На сегодняшний день имеются исследования, согласно которым предшествующее доброкачественное заболевание молочной железы удваивает риск развития злокачественного новообразования [1]. При этом отмечают, что наличие пролиферативных изменений в молочной железе в большей степени способствует развитию рака в долгосрочной перспективе [2]. Так, результаты исследования 778 306 женщин показывают, что повышенный риск развития рака отмечался в течение 20 лет после постановки диагноза доброкачественного заболевания молочной железы [3]. Результаты этой работы подчеркивают идею, что у женщин с повышенной пролиферативной активностью ткани молочной железы чаще возникают аномальные клетки, что впоследствии может проявляться как злокачественные опухоли.
Известно, что рак молочной железы включает широкий спектр гетерогенных опухолей [4], и большинство медицинских учреждений используют классификацию, основанную на иммуногистохимической оценке биомаркеров рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR), рецептора эпидермального фактора роста 2-го типа (HER2) и маркера пролиферации Ki-67. Эти биомаркеры используются для формирования подтипов рака молочной железы с различными клиническими последствиями [5]. Например, люминальные подтипы имеют более благоприятный прогноз по сравнению с тройным негативным подтипом из-за их чувствительности к гормональной терапии.
В последние годы активно ведутся поиски новых маркеров, в качестве которых могут выступать соединения, играющие ведущие роли в эпителиально-мезенхимальном переходе (ЭМП), в ходе которого формируется фенотип клеток с повышенными миграционными возможностями и более высокой инвазивностью [6]. При этом некоторые опухолевые клетки обладают гибридом эпителиального и мезенхимального фенотипов, и в одной и той же опухоли есть клетки, которые находятся в разных состояниях этого процесса [7]. Классическим признаком ЭМП является снижение уровня E-кадгерина — мембранного маркера эпителиальных клеток, поддерживающего межклеточные контакты, что ведет к дестабилизации эпителиальных соединений и сопровождается повышением подвижности клеток [8]. Известно, что низкая экспрессия E-кадгерина связана с метастазированием и снижением выживаемости у пациенток с раком молочной железы [9]. ЭМП сопровождается повышением экспрессии интегринов, обширного класса мембранных молекул, обеспечивающих межклеточный контакт и передачу сигналов между клетками [10]. Выдвинуто предположение, что интегрины обеспечивают взаимодействие опухолевых клеток и тромбоцитов, тем самым усиливая рост и прометастатическую прогрессию опухоли [11]. В исследованиях последних лет отмечено, что высокая экспрессия интегринов и, в частности, интегрина 1β связана с низкими показателями выживаемости и метастатическим статусом у пациенток с раком молочной железы [12]. В качестве еще одной молекулы, играющей существенную роль при ЭМП, можно рассматривать коллаген, поскольку известно, что при опухолевой трансформации эпителиальные неопластические клетки приобретают способность синтезировать коллагены, повышающие устойчивость раковых клеток к протеолитической деградации, что имеет большое значение для злокачественной прогрессии [6]. Кроме того, повышенная секреция коллагена II типа как опухолевыми клетками, так и фибробластами усиливает миграцию эндотелиальных клеток, что приводит к увеличению васкуляризации опухоли, а также стимулирует рост самой опухоли [13]. Еще одной молекулой, опосредованно связанной с ЭМП, является циклин D1 — регулятор клеточного цикла, стимулирующий переход клеток из состояния покоя (G1) в фазу синтеза (S) [14]. Известно, что нарушение регуляции циклина D1, а именно его сверхэкспрессия и накопление делают эту молекулу онкогенной, что и отмечается в ряде опухолей, в том числе и при раке молочной железы [15]. Необходимо подчеркнуть, что ЭМП отсутствует в здоровых тканях, но может наблюдаться при доброкачественных заболеваниях молочной железы, что ведет к клеточной атипии и, возможно, к развитию злокачественного новообразования. Следовательно, используя маркеры ЭМП, мы можем лучше изучить потенциальное прогрессирование и малигнизацию новообразований до инвазивного, метастатического рака молочной железы.
Цель исследования — изучение экспрессии маркеров эпителиально-мезенхимального перехода в ткани рака молочной железы разных молекулярных подтипов и у пациенток с доброкачественными заболеваниями молочной железы с различным риском злокачественной трансформации.
