PI3K/Akt/mTOR-сигнальный путь представляет одну из магистральных внутриклеточных систем, которая определяет биологическое поведение опухоли, прогноз и резистентность к терапии при раке молочной железы (РМЖ). Изменение активности PI3K/Akt/mTOR может происходить при возникновении мутаций в генах, кодирующих белки, участвующие в передаче сигналов по данному пути или осуществляющие отрицательную регуляцию его активности, или приводящие к перекрестным взаимодействиям с другими сигнальными путями, ответственными за опухолевую прогрессию. Наиболее часто при РМЖ встречаются мутации в гене PIK3CA, кодирующем каталитическую субъединицу p110α фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) — ключевого элемента PI3K/Akt/mTOR-каскада [1].

По своей структуре, субстрат-специфичности и механизмам регуляции киназы PI3K делятся на 3 класса (I, II и III), первый из которых разделен также на подклассы — IA и IB. Все 3 класса этих ферментов участвуют в регуляции клеточных процессов, но только киназы класса IA значимо вовлечены в процесс канцерогенеза [2]. PI3K класса IA состоит из 2 субъединиц: каталитической p110α и регуляторной p85. В физиологических условиях регуляторная субъединица связана с каталитической, что стабилизирует ее структуру и ингибирует активность.

При раке молочной железы частота мутаций PIK3CA, по данным разных исследователей, варьирует от 25—30 до 45% [1, 3]. Большинство мутаций локализуется в 9-м и 20-м экзонах гена, кодирующих спиральный (p.E542K, p.E545X) или киназный (p.H1047X) домены каталитической субъединицы p110α, соответственно [4]. Мутации, затрагивающие разные домены, имеют неодинаковые функциональные последствия и поэтому могут по-разному влиять на биологические свойства опухоли [5]. Так, показано, что РМЖ с мутациями в 9-м и 20-м экзонах PIK3CA значимо отличаются по показателям общей и безрецидивной выживаемости [6]. То же самое отмечено в отношении реже встречающихся мутаций в 7-м экзоне, кодирующем C2-домен, а также двойных мутаций PIK3CA [7]. Поэтому не только сам факт наличия мутаций в гене PIK3CA, но и их количество и локализация могут иметь важное значение при РМЖ.

Надо отметить, что при всех функциональных различиях предиктивное значение мутаций, локализованных в разных экзонах, в отношении алпелисиба, по-видимому, одинаковое [8]. Стратегия ингибирования PI3K в дополнение к эндокринной терапии при наличии мутаций PIK3CA показала свою эффективность в крупных клинических исследованиях SOLAR-1 и BYLieve [8, 9]. Поэтому в настоящее время тестирование на наличие мутаций PIK3CA является стандартом клинической практики для всех пациенток с распространенным или метастатическим люминальным Her2-негативным РМЖ, характеризующимся экспрессией рецепторов эстрогена (ЭР) и/или прогестерона и отсутствием или низким уровнем экспрессии белка Her2/neu.

В текущих рекомендациях по оценке Her2-статуса с помощью иммуногистохимического (ИГХ) анализа и гибридизации in situ (ISH), разработанных Американским обществом клинической онкологии и коллегией американских патологов (ASCO/CAP), не указана необходимость разграничения РМЖ с отсутствием экспрессии и с низким уровнем Her2/neu [10]. Вместе с тем, как показало недавнее исследование DESTINY-BREAST04, между такими опухолями имеются существенные отличия. Оказалось, что таргетный препарат из группы ADC (antibody—drug conjugates — конъюгат антитела с лекарством) трастузумаб дерукстекан эффективен в отношении ранее получавших лечение пациенток с неоперабельным и/или метастатическим РМЖ с низким уровнем экспрессии Her2/neu [11]. Хотя амплификация гена Her2 в этих опухолях отсутствует, низкий уровень экспрессии Her2/neu тем не менее может иметь важное клиническое значение. По результатам исследования DESTINY-BREAST04 опухоли с экспрессией Her2/neu, оцененной по данным ИГХ-анализа на 1+ или 2+ (при условии отрицательного результата ISH), предложено выделять в отдельную категорию, так называемый Her2-low РМЖ.

