Основными входными воротами возбудителя новой коронавирусной инфекции (COVID-19) являются рецепторы ACE2 альвеолярных клеток II типа, что определяет развитие легочного повреждения разной степени тяжести и распространенности у умерших от COVID-19 [1]. Несмотря на высокую экспрессию ACE2-рецепторов в легочной ткани, объем ее поражения не всегда коррелирует с выраженностью дыхательной недостаточности [2]. Одной из причин этого может быть наличие дополнительных механизмов формирования дыхательной недостаточности.

Известно, что легочная вентиляция зависит в том числе от функционального состояния дыхательной мускулатуры.

В своей работе мы показали, что одним из факторов, обусловливающих прогрессирование дыхательной недостаточности у пациентов с COVID-19, может быть нарушение сократительной способности диафрагмы [3].

Причиной нарушения функции дыхательной мускулатуры может быть, например, миопатия, связанная с прямым цитотоксическим действием вируса. Так, выявлена высокая экспрессия ACE2-рецепторов в миоцитах диафрагмы [4]. Кроме того, причинами диафрагмальной дисфункции могут быть нейропатия диафрагмального нерва различного генеза (COVID-19-ассоциированная нейропатия, диабетическая полинейропатия, респираторная нейропатия критических состояний), нарушение трофики диафрагмальной мышцы вследствие микротромбозов [5—8]. При этом до настоящего времени не раскрыты причины диафрагмальной дисфункции и не описаны гистопатологические признаки ее поражения [9].

Цель настоящего исследования — оценить морфологические изменения диафрагмы и диафрагмального нерва у пациентов, умерших от COVID-19.

Материал и методы

В исследовании методом «случай—контроль» изучали морфологические изменения диафрагмы и диафрагмального нерва у пациентов с COVID-19 крайне тяжелого течения. Исследовали мышечную порцию поясничной части диафрагмы 15 пациентов. Пациенты были стратифицированы в две группы: 1-я группа — основная (n=12) — пациенты, умершие от COVID-19-инфекции, осложненной SARS-CoV-2-ассоциированной пневмонией, прижизненно подтвержденной наличием РНК SARS-CoV-2, основной причиной смерти которых явилось прогрессирование дыхательной недостаточности, 2-я группа — контроль (n=3) — пациенты ОРИТ с диагнозом острого нарушения мозгового кровообращения по ишемическому типу (без паренхиматозной дыхательной недостаточности). Всем пациентам проводили инвазивную искусственную вентиляцию легких (ИВЛ). Сроки пребывания на ИВЛ для всех пациентов не превышали 5 сут. Ни у одного из пациентов в обеих группах не было ранее существовавшего нервно-мышечного заболевания. Также пациенты обследуемых групп не различались по полу, возрасту и индексу массы тела.

При патолого-анатомическом исследовании забирали участок мышечной порции поясничной части диафрагмы и левого диафрагмального нерва из области перикарда. Гистологические препараты готовили путем фиксации ткани диафрагмы в течение 72—96 ч в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживания в спиртах восходящей концентрации и заливки в парафин. Срезы толщиной 7 мкм изготавливали на микротоме SAKURA ACCU-CUT SRM 200, Model: CRM 200 CW (Китай) и окрашивали гематоксилином и эозином. Для оценки количества гликогена в ткани препараты окрашивали по методу Гочкисс—Мак Минус (реакция ШИК).

Для микроскопического исследования препаратов использовали микровизор медицинский проходящего света mVizo-101 (ЛОМО, Россия). Исследование и микрофотографирование проводили с использованием объектива — 5/0,10, 20/0,45, 63/0,85; видеонасадки — XT0028, при этом линейное увеличение микровизора составляло 63—788.

Морфометрию проводили с помощью програмного обеспечения микровизора. На каждом срезе выбирали 10 полей зрения по методу случайных чисел.

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics (версия 25). Проверку на нормальность распределения проводили с помощью теста Шапиро—Уилка. Описательная статистика количественных признаков представлена медианой, нижним и верхним квартилями — Me [Q25; Q75], качественные данные приведены в виде абсолютных значений и долей (в %). Для сравнения качественных данных в несвязанных выборках использовали точный тест Фишера, для сравнения количественных признаков с асимметричным распределением в несвязанных выборках — U-критерий Манна—Уитни, в связанных — T-критерий Уилкоксона. Критический уровень статистической значимости определяли как p<0,05.

