Бионы представляют собой семейство минералоорганических наночастиц, синтезирующихся в условиях перенасыщения биологических жидкостей (сыворотки крови, мочи, слюны, желчи, амниотической жидкости и др.) различными ионами в результате химического взаимодействия: 1) катионов или содержащих катионы солей; 2) фосфат-аниона или содержащих его солей; 3) определенных белков (альбумин, фетуин-А, остеонектин и др.) [1]. В зависимости от формирующего катиона бионы подразделяют на кальций-фосфатные, магний-фосфатные, марганцево-фосфатные, стронций-фосфатные, барий-фосфатные и др. [1], из которых в организме человека достоверно образуются лишь кальций-фосфатные бионы (КФБ) [2—4]. Предположено [1] и экспериментально доказано [5], что КФБ представляют собой один из механизмов поддержания минерального гомеостаза, препятствуя прямой кальцификации тканей при перенасыщении сывороточной среды ионами кальция и фосфора. В то же время было выявлено, что КФБ оказывают токсическое действие как на культуры иммортализованных венозных и лимфатических эндотелиальных клеток (ЭК), запуская их апоптоз и стимулируя выделение ими провоспалительных цитокинов интерлейкина (ИЛ)-6 и ИЛ-8, так и на интиму брюшной аорты крыс, вызывая ее концентрическую или эксцентрическую гипертрофию [5]. В связи с этим выдвинута гипотеза, согласно которой, защищая организм от «большего зла» — массивной эктопической кальцификации, КФБ тем не менее повреждают здоровый эндотелий, потенциально являясь таким образом одним из триггеров развития атеросклероза [5—8].
В то же время неясно, обусловлена ли эндотелиотоксичность КФБ их специфическим химическим составом или их корпускулярной природой, общей для всех типов бионов. Данный вопрос имеет значение как для патофизиологии атеросклероза, так и для нанотоксикологии в связи с активно разрабатываемыми наноразмерными средствами направленной доставки лекарственных препаратов [9], которые обычно вводятся в кровь пациента. При этом известно, что искусственно синтезируемые в эксперименте магний-фосфатные бионы (МФБ) обладают схожими с КФБ формой и диаметром, но при этом МФБ не способны образовываться в организме человека вследствие несовместимости с жизнью необходимой для их синтеза чрезвычайно высокой концентрации магния [1]. Таким образом, можно предположить, что МФБ идеально подходят для оценки специфичности токсического действия КФБ в эксперименте.
Одним из пусковых механизмов развития атеросклероза является ауто- и паракринная секреция провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12 и др.) ЭК [10—14], которые непосредственно экспонируются формирующимся в крови КФБ; при этом ранее нашей группой продемонстрирована повышенная секреция эндотелиоцитами ИЛ-6 и ИЛ-8 в результате экспозиции КФБ [5].
Цель данного исследования — сравнить профиль секретируемых ЭК провоспалительных цитокинов под воздействием равных концентраций КФБ и МФБ.
Материал и методы
Искусственный синтез МФБ и КФБ. КФБ синтезированы путем последовательного добавления 9,9 мкл 0,5 М CaCl2 (Sigma-Aldrich) и 21,5 мкл 0,2 М Na2HPO4 (Sigma-Aldrich) в 1319 мкл среды Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Gibco), содержащей 150 мкл (10% от общего объема) фетальной телячьей сыворотки (Gibco). МФБ синтезированы при помощи последовательного добавления 100 мкл 0,2 М MgCl2 (Sigma-Aldrich) и 100 мкл 0,2 М Na2HPO4 в 700 мкл среды DMEM, содержащей 100 мкл (10% от общего объема) фетальной телячьей сыворотки. После кратковременного перемешивания на вортексе пробирки емкостью 1,5 мл (Eppendorf) с реагентами для синтеза бионов инкубировали при температуре 37 °C (MCO-18AIC, Sanyo) в течение 24 ч с дальнейшим центрифугированием при 200 000 · g и температуре 4 °C в течение 1 ч (Optima MAX-XP, Beckman Coulter). С целью получения рабочего раствора для добавления к клеткам осадок КФБ растворяли в 300 мкл, а осадок МФБ — в 500 мкл однократного фосфатно-солевого буфера (ФСБ, 1X phosphate buffered saline, Gibco), что позволяло достичь оптической плотности (ОП) 0,5 стандарта МакФарланда (МкФ), являющейся минимально измеримой и патофизиологически релевантной величиной концентрации бионов в растворе. Все указанные процедуры проводили в стерильных условиях. ОП измеряли на микропланшетном спектрофотометре «Униплан» (АИФР-01, Пикон) на длине волны 650 нм.
