Введение
Тромбоз — частичная или полная обтурация венозных или артериальных кровеносных сосудов, ограничивающая естественный ток крови, остается одной из основных причин смертности во всем мире [1]. Тромбоз развивается как осложнение разных заболеваний инфекционной и неинфекционной природы, в ряду которых: хроническая обструктивная болезнь легких [2], астма [3], серповидноклеточная анемия [4], вирусная пневмония [5]. Это состояние может обусловливать неблагоприятное течение послеоперационного периода. Ламинарное течение крови по сосудам зависит от сложного гомеостаза, который осуществляется между клетками крови, белками плазмы, факторами свертывания, факторами воспаления, а также эндотелиальной выстилкой артерий и вен. При развитии дисбаланса этого физиологического процесса возникает повышенный риск развития тромбоза [6]. С целью терапии состояний с нарушением гемостаза используют разные варианты фармакотерапии, включая применение антитромбоцитарных препаратов и антикоагулянтов [7]. Однако имеющиеся препараты не всегда эффективны, при их использовании отмечен ряд побочных эффектов, среди которых основным является вероятность развития кровотечения [7]. В связи с этим актуальными остаются исследования, направленные на разработку новых лекарств с антитромботическим действием. Морские натуральные продукты вследствие их химического разнообразия считаются ценным материалом для создания новых препаратов [8, 9]. Производные голубых мидий (Mytilus edulis) обладают широким спектром биологических активностей, среди которых выделяют способность регулировать свертываемость крови [10—12]. В частности, в исследованиях с использованием ферментативного гидролизата M. edulis в его составе были обнаружены пептиды, обладающие способностью ингибировать ключевую протеазу каскада коагуляции — тромбин [10—13]. Пептиды, образующиеся в результате ферментативного гидролиза белков, имеют достаточно большой размер и могут быть потенциально иммуногенными, что значительно ограничивает возможность их применения в качестве лекарственных препаратов. При этом собранная научная база для применения таких препаратов в качестве лекарственных средств все еще недостаточно убедительна из-за отсутствия исследований in vivo.
В ранее проведенном исследовании была представлена характеристика [14] препарата кислотного гидролизата M. edulis, который в отличие от препарата ферментативного гидролизата M. edulis состоит из коротких пептидов, что делает его более подходящим для разработки лекарственных средств.
Цель исследования — изучение возможных антикоагулянтых эффектов препарата кислотного гидролизата M. edulis.
Материал и методы
Получение препарата альфа-тромбина человека (FIIa)
Препарат получали путем активации протромбина на экарине, иммобилизованном на сефарозе. Очистку FIIa после активации проводили с помощью аффинной хроматографии на бензамидин-агарозе [15]. Гомогенность FIIa подтверждали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Для анализа активности FIIa использовали фибриноген человека и хромогенные субстраты — Tos-Gly-Pro-Arg-pNA и Ala-Ala-Arg-pNA. Для оценки удельной активности определяли активность в NIH — единица тромбина, соответствующая количеству FIIa, которое свертывает 1 мл 0,1% раствора фибриногена при температуре +29°C за 15 с в 0,1 М NaCl, 0,05 М Tris-HCl буфере, pH 7,36, содержащем 0,66% полиэтиленгликоль 6000. Полученный FIIa характеризовался удельной активностью 2480 NIH/мг.
Анализ антитромбиновой активности препарата гидролизата M. edulis
Для анализа антитромбиновой активности сравнивали скорость изменения поглощения при 405 нм (DA405) фибриногена, обусловленного добавлением FIIa [16], в присутствии разных количеств гидролизата M. edulis. Смешивали 150 мкл 0,1% фибриногена, 40 мкл раствора тестируемого ингибитора и 10 мкл FIIa (28—112 NIH/мл), регистрируя A405 в течение 10 мин в пробе с FIIa (в качестве контроля использовали фибриноген с буфером вместо FIIa) и в пробе с FIIa и ингибитором (в качестве контроля использовали фибриноген с ингибитором и буфером вместо FIIa). Для приготовления растворов использовали 0,1 М NaCl, 0,05 М Tris-HCl буфер, pH 7,36, содержащий 0,66% полиэтиленгликоль 6000.
