Введение
Репродуктивные дисфункции у женщин, такие как бесплодие и невынашивание беременности, остаются важными проблемами медицины в течение долгого времени и имеют тенденцию к увеличению их частоты. В настоящее время в Российской Федерации четверть пар имеют нарушения репродукции [1]. По данным Европейского руководства «Привычная потеря беременности» (Recurrent pregnancy loss. Guideline of European Society of Human Reproduction and Embryology, 2017), досрочно прерывается каждая пятая беременность [2]. Известно много причин нарушений фертильности у женщин [3, 4], однако меньше всего в литературе информации об эндометриальной дисфункции как причине гравидарных неудач [5—7].
Известно, что в течение менструального цикла эндометриальная ткань претерпевает циклические изменения, необходимые для успешной имплантации плодного яйца [8, 9]. Одним из прогностических факторов, препятствующих имплантации бластоцисты, может стать недостаточная величина М-эхо по данным ультразвукового исследования (УЗИ) [10]. Считается, что при средней длительности менструального цикла 28—30 дней на 11—13-й день цикла толщина эндометрия должна быть больше или равна 7 мм. Эндометрий, величина М-эхо которого к этому сроку не достигает 7 мм, определяется как «тонкий», или гипопластический [6, 10]. В литературе нет достаточных данных, является ли «тонкий» эндометрий безусловным маркером нарушений репродуктивной функции.
В норме имплантация бластоцисты происходит в период «окна имплантации», который наступает на 6—8-й день после овуляции [11, 12]. В этот отрезок времени слизистая оболочка тела матки соответствует средней стадии фазы секреции и обладает наибольшей рецептивностью. На ультраструктурном уровне рецептивности эндометрия наиболее благоприятные условия для имплантации бластоцисты наблюдаются при снижении экспрессии эстрогеновых рецепторов (estrogen receptors, ER) в железах и строме эндометрия, низкой экспрессии прогестероновых рецепторов (progesteron receptors, PR) в эндометриальных железах, высокой экспрессии PR в строме эндометрия [4, 7, 11]. Такой вариант гормон-рецепторных характеристик слизистой оболочки тела матки рассматривается как норморецепторный иммунофенотип (ИФТ-1) [13]. В литературе нет достаточных данных о рецептивности «тонкого» эндометрия в естественных циклах зачатия.
Описаны протеомные маркеры, которые напрямую связаны с рецептивностью эндометрия, такие как цитокины, факторы роста, интерлейкины, в том числе лейкемия-ингибирующий фактор (ЛИФ, LIF). Наиболее изученным в настоящее время маркером в отношении рецептивности эндометрия является ЛИФ, который оказывает выраженное влияние на пролиферацию слизистой оболочки тела матки. В эндометрии ЛИФ продуцируется в течение всего менструального цикла, достигая максимальных значений в средней секреторной фазе [14, 15]. В литературе описаны данные, что у женщин с репродуктивными дисфункциями происходит снижение экспрессии ЛИФ в период «окна имплантации», чего не отмечено у здоровых фертильных женщин [14, 16]. В экспериментальных исследованиях на мышах доказано, что при инактивации гена, кодирующего ЛИФ, нарушены процессы имплантации плодного яйца в слизистую оболочку тела матки. Однако при переносе бластоцисты от самок с интактными генами ЛИФ к самкам с нормальным геном процессы имплантация были успешными, это означает, что ЛИФ в эндометрии имеет значение для процесса имплантации. Следует отметить, что при введении рекомбинантного ЛИФ мышам с дефицитом гена ЛИФ процессы имплантации восстанавливались [17].
Наиболее частой причиной углубленного изучения образцов слизистой оболочки тела матки у женщин являются повторяющиеся эпизоды гравидарных неудач при использовании вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Нет достаточных данных о рецептивности слизистой оболочки тела матки у женщин с синдромом гипопластического эндометрия в циклах естественного зачатия. В изученной литературе не представлена информация об исследовании протеомных маркеров в «тонком» эндометрии. Неясным остается вопрос, является ли гипопластический эндометрий (по данным УЗИ в преовуляторном периоде) у женщин с нарушениями репродукции самостоятельным показанием к углубленному исследованию его образцов.
