Метронидазол (МТ) является широко используемым противомикробным и противопаразитарным препаратом [3—6]. При этом в клинической практике область его применения зачастую связана не только с действием на микроорганизмы, но и с его электронно-акцепторным свойством [7]. Последнее его свойство наиболее широко используется в онкологии для увеличения эффективности радиотерапии злокачественных новообразований. Так, для повышения эффективности лучевой терапии опухолей прямой кишки больным на фоне облучения вводят 5-фторурацил (5-ФУ) и МТ [8]. Кроме того, онкологическим больным после хирургического лечения и на фоне адъювантной химиотерапии назначают МТ для профилактики местных инфекционных осложнений [9]. Вместе с тем в литературе имеются сведения о влиянии МТ на токсичность цитостатиков. В частности, было показано, что МТ повышает токсичность метотрексата и 5-ФУ при совместном ведении мышам с привитыми опухолями [10]. В клинических исследованиях установлено, что введение алкилирующего агента бисульфана на фоне МТ приводило к значительному повышению печеночных ферментов по сравнению с контрольной группой, получавшей цитостатик в монорежиме [11]. Также было показано, что МТ способен влиять на фармакокинетику иммунодепрессанта такролимуса, существенно повышая его биологическую активность и параллельно токсичность. Так, чтобы избежать передозировки препарата на фоне применения МТ курсовую дозу иммуносупрессанта такролимуса пришлось уменьшить в 4 раза [12]. Хотя сам факт увеличения токсичности препаратов при их совместном применении с МТ и необходимость использования МТ у онкологических больных не вызывает сомнений. Одним из перспективных направлений, обеспечивающих снижение влияния МТ на токсические свойства цитостатиков, может быть разработка оптимальных режимов введения этих препаратов друг относительно друга [13].

Целью настоящей работы явилось изучение влияния различных временных промежутков между введением МТ и 5-ФУ на их биологическое действие. Выбор препаратов обусловлен широтой их применения в онкологической практике при различных формах онкологических заболеваний.

Животные. Мыши линии СВА/Lac самцы и C57Bl/6 самки массой 18—20 г в возрасте 1,5 мес получены из питомника «Столбовая» Московской области. МТ и 5-ФУ — официнальные препараты фирмы «Эбеве». Использованные дозы являлись максимально переносимыми или были близки к таковым, что было обусловлено необходимостью зарегистрировать эффект увеличения токсичности комбинированного использования препаратов. МТ использовали однократно в дозе 1 г на 1 кг массы тела животного (максимально переносимая доза 1,4 г/кг). Противоопухолевую эффективность комбинированного действия препаратов исследовали в следующих режимах: 5-ФУ вводили в дозе 100 мг/кг подкожно, а МТ — в дозе 1 г/кг внутрибрюшинно за 20 мин, 1 ч, 4 ч, 12 ч до введения 5-ФУ. В каждой группе было по 10 животных. При оценке токсичности изучаемой комбинации МТ вводили внутрибрюшинно в дозе 1 г/кг за 20 мин, 1 и 4 ч до подкожного введения 5-ФУ. Лечение начинали через 7 дней после трансплантации опухолевых клеток. В каждой группе было по 10 животных мышей линии СВА/Lac. Фиксировали гибель животных в течение 30 дней после введения препаратов, оценивая достоверность различий в продолжительности их жизни в группах, получивших один антиметаболит и антиметаболит с модификатором. В каждой группе было по 10 животных. В контрольных группах мышам вводили в монорежиме 5-ФУ или М.Т. Группа «чистого» контроля получала изотонический раствор натрия хлорида.

Перевиваемые опухоли. Меланома В16 и муцинозный рак яичников СаО-1 получены из банка опухолевых штаммов ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Перевиваемая карцинома яичников СаО-1 описана как высокочувствительная к действию 5-ФУ [1, 2]. Меланома В16 резистентная к 5-ФУ. В опытах использовали 3-й пассаж опухоли in vivo. Взвесь опухолевой ткани выполняли по 10⁵ клеток в 0,1 мл питательной среды 199. Клетки меланомы В16 перевивали мышам линии C57Bl/6, карциному яичников СаО-1 перевивали мышам линии СВА/Lac. Противоопухолевый эффект оценивали по объему опухоли и торможению роста опухоли (ТРО). Объем опухоли в динамике (в мм³) определяли по формуле V=a²b, где а — наименьший линейный размер опухоли в миллиметрах; а, b — наибольший линейный размер опухоли в миллиметрах. Торможение роста опухоли рассчитывали по формуле: ТРО = V_{ср. опыт} – V_{ср. контроль} /V_{ср. контроль}. Токсический эффект препаратов и их комбинации оценивали по количеству лейкоцитов в периферической крови животных, изменению их массы тела и динамике их гибели.