Относительное ингибирование тромбина рассчитывали по формуле:
I=[delta A405(FIIa) – delta A405(FIIa+I)]/delta A405 (FIIa+I),
где delta A405(FIIa) — изменение поглощения в пробе с тромбином, delta A405(FIIa+I) — изменение поглощения в пробе с тромбином и ингибитором.
За антитромбиновую единицу (AT-U) принимали количество препарата гидролизата M. edulis, которое на 100% подавляет изменение (delta A405), вызванное 1 NIH тромбина:
AT = C(FIIa) ∙ V(FIIa) ∙ I ∙ D(I),
где C(FIIa) — активность тромбина в пробе (NIH/мл), V(FIIa) — проба тромбина (мл), I — относительное ингибирование delta A405, D(I) — разбавление ингибитора в пробе (раз).
Для расчета удельной антитромбиновой активности учитывали объем пробы.
Ингибирование гидролиза хромогенных субстратов сериновых протеиназ
Ингибирование гидролиза хромогенного субстрата FIIa, Tos-Gly-Pro-Arg-pNA, анализировали по delta A405, предварительно инкубируя препарат гидролизата M. edulis (25%) с 2,5 нМ FIIa в течение 5 мин при +37°C, а затем добавляя 200 мкМ Tos-Gly-Pro-Arg-pNA. Аналогичные измерения были выполнены для FXa — 5 нМ, S2765 — 200 мкМ; FXIa — 10 нМ, S2366 — 200 мкМ; FXIIa — 10 нМ, S2302 — 200 мкМ.
Кинетику ингибирования ферментативной активности тромбина (FIIa) препаратом гидролизата M. edulis оценивали по изменению скорости гидролиза хромогенного субстрата Ala-Ala-Arg-pNA, регистрируя скорость изменения поглощения света при 405 нм (delta A405) в 96-луночном планшете, инкубируемом при +37°C в мультимодальном ридере ClarioStar. Смешивая 20 мкл растворов, содержащих 12 мкг/мл FIIa и 0%, 50% либо 100% гидролизата M. edulis, с 80 мкл растворов 0,156 мМ, 0,313 мМ, 0,625 мМ либо 1,25 мМ Ala-Ala-Arg-pNA, получали комбинации, содержавшие 0,125—1,00 мМ Ala-Ala-Arg-pNA, 2,4 мкг/мл FIIa и 0%, 10% либо 20% гидролизата M. edulis. Все растворы разбавляли 100 мМ NaCl, 10 мМ Hepes-NaOH, 2 мМ CaCl2. Регистрацию A405 проводили каждые 45 с в течение 14 мин. Скорость ферментативной реакции рассчитывали как наклон зависимости A405 от времени в интервале 2—6 мин. С учетом коэффициента молярной экстинкции delta A405 pNA — 9500 M−1∙см−1 и молярной концентрации FIIa — 70,5 нМ переводили скорость реакции в оборотах активного центра FIIa за секунду, т.е. сколько молекул субстрата молекула тромбина гидролизует за секунду. Для определения константы Михаэлиса (KM) и максимальной скорости реакции (Vmax) использовали линеаризацию по Лайнуиверу—Берку. Для расчета константы ингибирования применяли формулу [17]:
Ki=[I]/((KM – K’M)/K’M)2+ ((Vmax – V’max)/V’max)2)0,5,
где параметры со штрихом относятся к смеси фермента и ингибитора, [I] — концентрация ингибитора.
Получение эндотелиальных клеток вены пупочного канатика (Human umbilical vein endothelial cells — HUVEC)
Эндотелиальные клетки выделяли из вены пупочного канатика человека по адаптированной стандартной методике [18]. Пуповины получали из перинатального центра Национального медицинского исследовательского центра им. В.А. Алмазова. Комитет по этике НМИЦ им. В.А. Алмазова утвердил протокол исследования «Изучение клеточных и молекулярных основ патологий аорты с использованием тканей, полученных из остатков после хирургических вмешательств» (этическое разрешение от 26.12.14). Все пациентки подписывали информированное согласие. Все работы с клетками человека соответствовали Хельсинкской декларации. Клетки культивировали в среде Endothelial Cell Basal Medium-2 (ECBM-2) (Promocell, Германия) с добавлением ростовой добавки Supplement Mix (Promocell, Германия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Sigma, США), 2 мМ L-глутамина («БиолоТ», Россия) и 50 мкг/мл гентамицина («БиолоТ», Россия). Пересев культуры производили дважды в неделю. Дезинтеграцию монослоя осуществляли с использованием раствора трипсин-ЭДТА (Sigma, США). Для проведения экспериментов использовали клетки 3—5-го пассажа.