Результаты и обсуждение

При морфологическом исследовании препаратов ткани пациентов, умерших от COVID-19 при прогрессировании дыхательной недостаточности (1-я группа), в диафрагме определялись выраженный отек периваскулярных пространств, выраженный отек перицеллюлярных пространств мышечных волокон и диапедезные кровоизлияния.

При морфологическом исследовании тканей пациентов 2-й группы в диафрагме выявлялся выраженный отек перицеллюлярных пространств мышечных волокон, выраженный отек периваскулярных пространств, при этом диапедезных кровоизлияний не было.

В сосудистом русле диафрагмы пациентов 1-й группы определялось полнокровие в артериолах, в большинстве венул и капилляров выявлялись красные тромбы.

В сосудистом русле диафрагмы пациентов 2-й группы определялись свободно лежащие эритроциты в артериолах и капиллярах, полнокровие в венулах — без образования красных тромбов.

У пациентов 1-й группы диагностировался выраженный отек периневрального пространства диафрагмального нерва, внутри нервного ствола выявлялся выраженный отек вокруг нервных волокон.

У пациентов 2-й группы определялся умеренно выраженный отек периневрального пространства диафрагмального нерва с vasa nervorum и свободно лежащими в нем эритроцитами, внутри нервного ствола выявлялся слабовыраженный отек вокруг нервных волокон.

При световой микроскопии препаратов диафрагмы, окрашенных по Гочкисс—Мак Минус, в мышечных клетках пациентов 1-й группы глыбки гликогена представлены в виде единичных элементов, мелких скоплений, которые выявлялись не во всех мышечных волокнах.

При световой микроскопии препаратов диафрагмы, окрашенных по Гочкисс—Мак Минус, в мышечных клетках пациентов 2-й группы глыбки гликогена располагались в виде скоплений и выявлялись почти во всех мышечных волокнах.

Результаты морфометрического исследования диафрагмы пациентов обеих групп представлены в таблице.

Морфометрия диафрагмы и диафрагмального нерва, Me [Q25; Q75]

Примечание. * — различие имеет статистическую значимость (p<0,05).

В результате статистического анализа данных морфометрии выявлено значимое различие по всем исследуемым параметрам, а именно для пациентов, умерших от COVID-19-инфекции, характерны более выраженный отек миоциов и межуточной ткани, снижение количества гликогена миоцитов и отек нервных волокон диафрагмального нерва.

Таким образом, диафрагма пациентов, умерших от COVID-19, имеет следующие гистопатологические изменения: отек миоцитов и межуточной ткани, а также полнокровие артериол, венул и капилляров с наличием красных тромбов в их просвете. Диафрагмальный нерв пациентов, умерших от COVID-19, также имеет четкие патологические изменения в виде периневрального отека и отека нервных волокон нервного ствола. Проведенное исследование подтверждает характерную патологическую картину органного поражения при COVID-19 — это диапедезные кровоизлияния, тромбоз сосудов преимущественно микроциркуляторного русла [10], периваскулярный [11] и интерстицальный отеки [5, 12], гистопатологические признаки поражения нервной системы [9, 11]. Кроме того, выявлены гистопатологические признаки нарушения углеводного обмена в виде уменьшения количества гликогена миоцитов. Однако до настоящего времени не совсем понятен ведущий патологический механизм органного повреждения, а именно: связан ли он с прямым цитотоксическим действием вируса, нарушением трофики вследствие отека, тромбозов или с нарушением углеводного обмена вследствие других причин, что требует дальнейшего исследования.

Выводы

1. Диафрагма пациентов, с подтвержденным диагнозом COVID-19, основной причиной смерти которых явилось прогрессирование дыхательной недостаточности, имеет отчетливые патологические изменения, что может усугублять дыхательную недостаточность.

2. Изменения диафрагмального нерва, документированные у пациентов, умерших от COVID-19, имеет четкие патологические изменения, которые могут способствовать нарушению функции диафрагмы.

3. У пациентов, умерших от COVID-19, снижено количество гликогена миофибрилл по сравнению с пациентами с дыхательной недостаточностью преимущественно центрального генеза.

4. Нарушение метаболизма диафрагмы требует дальнейшего изучения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Ю. Яковлев, А.А. Певнев

Сбор и обработка материала — А.А. Певнев, В.О. Никольский, А.Ю. Сморкалов, В.Н. Максимычев

Статистическая обработка — А.А. Певнев

Написание текста — А.Ю. Яковлев, А.А. Певнев

Редактирование — А.Ю. Яковлев

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.