На рис. 1 показана динамика роста опухоли карциномы яичников СаО-1 в контроле и на фоне воздействия препаратами 5-ФУ и М.Т. Введение М.Т. внутрибрюшинно в дозе 1 г/кг на 7-е сутки после перевивки опухоли не оказывало достоверного влияния на динамику ее роста. Введение подкожно 5-ФУ в дозе 100 мг/кг на 7-е сутки после перевивки опухоли вызывало задержку выхода опухоли более чем на 2 нед. Подкожное введение 5-ФУ через 1 ч после внутрибрюшинной инъекции МТ усиливало эффект цитостатика, увеличивая время выхода опухоли с 14 сут при воздействии 5-ФУ в монорежиме до 17 сут. Аналогичный эффект наблюдался при воздействии МТ за 20 мин до инъекции цитостатика. Однако при данной схеме введения 5-ФУ и МТ наблюдалась гибель до 40% животных. Гибель животных позволяет предположить усиление токсичности данной комбинации препаратов. Введение цитостатика через 4 и 12 ч не влияло на эффект цитостатика.

На рис. 2 показана динамика роста карциномы яичников СаО-1 в контроле и на фоне воздействия препаратами при увеличении интервала между введения антиметаболита и МТ до 12 ч. Как видно из приведенного рисунка, в контрольной группе отмечается быстрый рост первичного узла. Введение М.Т. внутрибрюшинно в дозе 1 г/кг на 7-й день после перевивки опухоли не оказывает никакого достоверного влияния на рост опухоли. Введение подкожно 5-ФУ в дозе 100 мг/кг на 7-й день после перевивки опухоли вызывало более короткую задержку выхода опухоли. Совместное введение МТ и через 12 ч 5-ФУ не увеличивало противоопухолевый эффект антиметаболита. Однако увеличение интервала введения до 12 ч приводило к гибели не более 10% животных в этой экспериментальной группе. Отсутствие гибели животных свидетельствует об уменьшении токсичности комбинации препаратов при данной схеме введения по сравнению с предыдущей.

На рис. 3 представлена динамика роста меланомы В16 в контрольной группе и на фоне воздействия препаратами. Введение М.Т. в дозе 1 г/кг массы тела животных на 7-й день после перевивки опухоли не оказывало значимого влияния на рост опухоли. 5-ФУ в дозе 100 мг/кг на 7-й день после перевивки опухоли не вызывал торможение роста опухоли. Подкожное введение 5-ФУ через 20 мин после МТ также не приводило к появлению противоопухолевого эффекта антиметаболита. Эти данные свидетельствуют, что МТ не оказывает модифицирующего действия на клетки меланомы, которое позволило бы преодолеть исходную резистентность опухоли к этому противоопухолевому препарату.

В специальной серии опытов было оценено влияние МТ на токсичность 5-ФУ. В табл. 1 представлены результаты экспериментов по изучению влияния интервала между введением 5-ФУ и МТ на гибель животных. Как следует из данных табл. 1, 5-ФУ не вызывал гибели мышей в дозе 200 мг/кг. Однако введение модификатора МТ за 20 мин до инъекции противоопухолевого препарата приводило к гибели 70% животных, что свидетельствует об увеличении токсичности химиопрепарата под воздействием МТ. 5-ФУ в дозе 300 мг/кг приводил к летальным эффектам 70% особей, а его применение через 20 мин после введения МТ (1 г/кг) вызывало 100% гибель. При этом отмечается достоверное уменьшение средней продолжительности жизни погибших животных с 14 до 9,9 сут. Увеличение интервала между введением модификатора и 5-ФУ до 1 ч снижало гибель животных в данной группе до 90%. Снижение токсичности комбинации препаратов можно объяснить быстрым метаболизмом МТ в организме мыши. Очевидно, что за этот период концентрация МТ в крови снижается и уменьшается ее влияние на токсичность 5-ФУ.

Это предположение подтверждается данными, свидетельствующими, что дальнейшее увеличение интервала между введением препаратов до 4 ч приводит к еще большему уменьшению токсичности комбинированного действия МТ и 5-ФУ. Сам модификатор в монорежиме не вызывал гибели животных.