Анализ структуры актинового цитоскелета
Для анализа структуры актинового цитоскелета суспензию эндотелиальных клеток в концентрации 50 тыс. в 300 мкл полной культуральной среды вносили в 24-луночные плоскодонные планшеты (Sarstedt), на дно которых были предварительно помещены стерильные обезжиренные покровные стекла. Клетки культивировали до образования конфлюэнтного монослоя. Исследуемые вещества (30% гидролизат M. edulis (v/v) и тромбин в концентрациях 0,25 и 2 NIH/мл) предварительно смешивали, вносили в лунки планшета и культивировали 10 мин при температуре 37°C во влажной атмосфере с 5% СО2. По окончании инкубации покровные стекла фиксировали в 4% растворе формальдегида (Sigma Aldrich, США) при 25°C. Пермеабилизацию клеток производили 0,01% раствором тритона Х-100 (Sigma, США) при 25°C. Далее вносили раствор фаллоидина, меченного Alexa Fluor 488 на 3,3% метаноле (Invitrogen, США), инкубировали при температуре 37°C, промывали PBS, высушивали и наносили среду для заключения, содержащую краситель для ядер DAPI (Invitrogen, США). Препараты анализировали с помощью микроскопа AxioObserver D1 (Zeiss, Германия) и программы AxioVisionRel 4.7 (Zeiss, Германия). Для количественной оценки содержания клеточного F-актина измеряли относительную интенсивность флуоресценции (RFI) актинового цитоскелета с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH, США).
Исследование влияния гидролизата M. edulis на формирование тромба в модели тромбоза задней полой вены у крыс
Исследование проводили на крысах линии Вистар (самцах, масса тела около 300 г). Животные были получены из питомника «Рапполово», содержались в условиях неограниченного доступа к воде и пище, в соответствии с принятыми этическими нормами. Эксперименты на животных были одобрены этическим комитетом Северо-Западного государственного медицинского университета, Санкт-Петербург, Россия (протокол №7 от 7 октября 2020 г.). Животные были поделены на три группы: 1-я группа — интактные животные, которые не подвергались оперативным вмешательствам и введению препаратов; 2-я группа — животные с индуцированным тромбозом, которым осуществляли инъекции физиологического раствора (контрольная группа); 3-я группа — животные с индуцированным тромбозом, которым проводили инъекции гидролизата M. edulis (опытная группа). Тромбоз индуцировали путем полного перевязывания задней полой вены (ЗПВ, аналог нижней полой вены у человека) и всех видимых ветвей, как описано в работе [19]. Введение в наркоз выполняли в индукционной камере с использованием смеси изофлуран (3—4%) / кислород. Далее на протяжении операции применяли ингаляционную анестезию посредством смеси изофлуран (1,5—1,8%) / кислород. Тромбоз ЗПВ индуцировали ее лигированием сразу ниже левой почечной вены полипропиленовой нитью 6/0 до полного устранения просвета. Перевязывали все боковые и задние ветви ЗПВ полипропиленовой нитью 7/0 от места наложения лигатуры до слияния подвздошных вен. Животным контрольной группы в течение всего послеоперационного периода 4 раза в день делали инъекции физиологического раствора по 300 мкл подкожно в холку. Животным экспериментальной группы проводили инъекции препарата гидролизата M. edulis по 300 мкл подкожно по аналогичной схеме. Через 48 ч каждую крысу подвергали ингаляционному наркозу смесью высокой концентрации изофлурана 5% и кислорода. Аорту и ЗПВ перевязывали из забрюшинного пространства и иссекали единым блоком. Полученные препараты крыс погружали в формалин («БиоВитрум», Россия), после чего изготавливали парафиновые блоки.