Материал и методы
Исследовали образцы опухолей молочной железы 58 женщин с инвазивной карциномой неспецифического типа (ИКНТ) в возрасте от 23 до 72 лет, средний возраст 54 года, а также 17 женщин с доброкачественными заболеваниями молочной железы (ДЗМЖ) в возрасте от 18 до 67 лет, средний возраст 46 лет. Пациенткам проводили мастэктомию на базе онкологического отделения ГКБ №1 Новосибирска. Неоадъювантная терапия не проводилась. Окончательный диагноз устанавливался на основании патоморфологического исследования. Все пациентки с ИКНТ имели размер опухоли T1-2 и G2-умеренную дифференцировку опухоли. Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрено комитетом по этике Научно-исследовательского института молекулярной биологии и биофизики подразделения ФИЦ ФТМ (протокол №2016-3). От каждой пациентки получено информированное согласие на проведение исследования и получение образцов опухолей, подписанное самой пациенткой и заверенное врачом. Уровни экспрессии E-кадгерина, коллагена II, интегрина 1β, циклина D1 определяли в депарафинизированных срезах образцов опухолей с использованием моноклональных антител: анти-E-кадгерин (BD Biosciences, США), анти-CD29 (BD Transduction Laboratories, США), анти-CII (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) и анти-Cyclin D1 (Cloud-clone corp.) в соответствии с рекомендациями производителей. Для визуализации первичных антител использовали систему Novocastra Peroxidase Detection System REF7120-K (Leica Biosystems). Анализ экспрессии исследуемых маркеров проводили с помощью морфометрического комплекса на базе микроскопа MICROMED-6, цифровой камеры DSM 510 и программного обеспечения ImageJ 1.42g (NIH, США). У каждой пациентки оценивали по 10 изображений (площадь каждого составляла 95578 мкм2). Для оценки использовали отношение абсолютного количества эпителиальных клеток, экспрессирующих маркер, к абсолютному количеству эпителиальных клеток, не экспрессирующих маркер, данные представлены в виде условных единиц (у.е.). Статистическую обработку проводили с использованием SPSSv22.0 для Windows. Для сравнения независимых групп использовали критерий U Манна—Уитни. Статистически значимыми считали различия при p<0,05. Результаты исследования представлены как медиана и интерквартильный размах (Me; Q25—Q75).
Результаты и обсуждение
Было проведено сравнение показателей экспрессии маркеров ЭМП, а именно E-кадгерина, коллагена II, интегрина 1β и циклина D1 у больных с ИКНТ и пациенток с ДЗМЖ (табл. 1).
Таблица 1. Показатели экспрессии маркеров ЭМП (в у.е.) в образцах ткани молочной железы у пациенток с инвазивной карциномой неспецифического типа и доброкачественными заболеваниями молочной железы
| Маркер | E-кадгерин | Интегрин 1β | Коллаген II | Циклин D1 |
| ДЗМЖ, n=17 | 4,79 (3,36—48,23) | 0,10 (0,01—0,19) | 0,12 (0,05—0,18) | 0,36 (0,13—1,97) |
| ИКНТ, n=58 | 2,46 (0,13—11,25) | 0,14 (0,07—0,33) | 0,09 (0,05—0,21) | 11,13 (2,04—29,35) |
| p | 0,020 | 0,026 | 0,0001 |
Примечание. Статистическая значимость различий определена при помощи непараметрического U-критерия Манна—Уитни
Показатели пациенток с ИКНТ статистически значимо отличались от таковых с ДЗМЖ по экспрессии E-кадгерина, интегрина 1β и циклина D1. Экспрессия интегрина 1β и циклина D1 была выше при ИКНТ, а экспрессия E-кадгерина была выше у больных с ДЗМЖ (см. табл. 1; рис. 1). Такое распределение показателей экспрессии изучаемых маркеров соответствует процессу ЭМП, протекающему гораздо более активно при инвазивном типе опухоли [9]. Учитывая высокую гетерогенность заболеваний, было решено разделить их на группы на основании патоморфологического исследования. Пациенток с ДЗМЖ разделили на две группы, в одну были включены лица с низким риском злокачественной трансформации согласно данным литературы [2], а именно с фиброаденомой (группа A), а в другую — с повышенным риском злокачественной трансформации — с пролиферативной формой фиброзно-кистозной болезни, фиброаденоматозом и со склерозирующим аденозом (группа B).
Рис. 1. Экспрессия E-кадгерина, интегрина 1β и циклина D1 в образцах опухоли у пациенток с инвазивной карциномой неспецифического типа и с доброкачественными заболеваниями молочной железы.