Экспозиция эндотелиальных клеток МФБ и КФБ. Для экспериментов использована культура иммортализованных венозных ЭК человека линии EA. hy 926, предоставленная Dr. Cora-Jean S. Edgell (University of North Carolina at Chapel Hill, США). Данная клеточная линия является гибридомой, которая получена путем слияния ЭК пупочной вены человека (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) с клетками аденокарциномы легкого человека линии A549 и сохраняет основные морфологические и функциональные особенности венозных ЭК человека [15]. Клетки культивировали в среде DMEM/F12 (Gibco) с 10% фетальной телячьей сывороткой (Gibco), 2% раствором гипоксантина-аминоптерина-тимидина (Gibco), 1% раствором HEPES-буфера (Gibco), 1% раствором L-глутамина-пенициллина-стрептомицина (Gibco) и 0,4% раствором амфотерицина B (Gibco). Все эксперименты с клетками проводили в стерильных условиях при температуре 37 °C, 5% CO2 и высокой влажности (MCO-18AIC, Sanyo).
Вследствие того, что устойчивость и ответ ЭК на внешние воздействия существенно зависят от целостности их монослоя [6—8], секретируемый клетками цитокиновый профиль оценивали на двух клеточных моделях: разреженной (<50% конфлюэнтности клеток в культуральной посуде) и конфлюэнтной (>90% конфлюэнтности клеток в культуральной посуде). В разреженной модели клетки высаживали в 6-луночные планшеты (3·105 клеток на лунку, 1900 мкл среды в лунке) с добавлением к ним через 1 ч 100 мкл КФБ (0,5 МкФ), МФБ (0,5 МкФ) или ФСБ и дальнейшей инкубацией в течение 24 ч. В конфлюэнтной модели клетки точно так же высаживали в 6-луночные планшеты (3·105 клеток на лунку, 1900 мкл среды в лунке) и культивировали в течение 44 ч, после чего к ним добавляли 100 мкл КФБ (0,5 МкФ), МФБ (0,5 МкФ) или ФСБ с дальнейшей инкубацией в течение 4 ч. По завершении инкубации из лунок (по 11 на каждую группу) при помощи автоматического одноканального дозатора (Ленпипет) забирали культуральную жидкость, которую разделяли на аликвоты объемом 400—500 мкл по 4 пробиркам емкостью 1,5 мл и хранили при температуре –40°С (Sanyo) до измерения профиля секретируемых клетками провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-23, α-фактор некроза опухоли — α-ФНО, γ-интерферон — γ-ИФН), растворимая молекула адгезии сосудистых клеток-1 — рМАСК-1) методом иммуноферментного анализа посредством соответствующих наборов компании «Abcam» (ab46052, ab46027, ab46032, ab46034, ab46143, ab64708, ab46087, ab46025, ab46118) в соответствии с инструкциями производителя. Выбор указанных цитокинов был обусловлен их секрецией ЭК и центральной ролью в развитии атеросклероза [10—14]. Каждую аликвоту культуральной жидкости размораживали и использовали для анализа не более одного раза. Измерение результата проводили на микропланшетном спектрофотометре «Униплан» на длине волны 450 нм.
Статистический анализ. Статистическую обработку полученных данных выполняли при помощи программ GraphPad Prism 6 (GraphPad Software), Microsoft Excel 2013 (Microsoft) и Statistica 13 (Dell). Межгрупповое сравнение измеренных уровней каждого из 9 цитокинов проводили посредством однофакторного дисперсионного анализа. В случае выявления статистически значимых различий между группами осуществлялось последующее попарное сравнение групп с использованием критерия Тьюки. Для оценки того, насколько профиль секретируемых цитокинов в целом различен по 3 группам, были построены тепловые карты выделения цитокинов, а также использованы дискриминантный анализ и метод главных компонент. В процессе дискриминантного анализа проведен канонический анализ для построения диаграммы рассеяния (scatterplot), отражающей дискриминирующие расстояния между различными биологическими репликатами (лунками), и, следовательно, между группами. Аналогичная диаграмма рассеяния построена на применении метода главных компонент с расположением по осям основных факторов, обусловливающих различия между репликатами и группами, вместо дискриминирующих расстояний. При использовании всех указанных методов различия между группами признавали статистически значимыми при вероятности отвергнуть верную нулевую гипотезу р≤0,05.