Анализ размеров и структуры тромбов
Для оценки структуры тромбов в ЗПВ использовали срезы из проксимальной трети тромба ниже лигатуры. Окраску гистологических препаратов осуществляли с помощью гематоксилина и эозина, применяли тройную окраску для выявления возраста фибрина, основанную на методе Martius Scarlet Blue (MSB) по Лендруму («БиоВитрум», артикул 07-014, «Эрго Продакшн»). Срезы фотографировали с помощью микроскопа Leica HC (Германия) с камерой Leica DMC 2900 (Германия). Оценку диаметра, а также занимаемой организованным фибрином площади в тромбе проводили при одинаковом увеличении (×25) для всех препаратов с помощью программы ImageJ (NIH, США). Долю организованного фибрина в ткани тромба (фиброз), окрашенного в голубой цвет, оценивали по соотношению площади волокон голубого цвета и площади тромба.
Статистическая обработка данных
Для установления нормальности распределения к полученным данным применяли тесты Колмогорова—Смирнова, Шапиро—Уилка и/или Андерсона—Дарлинга. Далее проводили анализ однородности дисперсии с помощью теста Брауна—Форсайта и/или тест Ливиня и тест для отношения дисперсий. После подтверждения нормальности распределения выборок производили однофакторный дисперсионный анализ, парные множественные сравнения осуществляли с помощью апостериорного критерия Тьюки. По результатам проведенных тестов и с учетом малых групп предпочтительным был тест Манна—Уитни. Нулевую гипотезу об отсутствии значимых различий отвергали при p<0,05. Для выявления наличия взаимосвязи между введением препарата гидролизата M.medulis и вероятностью формирования тромба использовали точный критерий Фишера.
Результаты
Анализ антитромбиновой активности препарата гидролизата M. edulis in vitro
При добавлении препарата гидролизата M. edulis к смеси фибриногена с FIIa наблюдали дозозависимое снижение скорости изменения поглощения при 405 нм, свидетельствующее об ингибировании свертывания фибриногена под действием тромбина. При определенных условиях ингибирование достигает 98,5%. В табл. 1 суммированы данные, свидетельствующие об ингибирующем эффекте разных разбавлений гидролизата M. edulis, и приведена оценка антитромбиновой активности препарата, согласно которой неразбавленный препарат гидролизата M. edulis содержит около 6,5 AT-U/мл.
Таблица 1. Влияние гидролизата M. edulis на скорость изменения поглощения при 405 нм, индуцированное добавлением FIIa к фибриногену, и оценка его антитромбиновой активности
| № опыта | Активность FIIa, NIH | Разбавление гидролизата M. edulis в пробе | Относительное ингибирование delta A405, % | Антитромбиновая активность, AT-U | Удельная антитромбиновая активность, AT-U/мл |
| 1 | 0,28 | 10 | 98,5 | 1,379 | 6,895 |
| 2 | 0,56 | 10 | 22,4 | 1,257 | 6,29 |
| 3 | 1,12 | 5 | 24,8 | 1,388 | 6,94 |
| 4 | 1,12 | 2,5 | 41,5 | 1,164 | 5,82 |
| M±SD | 1,297±0,112 | 6,49±0,56 | |||
Для более прецизионной оценки ингибирующего эффекта гидролизата M. edulis были использованы очищенные факторы свертывания крови FIIa, FXa, FXIa, FXIIa и специфические хромогенные субстраты (табл. 2). Гидролизат M. edulis оказывал ингибирующее действие в отношении всех исследуемых факторов коагуляции. Наиболее выраженное ингибирование наблюдали в отношении FXIIa, однако следует заметить, что при активации каскада свертывания крови концентрация FIIa значительно превышает концентрацию FXIIa. Например, пиковая концентрация тромбина в тесте генерации тромбина в норме составляет около 200—300 нМ [20]. На основании того, что при активации коагуляции концентрация тромбина превосходит концентрации остальных сериновых протеиназ каскада свертывания крови, была изучена подробнее кинетика ингибирования препаратом гидролизата M. edulis гидролиза хромогенного субстрата, катализируемого FIIa.