Цель исследования — оценить экспрессию ЛИФ в люминальном эпителии, железах и строме эндометрия в период «окна имплантации» у женщин с репродуктивной дисфункцией в анамнезе при различной толщине эндометрия.
Материал и методы
Дизайн исследования
Проведено проспективное когортное сравнительное исследование. Сформированы три группы пациенток: основная группа (n=52) — женщины с «тонким» эндометрием, группа сравнения (n=62) — женщины с нормальным по толщине эндометрием (женщины обеих групп с невынашиванием беременности и бесплодием неясного генеза в анамнезе); контрольная группа (n=16) — здоровые фертильные женщины.
Критерии включения и исключения
Для основной группы и группы сравнения установлены следующие критерии включения: возраст участниц 20—40 лет; наличие подписанного информированного согласия; наличие в анамнезе бесплодия и/или невынашивания беременности неясного генеза; нормогонадотропное нормопролактинемическое состояние, эутиреоз; овуляторный менструальный цикл. Дополнительные критерии включения: для основной группы — величина М-эхо (по данным УЗИ) <7 мм на 11—13-й день менструального цикла (при его длительности 28—30 дней); для группы сравнения — нормальная толщина эндометрия (М-эхо ≥7 мм) в преовуляторном периоде по данным УЗИ.
Критерии включения в контрольную группу: репродуктивный возраст 20—40 лет, подписанное информированное добровольное согласие, отсутствие нарушений репродуктивной функции в анамнезе.
Критерии исключения для всех женщин: соматические заболевания (стадия декомпенсации или нестойкой ремиссии); системные аутоиммунные заболевания (за исключением аутоиммунного тиреоидита при эутиреозе); злокачественные опухоли в анамнезе и/или в настоящее время; гормон-продуцирующие опухоли в настоящем/прошлом; индекс массы тела ≥30 кг/м2; выявленные генетические маркеры наследственных тромбофилий; аномалии развития органов мочеполовой системы; эндометриоз; наличие инфекционно-воспалительного процесса урогенитального тракта в период инвазивного внутриматочного вмешательства; наличие миоматозных узлов диаметром 30 мм и более, субмукозной миомы матки; прием препаратов половых гормонов менее чем за 3 мес до включения в исследование.
Условия проведения
Исследование проведено на клинических базах кафедры акушерства и гинекологии ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России.
Гормональное обследование
Определение уровней гормонов в образцах периферической крови проводили с помощью иммуноферментного и хемилюминесцентного методов. Уровни фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ) определяли в крови, полученной из локтевой вены на 2—3-й день менструального цикла (д.м.ц.); концентрацию пролактина и тиреотропного гормона (ТТГ) — в любой д.м.ц. Гормональное обследование проводили с использованием тест-систем для определения ФСГ, ЛГ, пролактина и ТТГ («Алкор Био», Россия),эстрадиола, прогестерона («Beckman Coulter Inc.», США).
Ультразвуковое мониторирование роста фолликула, М-эхо, овуляции
Всем участницам исследования проводили УЗИ органов малого таза в двух менструальных циклах подряд и в менструальном цикле, в котором выполнена биопсия эндометрия (отслеживали толщину эндометрия, мониторировали рост фолликула и овуляцию). Нормальной толщиной эндометрия считали величину М-эхо ≥7 мм (по данным УЗИ на 11—13-й день менструального цикла при его длительности 28 дней) [6, 10, 12].
Внутриматочное вмешательство, анализы крови
На 6—8-й день после овуляции (д.п.о.) всем пациенткам проводили инвазивное внутриматочное вмешательство. В течение менструального цикла, в котором выполняли биопсию эндометрия, женщины использовали барьерный метод контрацепции. Пайпель-биопсию слизистой оболочки тела матки проводили на фоне нормобиоценоза влагалища у всех участниц. Для биопсии эндометрия использовали специальный урогенитальный зонд типа Pipelle («Jiangsu Suyun Medical Materials Co. Ltd.», Китай). В день проведения биопсии слизистой оболочки матки получали образец периферической крови для определения уровней эстрадиола (Е2) и прогестерона (Р).