а — выраженная экспрессия E-кадгерина в фиброаденоме; б — слабая экспрессия интегрина 1β в образце фиброаденоматоза; в — отсутствие экспрессии циклина D1 в фиброаденоме; г — слабая экспрессия E-кадгерина (ИКНТ с T2N1M0, G2, люминальный B— подтип); д — умеренная экспрессия интегрина 1β (ИКНТ с T2N0M0, G2, тройной негативный подтип); е — выраженная экспрессия циклина D1 (ИКНТ с T1N0M0, G2, HER2+ молекулярный подтип). Иммуногистохимическая реакция, ×400.
Пациенток с ИКНТ (группа C) разделили на 5 подгрупп согласно молекулярному подтипу опухоли, определенному патоморфологически с помощью иммуногистохимического анализа; данные представлены в табл. 2.
Таблица 2. Молекулярные подтипы карциномы молочной железы
| Подгруппа | Молекулярный подтип | ER | PR | HER2 | Ki-67,% | Возраст, лет |
| 1-я, n=23 | Люминальный A | + | +/– | – | Менее 20 | 57 (35—72) |
| 2-я, n=13 | Люминальный B HER2-отрицательный | + | +/– | – | 20 и более | 50 (23—66) |
| 3-я, n=5 | Люминальный B HER2-положительный | + | +/– | + | Различный | 54 (47—58) |
| 4-я, n=5 | HER2-положительный | – | — | + | То же | 55 (40—69) |
| 5-я, n=12 | Тройной негативный | – | — | – | » » | 52 (38—69) |
Примечание. ER — рецептор эстрогена, PR — рецептор прогестерона, HER2 — рецептор эпидермального фактора роста 2, Ki-67 — маркер пролиферации.
При сравнении экспрессии маркеров в группах пациенток с заболеваниями молочной железы с использованием H-критерия Краскела—Уоллиса статистически значимые различия были получены по экспрессии интегрина 1β и циклина D1. Результаты парного сравнения экспрессии маркеров ЭМП в 7 исследуемых группах пациенток с помощью U-критерия Манна—Уитни представлены в табл. 3.
Таблица 3. Показатели экспрессии маркеров ЭМП (в у.е.) в образцах ткани молочной железы
| Маркер | Группа A, n=6 | Группа B, n=11 | Группа C, n=58 | ||||
| 1-я подгруппа, n=23 | 2-я подгруппа, n=13 | 3-я подгруппа, n=5 | 4-я подгруппа, n=5 | 5-я подгруппа, n=12 | |||
| Me (Q0,25—Q0,75): | |||||||
| E-кадгерин | 34,51 (3,52—62,18) | 4,57 (2,80—32,56) | 2,18 (0,09—11,80) | 1,49 (0,09—4,79) | 2,85 (0,36—11,05) | 15,53 (0,15—120,97) | 5,25 (0,59—11,05) |
| pA—2=0,018 | pA—1=0,041 | pB-2=0,034 | |||||
| Интегрин 1β | 0,11 (0,01—0,21) | 0,10 (0,01—0,18) | 0,16 (0,08—0,37) | 0,09 (0,03—0,19) | 0,34 (0,17—2,83) | 0,08 (0,02—0,23) | 0,14 (0,08—0,32) |
| pA—3=0,028 | pB—3=0,017 | pB—1=0,023 | p2—3=0,043 | p3—4=0,047 | |||
| Коллаген II | 0,16 (0,09—0,41) | 0,10 (0,02—0,14) | 0,12 (0,05—0,35) | 0,08 (0,05—0,16) | 0,14 (0,11—0,26) | 0,07 (0,03—0,23) | 0,06 (0,03—0,07) |
| pA—5=0,028 | p1—5=0,024 | p3—5=0,026 | |||||
| Циклин D1 | 1,95 (0,38—3,17) | 0,21 (0,06—0,60) | 4,04 (0,86—14,44) | 11,52 (4,39—20,97) | 16,64 (7,27—43,47) | 21,83 (8,43—41,87) | 17,94 (1,70—32,22) |
| pA—B=0,030 | pB—1=0,006, p1—4=0,047 | pA—2=0,011, pB—2=0,002 | pA—3=0,011, pB—3=0,016 | pA—4=0,011, pB—4=0,007 | pA—5=0,048, pB—5=0,001 | ||
При парном сравнении исследуемых групп было отмечено, что у пациенток с низким риском злокачественной трансформации ДЗМЖ (группа A) характерна повышенная экспрессия E-кадгерина по сравнению с пациентками с люминальными A и B-подтипами ИКНТ (см. рис. 1, а). Также у них отмечена сниженная экспрессия интегрина 1β по сравнению с пациентками с люминальным B+ подтипом и более высокая экспрессия коллагена II по сравнению с тройным негативным подтипом, а также низкая экспрессия циклина D1 относительно всех групп пациенток с ИКНТ, но при этом у пациенток с фиброаденомой экспрессия циклина D1 выше по сравнению с пациентками группы B. К особенностям у пациенток группы B можно отнести более высокую экспрессию E-кадгерина относительно лиц с люминальным B-отрицательным подтипом, сниженную экспрессию интегрина 1β по сравнению с пациентками с люминальным A и B+ подтипами (см. рис. 1, б), а также более низкую экспрессию циклина D1 относительно остальных