В табл. 2 представлены результаты экспериментов по изучению влияния противоопухолевого препарата и МТ, а также их комбинации на количество лейкоцитов в периферической крови мышей. В контрольной группе животных количество лейкоцитов в периферической крови было стабильным на протяжении всего периода наблюдения со средними показателями от 9,6 до 11,2∙10³ кл/мкл. Введение модификатора МТ в дозе 1 г/кг вызывало снижение количества лейкоцитов в периферической крови до 7,6∙10³ кл/мкл на 4-е сутки после введения МТ. В последующие дни наблюдалось восстановление количества клеток в периферической крови практически до исходных уровней. В группе животных, получивших 5-ФУ в дозе 100 мг/кг, также отмечалось снижение количества лейкоцитов в периферической крови до 7,0∙10³ кл/мкл на 4-е сутки после введения противоопухолевого препарата. В последующие дни также наблюдалось восстановление количества клеток в периферической крови практически до исходных уровней. В группе животных, которым вводили модификатор за 2 ч до инъекции противоопухолевого препарата, также отмечалось снижение количества лейкоцитов в периферической крови до 6,1∙10³ кл/мкл на 4-е сутки после введения противоопухолевого препарата. В последующие дни наблюдалось восстановление количества клеток в периферической крови. Однако восстановления до исходного количества клеток в периферической крови мышей в изученный период времени не произошло. Последнее обстоятельство можно объяснить увеличением токсичности данной комбинации препаратов по сравнению с их раздельным применением. Увеличение интервала между введением модификатора и противоопухолевого препарата до 4 ч привело к тому, что динамика изменения количества лейкоцитов в периферической крови была сходной с таковой в группе мышей, получивших 5-ФУ в монорежиме.

Как следует из табл. 3, в контрольной группе животных средняя масса тела была стабильна на протяжении всего периода наблюдения. Введение модификатора МТ в дозе 1 г/кг вызывает снижение массы примерно на 5% (с 21, 5 до 20,5 г). В группе животных, получивших 5-ФУ в дозе 100 мг/кг, также отмечается снижение массы тела животных примерно на 5%. В группе животных, которые получили модификатор за 2 ч до введения противоопухолевого препарата, отмечается достоверное снижение массы тела животных, достигая к 7-му дню 16,1 г (снижение на 25%), что свидетельствует об усилении общетоксического действия комбинации препаратов по сравнению с раздельным их применением. При увеличении интервала между введением модификатора и противоопухолевого препарата до 4 ч потеря массы тела животных не отличается от данного показателя в группах животных при раздельном применении этих препаратов.

В настоящем исследовании приведены данные по влиянию МТ на специфическую активность противоопухолевого препарата 5-ФУ. Лечебное действие препарата и его комбинации с МТ оценивали по влиянию на динамику роста опухолей у мышей — меланомы В16 и карциномы яичников СаО-1.

5-ФУ тормозил рост карциномы яичников СаО-1. Влияние М.Т. на противоопухолевую эффективность 5-ФУ зависело от интервала между введением МТ и цитостатика. Усиление противоопухолевого действия 5-ФУ отмечалось при введении модификатора через 20 мин и 1 ч после цитостатика. МТ и эффект синергизма комбинации уменьшался при увеличении интервала между введениями этих препаратов.

Отсутствие усиления противоопухолевого эффекта комбинации у мышей с привитой меланомой В16, резистентной к 5-ФУ, указывает, что МТ не является модификатором устойчивости меланомы В16 к 5-ФУ. Вышеизложенное позволяет предположить, что МТ оказывает влияние на метаболизм 5-ФУ. Это положение подтверждается серией опытов, посвященных исследованию токсичности комбинации от дозы 5-ФУ и временнóго интервала между введениями МТ и цитостатика. Согласно полученным данным, временнóй интервал 5-ФУ должен быть не менее 4 ч. При меньшем интервале (в частности, через 2 ч) токсичность цитостатика возрастает в 1,5—2 раза, что приводит к увеличение гибели животных.

Таким образом, полученные результаты подтверждают единичные экспериментальные и клинические данные литературы об усилении биологического эффекта цитостатика при совместном введении МТ [12]. На основании проведенных исследований для клинической практики следует рекомендовать временнóй интервал между введением МТ и цитостатика 5-ФУ не менее 30 ч. Данная цифра может быть получена из сопоставления периодов полуэлиминации препаратов в организме животных и человека. У грызунов он значительно короче — менее 1 ч, тогда как в организме человека этот показатель составляет около 10 ч [1]. Поэтому должно пройти не менее трех периодов полуэлиминации, чтобы концентрация препаратов в сыворотке крови снизилась до безопасного уровня.

Благодарности. Работа опубликована в память о научном сотруднике Александре Тихоновиче Градюшко. Исследование выполнено при его непосредственном участии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: C.А.Я., Ф.В.Д.

Сбор и обработка материала: C.А.Я., Б.С.А.

Статистическая обработка: Ю.И. Д.

Написание текста: C.А.Я.

Редактирование: Ф.В.Д.