Результаты
При анализе результатов, полученных на разреженной клеточной модели, выявлено, что экспозиция МФБ не вызывала изменения уровня секретируемых ЭК цитокинов, в то время как экспозиция КФБ по сравнению как с контрольной культурой, так и с экспозицией МФБ, индуцировала повышение концентрации секретируемого ИЛ-8 (рис. 1, а).
В то же время эксперименты, выполненные на конфлюэнтной клеточной модели, продемонстрировали, что экспозиция как КФБ, так и МФБ вызывала повышение уровня секретируемого α-ФНО и снижение уровня секретируемых ИЛ-1β, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-23, γ-ИФН и рМАСК-1 по сравнению с контрольными клетками. Однако экспозиция КФБ по сравнению с МФБ и контрольными клетками также индуцировала повышение уровня секретируемого ИЛ-6, а по сравнению с экспозицией МФБ — увеличение уровня секретируемого ИЛ-8 (см. рис. 1, б). Важно отметить, что в отношении всех указанных молекул, кроме ИЛ-23, воздействие КФБ по сравнению с воздействием МФБ приводило к более выраженным эффектам повышения или снижения их концентрации (см. рис. 1, б).
С целью сочетанной визуализации эффектов воздействия МФБ и КФБ составлены тепловые карты выделения цитокинов ЭК на обеих клеточных моделях (рис. 2),
Для проверки этой гипотезы применены методы многомерного статистического анализа: дискриминантный анализ и метод главных компонент. Данные методы действительно показали, что на разреженной клеточной модели профиль цитокинов, выделяемых клетками под воздействием КФБ, значительно отличается от профиля цитокинов, выделяемых клетками под воздействием МФБ, и профиля контрольных клеток (рис. 3, а,
На конфлюэнтной клеточной модели профиль секретируемых клетками цитокинов существенно различался во всех 3 группах, однако под воздействием КФБ он тем не менее в большей степени отличался от профиля контрольных клеток, чем профиль под воздействием МФБ (рис. 4, а,
Обсуждение
Несмотря на ряд опубликованных работ, продемонстрировавших цитотоксическое и, в частности, эндотелиотоксическое действие КФБ [5, 16—18], вопрос о природе их токсического действия остается открытым: неясно, обусловлено оно их химическим составом (гидроксиапатит и карбонат-гидроксиапатит) или физической сущностью (наночастицы сферической формы и кристаллической структуры). В то же время этот вопрос имеет принципиальное значение для патогенетического обоснования новых методов этиотропной терапии, поскольку в случае специфичности эндотелиотоксичности КФБ особую актуальность приобретают препараты хелатирующего действия, напрямую дезинтегрирующие КФБ и нейтрализующие ионы кальция. В качестве группы сравнения для оценки специфичности эндотелиотоксического действия КФБ синтезированы МФБ, имеющие аналогичные форму и диаметр, но не образующиеся в организме человека, поскольку для их синтеза требуется несовместимая с жизнью концентрация магния, превышающая норму в 10—20 раз. Поскольку одним из основных признаков эндотелиотоксичности бионов является индукция выделения провоспалительных цитокинов ЭК, в данной работе проанализирован именно этот патофизиологический аспект.
Проведенные нами эксперименты показали, что МФБ, в отличие от КФБ, не стимулировали выделение ни одного из девяти исследованных провоспалительных цитокинов на разреженной клеточной модели. На конфлюэнтной клеточной модели МФБ повышали лишь уровень секретируемого α-ФНО, что, однако, было характерно и для КФБ. В то же время КФБ, в отличие от МФБ, повышали выделение ИЛ-6 и ИЛ-8 как на разреженной, так и на конфлюэнтной клеточной модели, что согласуется с ранее полученными результатами и подтверждает роль данных цитокинов в проатеросклеротическом действии КФБ [5]. Оба примененных метода многомерного статистического анализа (дискриминантный анализ и метод главных компонент) на обеих клеточных моделях подтвердили, что профиль секреции цитокинов ЭК под воздействием КФБ статистически значимо отличен от такового под воздействием МФБ и особенно от профиля контрольных клеток. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о специфичности эндотелиотоксического действия КФБ и об относительной безвредности МФБ. Это подтверждает пользу гипотезы о том, что эндотелиотоксичность бионов в большей степени обусловлена их химическим составом, уникальным для каждого типа бионов, а не общей для всех типов бионов корпускулярной природой.