Таблица 2. Влияние гидролизата M. edulis (25%) на скорость изменения поглощения при 405 нм при гидролизе специфических хромогенных субстратов факторов свертывания крови (n=3)
| Фактор свертывания крови | Хромогенный субстрат | Отношение скорости гидролиза субстрата в присутствии гидролизата M. edulis к скорости без ингибитора, M±SEM |
| FIIa (5 нМ) | Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (200 мкМ) | 0,83±0,11 |
| FXa (5 нМ) | S2765 (200 мкМ) | 0,83±0,1 |
| FXIa (10 нМ) | S2366 (200 мкМ) | 0,76±0,05 |
| FXIIa (10 нМ) | S2302 (200 мкМ) | 0,48±0,05 |
Исследование влияния гидролизата M. edulis на кинетику гидролиза хромогенного субстрата тромбина Ala-Ala-Arg-pNA показало, что препарат дозозависимо снижал константу Михаэлиса (KM) и максимальную скорость реакции (Vmax), действуя как бесконкурентный ингибитор (рис. 1, табл. 3).
Рис. 1. График в координатах Лайнуивера—Берка, характеризующий ингибирование 10% и 20% препаратом гидролизата M. edulis активности FIIa (70,5 нМ) в отношении Ala-Ala-Arg-pNA (S, 0,125—1,00 мМ).
Слева представлены уравнения аппроксимирующих прямых, использованные для расчета KM и Vmax.
Таблица 3. Кинетические параметры ингибирования препаратом гидролизата M. edulis гидролиза z-Ala-Ala-Arg-pNA, катализируемого FIIa
| Исследуемый фактор | Кинетические параметры | ||
| KM, мкМ | Vmax, 1/c | Ki, нМ | |
| FIIa | 800 | 3,76 | – |
| FIIa, 10% гидролизата M. edulis | 155 | 1,42 | 15,8 |
| FIIa, 20% гидролизата M. edulis | 88 | 0,95 | 8,2 |
Для приблизительной оценки Ki предположили, что концентрация ингибитора в разбавленном препарате гидролизата M. edulis не ниже концентрации FIIa, таким образом, вместо концентрации ингибитора [I] в формулу для расчета Ki подставили концентрацию тромбина. Учитывая, что с ростом доли гидролизата M. edulis с 10% до 20% значение Ki уменьшается с 15,8 нМ до 8,2 нМ, можно судить о том, что концентрация ингибирующего компонента в неразбавленном препарате действительно близка к концентрации FIIa. Если учесть разбавление препарата (15,8∙10=158 нМ и 8,3∙20=166 нМ), то получаются весьма близкие концентрации — примерно в 2 раза выше использованной концентрации тромбина.
Следует заметить, что концентрация FIIa в представленном опыте составила 70,5 нМ, т.е. 7 NIH/мл, что весьма близко к антитромбиновой активности препарата гидролизата M. edulis, определенной по торможению свертывания фибриногена — 6,5 AT-U/мл. Принимая во внимание, что бесконкурентный механизм ингибирования предполагает образование комплекса, включающего фермент, субстрат и ингибитор, нельзя исключить, что компоненты гидролизата M. edulis образуют комплекс с тромбином и одним из его физиологических субстратов, однако проверка этой гипотезы требует дальнейших исследований.
Влияние препарата гидролизата M. edulis на свойства монослоя HUVEC при культивировании в присутствии тромбина
Известно, что тромбин повышает проницаемость монослоя эндотелиальных клеток [21]. Для оценки биологических эффектов гидролизата M. edulis изучали влияние препарата на свойства монослоя HUVEC при культивировании в присутствии тромбина.
Конфлюэнтность монослоя эндотелиальных клеток оценивали морфологически, путем выявления структуры актинового цитоскелета с помощью фаллоидина, меченного флуоресцентным красителем. При культивировании клеток в стандартных условиях (контроль) клетки формировали выраженные межклеточные контакты (тонкая стрелка на рис. 2), пучки актиновых филаментов (толстая стрелка на рис. 2) располагались вдоль длинной оси клеток.
Рис. 2. Влияние препарата гидролизата M. edulis на конфлюэнтость монослоя эндотелиальных клеток и структуру актинового цитоскелета.
Репрезентативные световые микроскопические изображения и гистограммы, отражающие интенсивность флуоресценции актинового цитоскелета HUVEC. Тонкими стрелками обозначены межклеточные контакты; толстыми стрелками — пучки актиновых филаментов; наконечники стрел — кортикальные актиновые волокна; стрелка с круглым хвостом — округлые клетки; n=3 в каждой группе. Отличия достоверны: *** — p<0,001; ** — p<0,01.
