии генов в двух различных типах клеток меланомы кожи.

Профилирование экспрессии генов имеет особо важное значение, так как способствует более глубокому пониманию ключевых биологических функций и раскрытию молекулярных механизмов, связывающих генетическую информацию, что, в свою очередь, помогает комплексно осмыслить патогенетические механизмы, лежащие в основе развития онкологических заболеваний [21].

Наиболее часто для профилирования экспрессии генов используются методы, в основе которых лежит микрочипирование (микроэррей) и секвенирование [22]. При микрочипировании происходит гибридизация инкубируемых флуоресцентно-меченных образцов нуклеиновых кислот с изготовленными на заказ либо готовыми микрочипами. Методы микрочипирования имеют ряд особенностей, в частности, необходимость существующей базовой информации о последовательности генома, неоднозначность интерпретации данных, обусловленная перекрестной гибридизацией, ограничения динамического диапазона детекции вследствие фона и насыщенности сигналов, а также необходимость использования методов нормализации результатов для получения достоверных данных о сравнительной экспрессии различных генов [23]. При заборе образцов следует учитывать, что для микрочипирования хорошо подходят биологические материалы, содержащие большое количество РНК, например, кровь, и нет необходимости разделения на фракции, а для секвенирования РНК рекомендовано использовать биопсийный материал релевантных тканей, а образцы подвергать сепарации на клеточные подтипы [24]. При секвенировании общее количество РНК фрагментируется, затем осуществляются синтез комплиментарной ДНК и составление библиотеки генов с картированим референсных генов и дальнейшим анализом результатов, позволяющим выявить уровни экспрессии всех имеющихся генов во всей анализируемой ткани [25].

Благодаря разработкам в области геномных, транскриптомных и других технологий больших данных стало возможно исследовать не только совокупные молекулярные характеристики опухолей, но и, сопоставляя данные с клинико-морфологическими характеристиками, стадией заболевания, ответом на лечение, определять диагностическую и клиническую значимость выявленных молекулярных характеристик [26]. Такие совокупные молекулярные характеристики иногда именуют сигнатурами экспрессии генов. По определению сигнатура экспрессии гена — это определенная группа генов, коррелирующих генетические изменения с конкретными клиническими переменными, такими как диагноз или прогноз [27]. В последние годы исследователями было разработано и предложено множество сигнатур экспрессии генов, которые могут быть использованы в качестве классификации типов различных опухолей, для установления их стадий и, что немаловажно, прогноза заболевания, так как именно прогностические сигнатуры могут помочь врачу реализовать персонифицированный подход к пациенту и подобрать верную терапевтическую стратегию [28].

Совсем недавно тесты профилирования экспрессии генов начали применять в клинической практике для определения того, какие пациенты с ранней стадией эстрогензависимого рака молочной железы и отсутствием метастатического поражения лимфатических узлов нуждаются в адъювантной химиотерапии. Результаты данных тестов определяют риски рецидива опухоли и позволяют пациентам с низким риском избежать возможного ненужного лечения и краткосрочных и долгосрочных побочных эффектов, связанных с химиотерапией. Используется несколько коммерчески доступных тестов — Oncotype DX, Prosigna (PAM50), EndoPredict и MammaPrint, произведенных компанией Genomic Health Inc. (Калифорния) [29].

Первым из этих анализов был создан тест профилирования генов MammaPrint, разработанный Нидерландским институтом рака, он базируется на определении 70 генов, что позволяет выделить пациенток с раком молочной железы, имеющих высокий риск развития метастазов в течение 5 лет с момента постановки диагноза. Тест проводится с использованием метода профилирования экспрессии генов на основе микрочипирования на образцах свежей либо архивной ткани (замороженная ткань, биоптаты, заключенные в парафин) [30, 31].

Данный тест был одобрен к применению Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов FDA (от англ. Food and Drug Administration») в 2007 г. [32]. Также этот тест в качестве прогностического диагностического инструмента рекомендован Европейским обществом медицинской онкологии ESMO (European Society of Medical Oncology) и Американским объединенным комитетом по раку AJCC (American Joint Committee Cancer) [33].