Оценка экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в эндометрии
Исследование образцов эндометрия проводили на базе ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России (Санкт-Петербург) с применением гистологического и иммуногистохимического методов. Из образцов эндометрия сформированы парафиновые блоки (использовался гистопроцессор Leica ASP200 («Leica Biosystems Nussloch GmbH», Германия), с которых в дальнейшем выполняли срезы толщиной 3—5 мкм микротомом Microm HM340E («Thermo Shandon Limited trading as Thermo Fisher Scientific», Соединенное Королевство). Срезы окрашивали эозином и гематоксилином для проведения гистологического исследования.
Для оценки экспрессии рецепторов половых стероидов в железах и в строме эндометрия применяли иммуногистохимический метод с использованием полимерного EnVision-метода с применением системы визуализации («Dakocytomation Denmark А/S», Дания). Для окрашивания использовали моноклональные мышиные антитела к рецепторам эстрогенов Clone 1D5, RTU, моноклональные антитела к рецепторам прогестерона ClonePgR 636, RTU («Dakocytomation Denmark А/S», Дания).
Счет ER и PR в эндометрии осуществляли с помощью микроскопа Leica DM200 («Leica Camera AG», Германия) и рассчитывали H-score (Histochemical Score):
H-score = 1×(% клеток со слабо окрашенными ядрами)+2×(% клеток с умеренно окрашенными ядрами)+3×(% клеток с сильно окрашенными ядрами)
Значения H-score были в диапазоне от 0 до 300 [4, 7].
Оценка экспрессии лейкемия-ингибирующего фактора в эндометрии
Иммуногистохимическое окрашивание и оценку экспрессии ЛИФ проводили в патолого-анатомическом отделении ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России (заведующая отделением — к.м.н. А.С. Артемьева).
Из парафиновых блоков сформированы TMA-матрицы (мультиблоки) в установке TMA Grand Master («3D Histech Kft.», Венгрия). Окрашивание микропрепаратов проводили с использованием поликлональных кроличьих антител anti-LIF в автоматизированной системе Ventana BenchMark ULTRA («Ventana Medical Systems, Inc.», США). Полученные препараты эндометрия сканировали в установке Pannoramic 250 («3D Histech Kft.», Венгрия); цифровые изображения TMA-матриц оценивали с использованием программного обеспечения Case Viewer 3D («3D Histech Kft.», Венгрия).
Экспрессию ЛИФ определяли отдельно в клетках люминального эпителия, железах и строме слизистой оболочки тела матки с применением визуальной количественной шкалы. Оценку экспрессии ЛИФ проводили полуколичественно: 0 — отсутствие окрашивания, 1 — умеренное окрашивание, 2 — выраженное окрашивание. Для статистического анализа экспрессию ЛИФ определяли как выраженную (выраженное окрашивание) или сниженную (умеренное окрашивание или его отсутствие).
Этические аспекты
Дизайн исследования утвержден локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова» Минздрава России (протокол №10 от 09.11.16, протокол №8 от 11.11.20), соответствует Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием человека в качестве субъекта» (последняя редакция 2013 г., Форталеза, Бразилия). Все обследованные женщины подписывали информированное добровольное согласие до начала исследования.
Статистический анализ
Полученные результаты обработаны в программе Statistica portable v.13.5 («TIBCO Software Inc.», США). Количественные показатели оценивали с помощью непараметрических (критерии Краскела—Уоллиса, Манна—Уитни) методов. Количественные данные представлены в формате M±m. Качественные показатели оценивали двусторонним критерием Фишера. Для изучения статистических взаимосвязей показателей использовали непараметрический коэффициент корреляции Спирмена. Различия считали значимыми при p<0,05.
Результаты
Средний возраст участниц всех групп не имел статистически значимых различий: 32,5±0,6 года (основная группа), 33,1±0,6 года (группа сравнения), 32,5±0,6 года (группа контроля) (все женщины от 20 до 40 лет) (p>0,05). Средний возраст менархе пациенток основной группы составил 12,6±0,2 года (от 10 до 16 лет), группы сравнения — 12,8±0,1 года (от 11 до 15 лет), группы контроля — 12,9±0,7 года (от 11 до 15 лет) (p>0,05). Длительность менструального цикла не различалась у женщин всех группах: у женщин основной группы — 31,0±0,6 дня, группы сравнения — 30,2±0,8 дня, группы контроля — 30,9±0,9 дня (p>0,05).