Кортикальные актиновые волокна (наконечник стрелки на рис. 2) вблизи межклеточных соединений были хорошо выражены. Морфология и структура актинового цитоскелета эндотелиальных клеток при культивировании в присутствии препарата гидролизата M. edulis значительно не отличалась от контроля. Внесение тромбина к клеткам в течение 10 мин вызывало морфологические изменения разной степени выраженности в зависимости от концентрации, характеризующиеся истончением стрессовых волокон и разборкой фокальных адгезионных комплексов. В некоторых случаях наблюдали ретракцию, округление клеток (стрелка с круглым хвостом на рис. 2), нарушение межклеточных контактов, образование промежутков в монослое и реорганизацию актинового цитоскелета. На периферии округлых клеток накапливалось выраженное кольцо F-актина. Внесение препарата гидролизата M. edulis одновременно с тромбином предотвращало ретракцию клеток и разрушение межклеточных контактов. Количественный анализ показал, что в присутствии тромбина наблюдалось значительное снижение содержания F-актина по сравнению с контролем, а гидролизат M. edulis восстанавливал этот параметр до контрольного уровня (см. рис. 2).
Влияние гидролизата M. edulis на формирование тромба в модели лигирования задней полой вены у крыс
В ходе проведения эксперимента ни в одной из групп не наступало смерти животных во время или после операции до момента выведения из эксперимента. Все крысы сохраняли активность, принимали пищу и пили воду, у животных не отмечалось цианоза кожи и слизистых оболочек, ишемических изменений стенки кишечника и каких-либо других внешних признаков болезни. В области хирургического вмешательства тромботического поражения не было выявлено ни в одной из доступных осмотру венозных ветвей почечных вен или системы ЗПВ. Тромб сформировался в ЗПВ у всех крыс контрольной группы, которые получали физиологический раствор. Распространенность тромба во всех случаях была от уровня наложенной лигатуры до слияния подвздошных вен. В отличие от них у 4 из 14 крыс опытной группы ЗПВ на момент выведения животных из эксперимента оставалась полностью свободной от тромботических масс. У остальных 10 крыс протяженность тромба варьировала от равной таковой у крыс контрольной группы до протяженности в 3 мм. Статистический анализ с использованием точного критерия Фишера показал наличие прямой взаимосвязи между введением препарата гидролизата M. edulis и снижением вероятности формирования тромба при p<0,05 (рис. 3, д).
Рис. 3. Репрезентативные микрофотографии, отражающие микроскопические изменения задней полой вены крыс и количественные характеристики тромба.
а — группа интактных животных (n=5); б — контрольная группа: индуцированный тромбоз нижней полой вены с инъекциями физиологического раствора (n=15); в, г — экспериментальная группа: индуцированный тромбоз задней полой вены с инъекциями гидролизата M. edulis (n=14); д — количественные показатели тромба. Отличия достоверны: ** — p<0,01; * — p <0,05. Окраска методом Martius Scarlet Blue (MSB). Красный — свежий фибрин; синий — организованный фибрин / соединительная ткань. Шкала 500 мкм. Условные обозначения: СВ — стенка вены; ПВ — просвет вены; СА — стенка артерии; ПА — просвет артерии; Эр — эритроциты; Фиб — фибрин.
Гистологические исследования подтвердили, что у интактных животных тромбов в ЗПВ не обнаруживалось. У всех крыс контрольной группы в ЗПВ развивались тромбы. Различия показателей диаметра и площади тромба у животных контрольной и экспериментальной групп не были значимы. В то же время фиброз тромба у животных экспериментальной группы составил 48,75% [34,57; 66,90%] и был значимо (p<0,01) более выраженным по сравнению с этим параметром у животных контрольной группы (13,25% [10,01; 26,30%]) (см. рис. 3, д).