пациенток. Отличительной чертой у пациенток с люминальным A подтипом является более высокая экспрессия коллагена II по сравнению с лицами с тройным негативным подтипом и сниженная экспрессия циклина D1 относительно HER2+ подтипа. Особенность у пациенток с люминальным B- подтипом — более низкая экспрессия интегрина 1β относительно люминального B+ подтипа. Для люминального B+ подтипа характерна более высокая экспрессия интегрина 1β относительно пациенток с люминальным B– и В+ подтипами, а также более высокая экспрессия коллагена II по сравнению с тройным негативным подтипом. К особенностям пациенток с HER2+ подтипом можно отнести сниженную экспрессию интегрина 1β по сравнению с лицами с люминальным B+ подтипом и более высокую экспрессию циклина D1 по сравнению с люминальным A подтипом. Отличительной чертой пациенток с тройным негативным подтипом является более низкая экспрессия коллагена II по сравнению с люминальным A и B+ подтипами. При индивидуализированном подходе были обнаружены пациентки, у которых экспрессия маркеров ЭМП отличалась от аналогичных показателей пациенток той же группы. Например, у 50-летней пациентки с пролиферативной формой фиброзно-кистозной болезни с перидуктальным воспалением был довольно высокий показатель экспрессии циклина D1 (23,7 у.е.). Такое значение больше соответствовало уровню этого маркера у пациенток с HER2+ и тройным негативным подтипами, кроме того, у этой пациентки была повышенная экспрессия интегрина 1β (0,30 у.е.), соответствующая уровню этого маркера у пациенток с люминальным B+ подтипом (рис. 2). Высокие уровни указанных маркеров могут быть обусловлены как воспалительными изменениями, так и начальными этапами малигнизации. Схожая картина наблюдалась у 62-летней пациентки с фиброаденоматозом и участками склерозирующего аденоза. У этой пациентки был высокий показатель экспрессии циклина D1 (0,30 у.е.) и интегрина 1β (0,20 у.е.). Среди пациенток с фиброаденомой одна имела аномально высокую экспрессию интегрина 1β и циклина D1 (0,22 и 2,62 у.е. соответственно) и низкую экспрессию E-кадгерина (0,53 у.е.). Такие значения больше соответствовали уровню маркеров у пациенток с ИКНТ.
Рис. 2. Экспрессия интегрина 1β и циклина D1 в образцах опухоли пациентки с пролиферативной формой фиброзно-кистозной болезни.
а — умеренная экспрессия интегрина 1β; б — умеренная экспрессия циклина D1. Иммуногистохимическая реакция, ×400.
Заключение
Проведенное исследование позволило выявить определенные взаимосвязи экспрессии маркеров ЭМП с молекулярными подтипами опухолей молочной железы. Некоторая гетерогенность экспрессии маркеров ЭМП внутри одного молекулярного подтипа может быть обусловлена множеством факторов, в том числе возрастными особенностями, а также состоянием иммунной системы у каждой отдельной пациентки. Выявленные особенности экспрессии маркеров ЭМП отражают динамические изменения, происходящие в опухолевой ткани, и позволяют судить о тяжести опухолевой прогрессии. Из всех изученных маркеров ЭМП циклин D1, по-видимому, играет более существенную роль в прогрессировании доброкачественных опухолей по сравнению с остальными маркерами. Приведенные выше данные указывают на то, что некоторые пациентки с доброкачественными заболеваниями молочной железы могут составлять группу риска по развитию малигнизации и нуждаются в дальнейшем более тщательном контроле, поскольку высокие уровни экспрессии E-кадгерина, интегрина 1β и циклина D1 свидетельствуют об активно протекающем процессе ЭМП и, следовательно, о более агрессивном типе опухоли.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — А.А. Студеникина, А.И. Аутеншлюс
Сбор и обработка материала — С.А. Архипов, И.П. Жураковский, А.В. Проскура
Статистическая обработка — А.А. Студеникина
Написание текста — А.А. Студеникина
Редактирование — А.И. Аутеншлюс
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.