Несмотря на появление терапии, направленной на Her2-low-опухоли, вопрос о том, являются ли они отдельным подтипом РМЖ или это просто обобщающий термин, характеризующий уровень экспрессии Her2/neu, остается нерешенным. Ретроспективная оценка клинико-патологических параметров Her2-low-опухолей показала, что отличительной их особенностью являются положительный ЭР-статус и люминальный B-подтип. Для Her2-low РМЖ характерны более крупные размеры по сравнению с опухолями с отсутствием экспрессии Her2/neu, и более частое вовлечение лимфатических узлов [12]. Однако в отношении прогностической значимости низкой экспрессии Her2/neu получены противоречивые результаты. Так, ретроспективный анализ данных 1097 пациенток с РМЖ из Атласа генома рака (The Cancer Genome Atlas, TCGA) продемонстрировал отсутствие различий в общей и безрецидивной выживаемости между группами Her2-low и опухолей с отсутствием экспрессии Her2/neu [13]. Такие же результаты получены в исследовании F. Schettini и соавт. [14] на выборке из 3689 больных. Однако работы других авторов [15] показали, что Her2-low РМЖ являются прогностически более благоприятными по сравнению с опухолями, где экспрессия Her2/neu отсутствует. В то же время есть данные о том, что полный патоморфологический ответ при проведении неоадъювантной химиотерапии в Her2-low РМЖ отмечается реже, чем в опухолях с отсутствием экспрессии Her2/neu, это косвенно свидетельствует о более высоком риске возникновения рецидивов и более низких показателях выживаемости в этой группе больных [16].

Her2-low РМЖ являются группой опухолей, определяемой исключительно на основе ИГХ-анализа и метода ISH с учетом всего лишь одного параметра (уровня экспрессии Her2/neu). С этой точки зрения чрезвычайно важными представляются изучение механизмов патогенеза Her2-low РМЖ и поиск специфических для данных опухолей молекулярных маркеров, в том числе прогнозирующих течение заболевания и являющихся потенциальными мишенями для терапевтического воздействия.

Цель исследования — оценить, существуют ли отличия в характере мутаций гена PIK3CA при Her2-low РМЖ по сравнению с опухолями, в которых экспрессия Her2/neu отсутствует.

Материал и методы

В исследование было включено 96 пациенток с люминальным Her2-негативным распространенным и/или метастатическим, прогрессирующим на фоне гормонотерапии РМЖ, возраст которых составил от 37 до 85 лет (медиана возраста 63 года). Верификация диагноза и определение Her2-статуса были выполнены в условиях лаборатории высокотехнологичных методов диагностики ГБУ Ростовской области «Патолого-анатомическое бюро». Her2-негативными считались опухоли, которые после выполнения ИГХ-исследования с использованием антител к HER2/neu (Ventana anti-HER2/neu 4B5 Rabbit Monoclonal Primary Antibody, система визуализации Ventana UltraView Universal DAB) получили оценку 0 или 1+ по балльной шкале от 0 до 3+. При неопределенной экспрессии Her2 (2+) для уточнения Her2-статуса выполнялось исследование методом ISH согласно рекомендациям ASCO/CAP 2018 г. В исследование включались только те пациентки с экспрессией Her2 2+, в опухолях которых ISH-исследование показало отсутствие амплификации гена Her2.

Все пациентки подписали добровольное информированное согласие на проведение молекулярно-генетического исследования. Все клинические данные пациенток были деперсонифицированы.