Тест Oncotype DX представляет собой коммерчески доступную сигнатуру из 21 гена (включая 5 контрольных генов) на основе ОТ-ПЦР, которая проводится на образцах тканей, заключенных в парафиновые блоки. По результатам данного диагностического теста пациента можно отнести к какой-либо группе — низкого, промежуточного либо высокого риска в зависимости от риска отдаленного метастазирования через 10 лет. Этот тест был включен в качестве прогностического анализа в рекомендации Европейского общества медицинской онкологии ESMO (European Society of Medical Oncology), Национальной всеобщей онкологической сети NCCN (National Comprehensive Cancer Network) и Американского общества клинической онкологии ASCO (American Society of Clinical Oncology) [33].

PAM50 — это тест на основе микрочипирования, в котором используется 50 оцениваемых генов и 5 контрольных. Исследование проводится на биопсийном материале, фиксированном в формалине и заключенном в парафин [30].

EndoPredict включает анализ на основе 8 генов, связанных с канцерогенезом, и 3 эталонных генов. Его прогностическая ценность заключается в том, что этот анализ может быть использован при принятии решения о необходимости назначения адъювантной химиотерапии при раке молочной железы [34, 35].

Помимо рака молочной железы в настоящее время тесты на основе экспрессии генов, одобренные FDA, разработаны и используются и для других видов злокачественных новообразований. Такими диагностическими системами являются FoundationOne CDx (Foundation Medicine Inc., США) на основе секвенирования нового поколения для детекции в циркулирующих в крови молекулах ДНК, изменений в 311 генах, связанных с раком предстательной железы, немелкоклеточным раком легкого, раком яичников и раком молочной железы [36]; PROGENSA PCA3 (Gen-Probe Inc., США) — анализ на основе определения экспрессии мРНК генов PCA3 и PSA в моче для принятия решения о повторной биопсии при подозрении на рак предстательной железы у мужчин старше 50 лет [37]; BRACAnalysis CDx (Myriad Genetics, США) — диагностическая система, предназначенная для качественного обнаружения при помощи ПЦР патологических генотипов BRCA1 и BRCA2 с использованием геномной ДНК, полученной из образцов цельной крови, результаты данного теста при идентификации пациентов с раком предстательной железы, яичников и молочной железы [38].

Профилирование экспрессии генов при меланоме кожи

Для меланомы кожи также существует некоторый пласт накопленных данных о генных совокупностях, выявленных на основе различных методов полного профилирования и имеющих определенные характеристики, в первую очередь полезные для дифференциальной диагностики, а во вторую — имеющие прогностический потенциал. Так, определена экспрессионная совокупность, состоящая из 23 генов, позволяющая отличать меланому кожи от доброкачественных пигментных новообразований с чувствительностью 90% и специфичностью 91%, которые были подтверждены на независимой клинической когорте из 437 образцов [39]. Позднее исследовательская группа J.S. Ko и соавт. [40] оценила точность данной сигнатуры на когорте из 99 меланом, которые метастазировали после первоначального диагноза, и 83 невусов при длительном безрецидивном наблюдении. С помощью указанной сигнатуры успешно дифференцированы эти поражения с чувствительностью 93,9% и специфичностью 96,2%. Также при экспрессионном анализе РНК с использованием метода секвенирования 204 первичных опухолей меланомы была идентифицирована еще одна генная совокупность, состоящая из 121 гена, связанная с метастазированием, которая идентифицирует пациентов с меланомой, имеющих более высокий риск развития такого вида опухолевой прогрессии [41].

Производительность, объективность и надежность определения сигнатур экспрессии генов могут иметь клиническое применение в качестве дополнения к гистопатологическим методам в диагностике и дифференциальной диагностике разных злокачественных новообразований, в том числе и меланоцитарных новообразований, что меняет парадигму рутиной медицинской практики, внедряя в нее диагностические тесты, несущие молекулярную информацию. Но прежде чем этот новый вспомогательный диагностический медицинский инструмент получится внедрить в клинические условия, как, например, это было предпринято в отношении прогностических тестов для рака молочной железы, описанных в данной статье, необходимо будет решить многие оставшиеся без ответа вопросы, касающиеся получения образцов, стратегий нормализации результатов исследований и т.д. [42]. Например, международная коалиция экспертов по меланоме сообщила, что для рандомизированного клинического исследования, оценивающего дополнительную ценность биомаркеров, основанных на прогностической экспрессии генов, потребуются когорты в количестве 1000—9000 пациентов в зависимости от дизайна исследования и проверяемой гипотезы [43].