У всех женщин, включенных в исследование, были нормальные значения уровней гипофизарных гормонов: ФСГ (МЕ/мл) — 8,3±0,3 (основная группа), 7,6±0,3 (группа сравнения), 6,2±0,5 (группа контроля); ЛГ (мМЕ/мл) — 6,1±0,3 (основная группа), 5,3±0,3 (группа сравнения), 5,3±0,4 (группа контроля); пролактин (мМЕ/мл) — 290,6±14,4 (основная группа), 286,8±18,2 (группа сравнения), 285,4±25,7 (группа контроля); ТТГ (мМЕ/мл) — 1,3±0,1 (основная группа), 1,5±0,1 (группа сравнения), 1,5±0,3 (группа контроля), для всех сравнений p>0,05. Все участницы исследования имели овуляторный менструальный цикл и нормоэстрогенемию, соответствующие показатели были сравнимы у женщин всех групп (табл. 1).
Таблица 1. Содержание половых стероидных гормонов (E2, P) в периферической крови в цикле проведения биопсии эндометрия (6—8-й день после овуляции) у женщин, включенных в исследование
| Показатели | Группа | Референсные значения | ||
| основная группа (М-эхо <7 мм) (n=52) | группа сравнения (М-эхо ≥7 мм) (n=62) | группа контроля (М-эхо ≥7 мм) (n=16) | ||
| E2, пмоль/л | 595,2±36,2 | 685,9±40,3 | 707,4±66,1 | 180—1070 |
| P, нмоль/л | 47,7±3,4 | 44,2±2,6 | 39,1±4,9 | 16,1—59,1 |
| E2/P | 14,2±0,9 | 15,9±1,3 | 19,9±1,8 | — |
Примечание. Для сравнений всех показателей p>0,05.
На 6—8-й день после овуляции всем женщинам выполняли пайпель-биопсию эндометрия с последующим гистологическим и иммуногистохимическим исследованием (экспрессия ER, PR, ЛИФ) эндометриальных образцов.
Проводили сравнительный анализ показателей экспрессии ЛИФ в люминальном эпителии, железах и строме эндометрия в зависимости от толщины слизистой оболочки тела матки. В ряде образцов эндометрия у женщин с нарушениями репродуктивной функции в сформированных ТМА-матрицах отсутствовал люминальный эпителий слизистой оболочки тела матки, в связи с чем данные об экспрессии ЛИФ в поверхностном эпителии эндометрия оценивали у 45 (из 52) женщин основной группы, у 45 (из 62) женщин группы сравнения и у всех 16 женщин контрольной группы. Число образцов эндометрия, в которых оценивали экспрессию ЛИФ в железах и строме слизистой оболочки тела матки, соответствовало числу женщин в группах.
При гипопластическом эндометрии статистически значимо чаще встречалась сниженная экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии и в железах эндометрия, чем при нормальной толщине эндометрия у женщин группы сравнения и у здоровых женщин группы контроля (p<0,05). Статистически значимых различий по показателю сниженной экспрессии ЛИФ в люминальном эпителии и железах эндометрия между женщинами группы сравнения и группы контроля не было (p>0,05). В строме эндометрия сниженная экспрессия ЛИФ встречалась чаще у женщин с репродуктивной дисфункцией в анамнезе в целом (основная группа и группа сравнения), чем у здоровых женщин (p<0,05), но не было статистически значимых различий между экспрессией в гипопластическом эндометрии и в нормальной по толщине слизистой оболочке тела матки (p>0,05). Данные об эндометриальной экспрессии ЛИФ в зависимости от толщины эндометрия отражены в табл. 2.