Выявление мутаций в гене PIK3CA

Образцы, содержащие менее 50% опухолевых клеток, подвергались ручной микродиссекции во избежание получения ложноотрицательных результатов. ДНК выделяли с помощью набора DNA Sample Preparation Kit (Roche, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Если последующая качественная и количественная оценка ДНК не соответствовала критериям для дальнейшего ПЦР-анализа мутаций, экстракцию ДНК повторяли, используя большее количество материала. Определение мутаций в гене PIK3CA проводилось методом мультиплексной аллель-специфичной ПЦР с детекцией в режиме реального времени с использованием набора реактивов cobas PIK3CA Mutation Test (Roche, Германия) и анализатора cobas z 480.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы XLStat 2022 для Microsoft Excel (Addinsoft, Франция). Значения ожидаемых частот мутаций в спиральном и киназном доменах гена PIK3CA, необходимые для определения размера выборки, получены в предварительно проведенном исследовании на группе больных, состоящей из 32 человек [17]. Номинативные данные описывали с указанием абсолютных значений и процентных долей. Сравнение групп осуществляли построением четырехпольных таблиц сопряженности с использованием критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера (при абсолютных значениях хотя бы одного показателя в таблице менее 5). Результаты считали статистически значимыми при p<0,05. В качестве количественной меры эффекта при сравнении групп использовали показатель отношения шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ). Показатель ОШ являлся статистически значимым, если 95% ДИ не включал в себя единицу.

Результаты

По статусу экспрессии белка Her2/neu все 96 пациенток были разделены на две группы. В группу с низкой экспрессией Her2/neu вошли 43 (44,8%) больных, получивших при ИГХ-исследовании с использованием антител к Her2/neu (клон 4B5) оценку по балльной шкале 1+ (рисунок, а) или 2+ (рисунок, б) в сочетании с отрицательным результатом ISH, в группу с отсутствием экспрессии Her2/neu — 53 (55,2%) пациентки, получившие оценку по балльной шкале 0.

Her2-статус в Her2-low-карциномах молочной железы.

а — экспрессия Her2/neu 1+; б — экспрессия Her2/neu 2+. Иммуногистохимическая реакция с антителами к Her2/neu, ×200.

Морфологически у подавляющего числа пациенток (87 человек) был верифицирован инфильтративный РМЖ неспецифического типа. Дольковый рак был выявлен у 5 пациенток, тубулярный — у 3 и муцинозный — у 1. Распределение опухолей по степени дифференцировки опухоли было следующим: G1 встречалась в 10,4% случаев, G2 и G3 — в 60,4 и 29,2% случаев соответственно. Всего в 96 исследованных образцах РМЖ выявлены 40 различных мутаций гена PIK3CA, что составило 41,6% (табл. 1).

Таблица 1. Выявленные мутации PIK3CA (n=40) и соответствие их локализации в гене аминокислотным заменам в структуре белка p110α

Самыми частыми вариантами замен оказались p.H1047X (17/40; 42,5%), p.E545K (11/40; 27,5%) и p.E542K (7/40; 17,5%). Эти цифры согласуются с опубликованными данными о частоте мутаций PIK3CA при гормонопозитивном Her2-негативном РМЖ [1, 4]. При сравнении распределения мутаций PIK3CA при РМЖ с низкой экспрессией Her2/neu по сравнению с опухолями, где экспрессия Her2/neu отсутствовала, выявлено увеличение частоты их встречаемости в первой группе (табл. 2).

Таблица 2. Мутации в гене PIK3CA в образцах с низкой экспрессией и без экспрессии белка Her2/neu

Как видно из табл. 2, в группе больных с отсутствием экспрессии Her2/neu самыми частыми являлись мутации в 20-м экзоне PIK3CA (p.H1047X), соответствующем киназному домену белкового продукта (11/19; 58%). Напротив, мутации в 9-м экзоне, кодирующем спиральный домен (p. E542K, p. E545X), преобладали у пациенток с низкой экспрессией Her2/neu (13/21; 61,9%). Более редкие мутации р.N345K и p.C420R в 7-м экзоне были идентифицированы в 4 случаях, причем чаще они обнаруживались в группе с отсутствием экспрессии Her2/neu. Мутация p.G1049R, локализованная рядом с p.H1047X в 20-м экзоне, выявлена в одном образце. Опухолей с несколькими различными мутациями PIK3CA не было.