Вероятным механизмом токсичности КФБ для ЭК может считаться разрыв лизосом после интернализации, следствием которого является массивный выход ионов кальция в цитоплазму, что запускает внутренний путь апоптоза [19—21] и способно вызывать изменения в профиле генной и белковой экспрессии клеток [17, 22]. В отличие от КФБ, которые состоят из малорастворимых даже в кислой среде лизосом гидроксиапатита (Ca10(PO4)6(OH)2) и карбонатгидроксиапатита (Ca10(PO4)3(CO3)3(OH)2), в состав МФБ входят легкорастворимые магния фосфат-гидрат (Mg2(P2O7)(H2O) и хантит (Mg3Ca (CO3)4), которые не вызывают разрыва лизосом и, следовательно, апоптоза, слабо влияя на внутриклеточный гомеостаз (неопубликованные данные авторов).
Еще одним теоретически возможным механизмом эндотелиотоксичности КФБ может быть их частичная диссоциация в растворе, что потенциально может приводить к его перенасыщению ионами кальция и фосфора и нарушению осмолярности. Однако гидроксиапатит и карбонатгидроксиапатит практически нерастворимы при физиологических условиях, тщательно соблюдаемых при культивировании клеток. Кроме того, в случае подобного явления МФБ были бы как минимум не менее токсичны, чем КФБ, вследствие значительно более высокой растворимости.
Стоит отметить, что результаты, полученные по остальным цитокинам, за исключением ИЛ-6 и ИЛ-8, существенно различались на разреженной и конфлюэнтной клеточных моделях. На разреженной модели выделение ИЛ-1β, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-23, γ-ИФН и рМАСК-1 между тремя группами значимо не различалось (кроме рМАСК-1, секреция которого была с пограничной статистической значимостью выше при экспозиции КФБ по сравнению с экспозицией МФБ), в то время как на конфлюэнтной модели происходило выраженное снижение их секреции от контрольных клеток к экспонированным МФБ и далее к экспонированным КФБ (исключая ИЛ-23, секреция которого практически полностью прекращалась в результате экспозиции как МФБ, так и КФБ). Выделение α-ФНО характеризовалось уменьшением секреции в ряду контрольные клетки—экспонированные МФБ—экспонированные КФБ на разреженной клеточной модели и увеличением секреции в этом же ряду на конфлюэнтной клеточной модели. Кроме того, на конфлюэнтной клеточной модели общий профиль секреции провоспалительных цитокинов ЭК под воздействием МФБ статистически значимо отличался от профиля контрольных клеток, однако на разреженной клеточной модели подобного не выявлено. Такое различие в результатах, полученных на двух моделях, может быть обусловлено различной длительностью экспозиции клеток бионам (24 ч при разреженной и 4 ч при конфлюэнтной клеточной модели). Однако результаты, полученные в отношении ИЛ-6 и ИЛ-8, не зависели от клеточной модели, что позволяет констатировать их относительную убедительность. В случае с иммортализованной по гибридомной технологии линией ЭК бессмысленно экспонировать ее бионам при >90% конфлюэнтности в течение 24 ч, так как 7—8% клеток подвергаются апоптозу даже в контрольной культуре (собственные неопубликованные наблюдения авторов), что не позволяет качественно провести эксперимент. Для преодоления этого недостатка моделирования конфлюэнтного монослоя ЭК in vitro в перспективе предполагается использовать первичные ЭК артерии, которые вследствие медленного роста теоретически могут быть экспонированы бионам в течение долгого времени даже при высокой конфлюэнтности. Однако такие клеточные линии характеризуются сложностью в культивировании после выделения и высокой стоимостью при заказе коммерчески доступных стандартизированных культур, что существенно затрудняет проведение таких экспериментов и обусловливает необходимость предварительных экспериментов на классических и широко распространенных иммортализованных линиях ЭК, таких как использованная в данной работе линия EA. hy 926.
Заключение
Таким образом, можно сделать вывод о том, что эндотелиотоксическое действие кальций-фосфатных бионов обусловлено их химическим составом в большей степени, чем корпускулярной природой, и в значительной степени заключается в индукции ими секреции провоспалительных цитокинов интерлейкинов-6 и -8 эндотелиальными клетками. Для подтверждения данной гипотезы требуется проведение аналогичных экспериментов на первичных культурах артериальных эндотелиальных клеток.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) в рамках научного проекта № 17−04−00570 «Оценка специфичности токсического действия кальций-фосфатных бионов на эндотелий».
Сведения об авторах
Шишкова Дарья Кирилловна — м.н.с. лаб. новых биоматериалов отдела экспериментальной и клинической кардиологии
Великанова Елена Анатольевна — к.б.н., н.с. лаборатории клеточных технологий отдела экспериментальной и клинической кардиологии