Обсуждение
В настоящем исследовании в модели лигирования ЗПВ у крыс было установлено, что введение препарата гидролизата M. edulis снижало вероятность развития тромба. Даже в том случае, если у животных экспериментальной группы развивался тромб, степень его фиброза была достоверно выше по сравнению с этим показателем у животных контрольной группы. Это показывает, что через 48 ч после лигирования ЗПВ у животных, которые получали инъекции гидролизата M. edulis, была отличающаяся структура тромба от таковой в контрольной группе. Для определения степени фиброза тромба применяли метод окраски MSB, который относится к категории трихромных окрашиваний, когда молодые тромбы (до 24 ч) окрашиваются в красный цвет, а старые тромбы — в цвета от фиолетового до желтого. Метахромазию фибрина связывают с его структурными свойствами, точнее с его плотностью [22]. Наиболее вероятным механизмом, лежащим в основе зависящего от времени дифференциального окрашивания, считают ковалентное сшивание фибрина, индуцируемое фактором XIIIa, хотя не исключают и другие, неизвестные, механизмы. Эта реакция приводит к образованию крупных полимеров, которые могут придавать волокнам фибрина определенные химические свойства, выявляемые с помощью дифференциального окрашивания [22].
Одним из возможных механизмов влияния препарата гидролизата M. edulis на структуру тромба может быть ингибирование катализируемой тромбином активации FXIII. Тот факт, что препарат значительно ингибирует активность тромбина, может являться причиной недостаточной активации FXIII. С учетом бесконкурентного механизма ингибирования активности FIIa препаратом гидролизата M. edulis требуется проверить, образуют ли компоненты препарата комплексы с FIIa и FXIII, препятствующие активации последнего.
При нормальной функциональности и количестве тромбоцитов сокращение сгустка напрямую зависит от активности тромбина. Тромбин также опосредованно влияет на уплотнение сгустка за счет активации фактора XIII [23]. Кроме того, фибриновая сшивка задерживает в тромбе эритроциты, что делает сгустки менее пористыми и повышает их литическую резистентность [24]. Таким образом, можно предположить, что препарат гидролизата M. edulis за счет ингибирования тромбина способен снижать вероятность развития тромба, его плотность и, как следствие, облегчать фибринолиз. Наконец, и образование фибрина зависит от ингибирования тромбина, в связи с этим изменение структуры тромба у крыс может быть обусловлено непосредственным ингибированием FIIa-катализируемого расщепления фибриногена.
Тромбин помимо прокоагуляторного действия также запускает широкий спектр изменений эндотелия сосудов [25], которые проявляются разрушением межклеточных контактов, проангиогенным, провоспалительным и прокоагулянтным фенотипом эндотелия [26]. Дальнейшие эксперименты должны были подтвердить способность препарата гидролизата M. edulis ингибировать действие тромбина в отношении эндотелиальных клеток. Было установлено, что препарат гидролизата M. edulis предотвращал индуцированные тромбином перестройки актинового цитоскелета и дезинтеграцию монослоя эндотелия. Эти данные подтверждают доказанную в предыдущих исследованиях способность препарата усиливать барьерную функцию эндотелия, детектированную in vitro с помощью ECIS и in vivo в модели Майлса (Miles assay) [14]. С учетом того, что нарушение целостности эндотелиальной выстилки провоцирует тромбоз [27], действие препарата гидролизата M. edulis может способствовать снижению тромбогенности сосудистой стенки.
Заключение
Проведенные исследования демонстрируют, что препарат гидролизата M. edulis обладает антикоагулянтными эффектами, которые связаны с его способностью ингибировать ферментативную активность тромбина и поддерживать барьерную функцию эндотелия. Дальнейшее изучение механизмов, лежащих в основе действия гидролизата M. edulis, может послужить основой для создания новых эффективных препаратов для терапии заболеваний, связанных с гиперактивацией системы коагуляции.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда №22-25-20020 (https://rscf.ru/project/22-25-20020) и региона (гранта Санкт-Петербургского научного фонда в соответствии с соглашением от 14 апреля 2022 г. №46/2022).
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Э.А. Старикова, А.В. Соколов, О.Я. Порембская, Н.В. Соловьев
Сбор материала, анализ и интерпретация данных — Э.А. Старикова, Дж.Т. Маммедова, А.В. Соколов, Н.А. Подоплелова, А.Б. Малашичева, В.А. Цинзерлинг, О.Я. Порембская, Н.В. Соловьев
Статистическая обработка данных — Дж.Т. Маммедова, А.В. Соколов, Н.А. Подоплелова, Н.В. Соловьев
Написание и редактирование рукописи — Э.А. Старикова, Дж.Т. Маммедова, А.В. Соколов, О.Я. Порембская, Н.В. Соловьев
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.