Точный тест Фишера позволил определить статистически значимые различия в количественном распределении мутаций в 9-м экзоне гена PIK3CA между группами больных с низкой экспрессией белка Her2/neu и с отсутствием его экспрессии (p=0,029). Показатель отношения шансов наличия мутаций в 9-м экзоне в группе с низкой экспрессией белка Her2/neu по сравнению с группой с отсутствием экспрессии составил 2,6. Различия шансов были статистически значимыми (95% ДИ: 1,18—17,89).

Обсуждение

Возникновение мутаций в гене PIK3CA, кодирующем каталитическую субъединицу PI3K класса IA р110α, является распространенным механизмом активации сигнального каскада PI3K/Akt/mTOR в различных злокачественных новообразованиях, в том числе при РМЖ. Частота мутаций PIK3CA в нашем исследовании составила 41,6%, что соответствует многочисленным опубликованным данным [1, 3, 4]. Большинство из них локализовались в так называемых горячих точках 9-го и 20-го экзонов, кодирующих спиральный (p.E542K, p.E545X) или киназный (p.H1047X) домены каталитической субъединицы p110α соответственно. Мутации p.N345K и p.С420R, относящиеся к C2-домену, встречались гораздо реже — в общей сложности в 10% случаев. Мутация p.G1049R, локализованная рядом с p.H1047X в 20-м экзоне, кодирующем киназный домен, была обнаружена только в одном образце. В базах данных COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer — Каталог соматических мутаций при раковых заболеваниях) и OncoKB эти мутации считаются патогенными и онкогенными, но их прогностическое значение и чувствительность к ингибиторам PI3K требует дополнительного изучения.

Известно, что активация субъединицы p110α при наличии мутаций в 9-м экзоне, соответствующем спиральному домену, происходит за счет ослабления ингибирования, обусловленного nSH-доменом регуляторной субъединицы p85 [18]. Мутации в 20-м экзоне, кодирующем киназный домен, не только приводят к конформационным изменениям АТФ-связывающего кармана PI3K, но и облегчают рекрутирование этого белка на клеточную мембрану, что в совокупности приводит к усилению его активности [18]. Интересно, что в опухолях с двойными мутациями PIK3CA, затрагивающими спиральный и киназный домен одновременно, они проявляют себя комплементарно и независимо друг от друга, приводя к синергетическому результату и указывая на то, что молекулярные механизмы их действия различны [19].

Наше исследование продемонстрировало статистически значимое увеличение частоты встречаемости мутаций в 9-м экзоне гена PIK3CA (p.E542K, p.E545X) при РМЖ с низкой экспрессией Her2/neu по сравнению с опухолями, где экспрессия Her2/neu отсутствовала (p<0,05). Мутации как в 9-м экзоне (спиральный домен), так и в 20-м (киназный домен) являются клинически значимыми и рассматриваются как важные биомаркеры течения заболевания и ответа на таргетную терапию. Однако локализация мутаций влияет на функции белка PI3K и активность сигнального пути PI3K/Akt/mTOR в целом. Так, замечено, что мутации в 9-м экзоне определяют более высокую пролиферативную активность опухоли, а мутации в 20-м экзоне — более выраженный миграционный (а значит, и метастатический) потенциал [20].

Показано, что в образцах клеточной линии Her2-положительного РМЖ SK-BR-3 уровень экспрессии Her2/neu зависит от локализации мутаций в гене PIK3CA. Мутации в 20-м экзоне PIK3CA (p.H1047X, p.G1049R) в отличие от мутаций в 9-м экзоне (p.E542K, p.E545X) сопровождаются более низкой экспрессией клетками Her2/neu как на уровне мРНК, так и на уровне белка [21]. При этом активность белка PI3K оставалась высокой, из чего авторы сделали вывод, что при наличии мутаций в 20-м экзоне, кодирующем киназный домен, каскад PI3K/Akt/mTOR становится независимым от Her2/neu-регуляции. С другой стороны, при наличии мутаций p.E542K и p.E545X каталитическая активность субъединицы p110α остается сравнительно слабой и для активации сигнального пути PI3K/Akt/mTOR участие Her2/neu остается необходимым условием.