Таблица 2. Показатели счета экспрессии лейкемия-ингибирующего фактора в люминальном эпителии, железах и строме эндометрия (6—8-й день после овуляции) у женщин, включенных в исследование, в соотношении с толщиной эндометрия
| Экспрессия ЛИФ | Основная группа (М-эхо <7 мм) (n=52) | Группа сравнения (М-эхо ≥7 мм) (n=62) | Группа контроля (М-эхо ≥7 мм) (n=16) | p |
| Экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии, % (n) | ||||
| n | n=45 | n=45 | n=16 | р1—2=0,01 р1—3=0,01 р2—3=0,3 |
| сниженная (0—1/2 1) | 38 (17) | 15,5 (7) | 6,25 (1) | |
| выраженная (2/2 0) | 62 (28) | 84,5 (38) | 93,75 (15) | |
| Экспрессия ЛИФ в железах эндометрия, % (n) | ||||
| n | n=52 | n=62 | n=16 | р1—2=0,03 р1—3= 0,03 р2—3=0,2 |
| сниженная (0—1/2 1) | 33 (17) | 19 (12) | 6,25 (1) | |
| выраженная (2/2 0) | 67 (35) | 81 (50) | 93,75 (15) | |
| Экспрессия ЛИФ в строме эндометрия, % (n) | ||||
| n | n=52 | n=62 | n=16 | р1—2=0,3 р1—3=0,003 р2—3=0,0003 |
| сниженная (0—1/2 1) | 54 (28) | 63 (39) | 12,5 (2) | |
| выраженная (2/2 0) | 46 (24) | 37 (23) | 87,5 (14) | |
Примечание. В табл. 2—7 ЛИФ — лейкемия-ингибирующий фактор.
При гистологическом исследовании у всех женщин контрольной группы наблюдалась полноценная секреторная трансформация эндометрия. Эндометрий средней фазы секреции определяли у 25% (n=13 из 52) женщин основной группы и у 39% (n=24 из 62) женщин группы сравнения. У остальных участниц исследования основной группы и группы сравнения наблюдалось отставание секреторных преобразований слизистой оболочки тела матки от соответствующих дней менструального цикла.
Проводили сравнительную оценку экспрессии ЛИФ в слизистой оболочке тела матки в соотношении с гистологической характеристикой эндометрия. У ряда женщин с репродуктивными нарушениями в сформированных ТМА-матрицах отсутствовал люминальный эпителий, поэтому экспрессия ЛИФ в поверхностном эпителии оценена у некоторых женщин (данные о количестве образцов представлены в табл. 3).
Таблица 3. Число эндометриальных образцов, в которых оценивали экспрессию лейкемия-ингибирующего фактора в люминальном эпителии в соотношении с гистологическими характеристиками эндометрия
| Экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии | Основная группа (n=52) | Группа сравнения (n=62) | Группа контроля (n=16) | ||
| полноценность секреторной трансформации | |||||
| полноценная | неполноценная | полноценная | неполноценная | полноценная | |
| Всего женщин, n | 13 | 39 | 24 | 38 | 16 |
| Исследованных образцов, n | 11 | 34 | 20 | 25 | 16 |
Сниженная экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии чаще встречалась у женщин с «тонким» эндометрием, чем у здоровых женщин (p<0,05). Сходная ситуация наблюдалась почти в половине случаев при сопоставлении с пациентками группы сравнения (с нормальной толщиной эндометрия). Не выявлены статистически значимые различия в экспрессии ЛИФ в люминальном эпителии при полноценных и неполноценных секреторных преобразованиях слизистой оболочки тела матки у женщин основной группы и группы сравнения (p>0,05). В железах эндометрия сниженная экспрессия ЛИФ встречалась статистически значимо чаще у женщин с гипопластическим эндометрием (независимо от результатов гистологического исследования), чем у здоровых фертильных женщин (p<0,05). Сниженная экспрессия ЛИФ в строме эндометрия встречалась чаще у женщин с репродуктивной дисфункцией (независимо от величины М-эхо), чем у здоровых женщин (p<0,05). Данные представлены в табл. 4.