Таким образом, существуют определенные ограничения в применении современных высокотехнологичных методов диагностики и лечения, в известной степени обеспечивающих минимально радикальное воздействие на пациента с онкологическим заболеванием [44]. Тем не менее интеграция такого рода инструментов уже успешно осуществляется в отношении меланомы кожи. Так, при выборе тактики лечения метастатической формы этого заболевания, согласно последним практическим рекомендациям Российского общества клинической онкологии, рекомендуется молекулярно-генетическое исследование опухоли с целью выявления BRAF-мутации, а при ее отсутствии — молекулярно-генетическое исследование мутаций в генах NRAS (экзон 3) и KIT (экзоны 8, 9, 11, 13, 14, 17, 18), что определяет выбор дальнейшей терапевтической стратегии [45].

Особенности получения и хранения биологических образцов с целью диагностики новообразований на основе оценки профиля экспрессии генов

Так или иначе, за последние несколько десятилетий достижения молекулярной медицины уже изменили характер диагностики и лечения злокачественных опухолей, поскольку новые молекулярные тесты способны не только дополнять, но и во многих случаях превосходить традиционные методы дифференциальной диагностики, а также определять прогноз для пациента и ответ на варианты лечения. В этом аспекте стоит отдельно затронуть проблему получения и хранения биологических образцов в виде биопсийного материала от пациентов.

Замораживание биопсийной ткани пациента с последующим хранением при температуре –80 °C является более предпочтительным методом для тестов на основе молекулярного профилирования, поскольку этот способ обеспечивает высокий выход и высокое качество нуклеиновых кислот и белков, с которым не может сравниться широко распространенный метод фиксации в формалине с последующим заключением в парафин (FFPE, от англ. Formalin Fixation Paraffin Embedding) [46]. До настоящего времени получение замороженных тканей было в основном прерогативой исследовательских программ, но с внедрением новых технологий, подобных описанным в данной статье, такое явление может стать обычным в клинической практике. Ткани, замороженные при сверхнизкой температуре (от –80 до –190 °C) и ткани, фиксированные в формалине с заключением в парафин, имеют свои преимущества и недостатки: гистология замороженной ткани часто достаточна для обеспечения качества, хотя и уступает ткани FFPE для детального микроскопического анализа. Однако в отличие от ткани FFPE ДНК и РНК из замороженных биоптатов, как правило, имеют высокую молекулярную массу и не имеют негативных молекулярных модификаций от действия формальдегида, поэтому подходят для широкого спектра целей [47]. При сверхнизких температурах такие образцы могут храниться от нескольких лет до десятилетий, однако исследования выявили фрагментацию РНК уже через 5 лет, несмотря на хранение при –70 °C или –80 °C [48]. Однако криохранение имеет не только указанные преимущества, но и недостатки: во многих медицинских центрах нет соответствующего персонала или надлежащей инфраструктуры для осуществления криохранения, биомолекулы могут деградировать с увеличением циклов замораживания-оттаивания, а затраты на хранение замороженных образцов намного выше, чем для образцов FFPE [46]. Для решения такого рода проблем разработаны растворы, которые могут служить возможной альтернативой криоконсервации, позволяющие сохранять стабильность молекул РНК и ДНК в ткани при комнатной температуре длительное время, однако сохраненная таким образом ткань не подходит для гистологического исследования. Кроме того, продолжаются исследования, необходимые для надлежащей проверки и подтверждения эффективности сохранения широкого спектра транскриптов мРНК и микроРНК при использовании РНК-стабилизирующих растворов [49].

Персонифицированная медицина становится стандартом медицинской помощи во всем мире, а разработки в области молекулярного профилирования, геномного анализа и открытия новых методов диагностики и лекарственной терапии на основе этих методов являются вектором улучшения показателей выживаемости пациентов и качества жизни.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (№проекта 19-15-00110).