О более слабом влиянии мутаций, кодирующих спиральный домен, на активацию сигнального пути PI3K/Akt/mTOR говорят и ранние исследования. Так, показано, что по сравнению с белком, кодируемым PIK3CA с мутацией в 20-м экзоне, белок — продукт гена с мутацией в 9-м экзоне менее эффективен в активации Akt и других эффекторов, участвующих в сигнальном каскаде PI3K/Akt/mTOR [22].

Предполагают также, что поскольку активация белка p110α с мутацией p.H1047X не зависит от рецептора Her2/neu, селективное давление на клетки, несущие данную мутацию PIK3CA, при любых уровнях экспрессии Her2/neu отсутствует [21]. Поэтому в Her2-негативных типах РМЖ, в частности тройном негативном РМЖ, мутации в 20-м экзоне, соответствующем киназному домену, встречаются чаще, чем мутации в 9-м экзоне (спиральный домен) [4]. Наше исследование показало, что в гормонопозитивных Her2-отрицательных РМЖ (с ИГХ-оценкой 0) выявляется та же закономерность. Напротив, в Her2-low РМЖ, как нам удалось установить, более частыми являлись мутации в 9-м экзоне, кодирующем спиральный домен белка-продукта гена PIK3CA: они встречались в 13 (61,9%) из 21 выявленного случая. Если предположить, что каталитическая активность киназы PI3K при локализации мутаций в разных экзонах отличается, то наши данные могут свидетельствовать о том, что в Her2-low РМЖ существует механизм ее функциональной компенсации. Экспрессия Her2/neu хотя бы на низком уровне, возможно, необходима как дополнительное условие активации сигнального пути PI3K/Akt/mTOR при наличии мутации в 9-м экзоне, соответствующем спиральному домену каталитической субъединицы p110α. Мутации в 20-м экзоне, кодирующем киназный домен, приводят к активации PI3K независимо от уровня экспрессии Her2/neu.

Her2-low-опухоли во многом стоят особняком среди других РМЖ. Основываясь на существующих критериях оценки Her2-статуса, можно оценить их долю в 45—55% от общего количества случаев РМЖ. Несмотря на появление терапии для данной группы больных, остается чрезвычайно важным определение биологических характеристик Her2-low-опухолей и их прогностической значимости. Полученные результаты дополняют концепцию, рассматривающую Her2-low-опухоли отдельно от других молекулярно-генетических подтипов РМЖ, и указывают на необходимость их дополнительного изучения.

Заключение

Учитывая ведущую роль РМЖ в общей структуре онкологической заболеваемости, планирование лечения на основе данных генетического анализа конкретных больных представляется чрезвычайно важным. В результате проведенного исследования выявлены и описаны мутации гена PIK3CA, характерные для РМЖ с низкой экспрессией и с отсутствием экспрессии белка Her2/neu. Установлено, что частота мутаций в 9-м экзоне, кодирующем спиральный домен (p.E542K+p.E545X) белка p110α, варьирует в зависимости от уровня экспрессии Her2/neu, что, возможно, указывает на существование различий в механизмах активации сигнального пути PI3K/Akt/mTOR в зависимости от локализации мутаций в гене PIK3CA. Наблюдаемый характер мутационных изменений позволяет также предположить обособленность опухолей с низкой экспрессией Her2/neu от других молекулярно-генетических подтипов РМЖ, в связи с чем необходимо их дальнейшее углубленное изучение.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И.А. Павленко, П.Е. Повилайтите

Сбор и обработка материала — Н.С.Макаревич, В.Ю. Кацияев, А.В. Петров

Статистическая обработка результатов — И.А. Павленко

Написание текста — И.А. Павленко

Редактирование текста — П.Е. Повилайтите, А.В. Петров

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.