Таблица 4. Показатели счета экспрессии лейкемия-ингибирующего фактора в люминальном эпителии, железах и строме эндометрия (6—8-й день после овуляции) у женщин, включенных в исследование, в соотношении с гистологическими характеристиками эндометрия
| Экспрессия ЛИФ/р | Основная группа (n=52) | Группа сравнения (n=62) | Группа контроля (n=16) | ||
| полноценность секреторной трансформации, % (n) | |||||
| полноценная (n=13) | неполноценная (n=39) | полноценная (n=24) | неполноценная (n=38) | полноценная (n=16) | |
| Экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии, % (n) | |||||
| n | n=11 | n=34 | n=20 | n=25 | n=16 |
| сниженная (0—1/2 1) | 45 (5) | 35 (12) | 20 (4) | 12 (3) | 6,25 (1) |
| выраженная (2/2 0) | 55 (6) | 65 (22) | 80 (16) | 88 (22) | 93,75 (15) |
| р | р1—2=0,5; р1—3=0,1; р1—4=0,02; р1—5=0,01; р2—3=0,2; р2—4=0,04; р2—5=0,03; р3—4=0,5; р3—5=0,2; р4—5=0,5 | ||||
| Экспрессия ЛИФ в железах эндометрия, % (n) | |||||
| n | n=13 | n=39 | n=24 | n=38 | n=16 |
| сниженная (0—1/2 1) | 31 (4) | 33 (13) | 21 (5) | 18 (7) | 6,25 (1) |
| выраженная (2/2 0) | 69 (9) | 67 (26) | 79 (19) | 82 (31) | 93,75 (15) |
| р | р1—2=0,9; р1—3=0,5; р1—4=0,3; р1—5=0,04; р2—3=0,3; р2—4=0,1; р2—5=0,04; р3—4=0,8; р3—5=0,2; р4—5=0,3 | ||||
| Экспрессия ЛИФ в строме эндометрия, % (n) | |||||
| n | n=13 | n=39 | n=24 | n=38 | n=16 |
| сниженная (0—1/2 1) | 85 (11) | 44 (17) | 75 (18) | 55 (21) | 12,5 (2) |
| выраженная (2/2 0) | 15 (2) | 56 (22) | 25 (6) | 45 (17) | 87,5 (14) |
| р | р1—2=0,07; р1—3=0,5; р1—4=0,06; р1—5=0,01; р2—3=0,06; р2—4=0,3; р2—5=0,03; р3—4=0,1; р3—5=0,0001; р4—5=0,004 | ||||
С помощью иммуногистохимического метода исследования оценивали экспрессию эстрогеновых рецепторов (ER) и прогестероновых рецепторов (PR). У здоровых фертильных женщин эндометриальная экспрессия рецепторов половых стероидов имела следующие характеристики: низкую экспрессию ER, PR в железах, снижение ER в строме, высокую экспрессию PR в строме эндометрия, что было определено как полноценный вариант гормон-рецепторных характеристик слизистой оболочки тела матки (иммунофенотип-1; ИФТ-1). Показатели счета ER, PR, схожие со здоровыми женщинами, отмечены у 21% (n=11 из 52) участниц основной группы и у 32% (n=20 из 62) участниц группы сравнения. Соответственно, в 79% (n=41) случаев у пациенток основной группы и в 68% (n=42) случаев у пациенток группы сравнения установлены отличные от контрольной группы варианты гормон-рецепторных характеристик эндометрия (изолированная или сочетанная гиперэкспрессия стероидных рецепторов в железах и/или строме слизистой оболочки тела матки) (ИФТ-2, 3, 4) [13].
Проведен сравнительный анализ эндометриальной экспрессии ЛИФ в зависимости от толщины эндометрия и варианта гормон-рецепторных характеристик слизистой оболочки тела матки. Как описано ранее, выявлена когорта женщин с репродуктивной дисфункцией, у которых отсутствовал поверхностный эпителий в сформированных ТМА-матрицах. Число образцов слизистой оболочки тела матки, в которых определяли экспрессию ЛИФ в соотношении с вариантом гормон-рецепторных характеристик эндометрия, представлено в табл. 5.
Таблица 5. Число эндометриальных образцов, в которых оценивали экспрессию лейкемия-ингибирующего фактора в люминальном эпителии в соотношении с характеристиками гормон-рецепторного статуса эндометрия
| Экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии | Основная группа (n=52) | Группа сравнения (n=62) | Группа контроля (n=16) | ||
| ИФТ-1 (n=11) | ИФТ-2, 3, 4 (n=41) | ИФТ-1 (n=20) | ИФТ-2, 3, 4 (n=42) | ИФТ-1 (n=16) | |
| Всего женщин, n | 11 | 41 | 20 | 42 | 16 |
| Исследованных образцов, n | 10 | 35 | 15 | 30 | 16 |
Примечание. ИФТ — иммунофенотип.
При анализе экспрессии ЛИФ в соотношении с гормон-рецепторными характеристиками слизистой оболочки тела матки выявлены следующие наиболее важные различия. Сниженная экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии встречалась чаще у женщин с гипопластическим эндометрием (независимо от варианта гормон-рецепторных характеристик слизистой оболочки тела матки), чем у здоровых женщин группы контроля (p<0,05). В железах эндометрия сниженная экспрессия ЛИФ была статистически значимо чаще выявлена в когорте женщин основной группы с «тонким» эндометрием и нормальной экспрессией эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, чем у здоровых женщин из группы контроля. Сниженная экспрессия ЛИФ в строме эндометрия чаще встречалась у женщин с репродуктивныой дисфункцией в анамнезе, чем у здоровых женщин, независимо от толщины эндометрия и гормон-рецепторных характеристик слизистой оболочки тела матки (p<0,05). Показатели экспрессии ЛИФ в соотношении с гормон-рецепторным статусом эндометрия представлены в табл. 6.
Таблица 6. Показатели счета экспрессии лейкемия-ингибирующего фактора в люминальном эпителии, железах и строме эндометрия (6—8-й день после овуляции) у женщин, включенных в исследование, в соотношении с характеристиками гормон-рецепторного статуса эндометрия
| Экспрессия ЛИФ | Основная группа (n=52) | Группа сравнения (n=62) | Группа контроля (n=16) | ||
| М-эхо <7 мм + ИФТ-1 (n=11) | М-эхо <7 мм + ИФТ-2, 3, 4 (n=41) | М-эхо ≥7 мм + ИФТ-1 (n=20) | М-эхо ≥7 мм + ИФТ-2, 3, 4 (n=42) | М-эхо ≥7 мм + ИФТ-1 (n=16) | |
| Экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии, % (n) | |||||
| n | n=10 | n=35 | n=15 | n=30 | n=16 |
| сниженная (0—1/2 1) | 60 (6) | 31 (11) | 27 (4) | 10 (3) | 6,25 (1) |
| выраженная (2/2 0) | 40 (4) | 69 (24) | 73 (11) | 90 (27) | 93,75 (15) |
| р | р1—2=0,09; р1—3=0,09; р1—4=0,001; р1—5=0,003; р2—3=0,8; р2—4=0,04; р2—5=0,04; р3—4=0,1; р3—5=0,1; р4—5=0,7 | ||||
| Экспрессия ЛИФ в железах эндометрия, % (n) | |||||
| n | n=11 | n=41 | n=20 | n=42 | n=16 |
| Сниженная (0—1/2 1) | 45,5 (5) | 29 (12) | 25 (5) | 17 (7) | 6,25 (1) |
| Выраженная (2/2 0) | 54,5 (6) | 71 (29) | 75 (15) | 83 (35) | 93,75 (15) |
| р | р1—2=0,3; р1—3=0,2; р1—4=0,04; р1—5=0,02; р2—3=0,7; р2—4=0,2; р2—5=0,06; р3—4=0,4; р3—5=0,1; р4—5=0,3 | ||||
| Экспрессия ЛИФ в строме эндометрия, % (n) | |||||
| n | n=11 | n=41 | n=20 | n=42 | n=16 |
| Сниженная (0—1/2 1) | 54,5 (6) | 54 (22) | 65 (13) | 62 (26) | 12,5 (2) |
| Выраженная (2/2 0) | 45,5 (5) | 46 (19) | 35 (7) | 38 (16) | 87,5 (14) |
| р | р1—2=0,9; р1—3=0,6; р1—4=0,6; р1—5=0,02; р2—3=0,4; р2—4=0,5; р2—5=0,004; р3—4=0,8; р3—5=0,001; р4—5=0,0007 | ||||
Для более подробного изучения эндометриальной экспрессии ЛИФ пациентки разделены на подгруппы в зависимости от варианта гормон-рецепторных характеристик слизистой оболочки тела матки и данных гистологического заключения. В ряде случаев выявлено несоответствие гистологических характеристик эндометрия и показателей экспрессии ER, PR. При средней фазе секреции слизистой оболочки тела матки выявлена экспрессия ER, PR, отличная от таковой у здоровых женщин: в основной группе — 15% случаев (n=2 из 13), в группе сравнения — 33% случаев (n=8 из 24). И наоборот, при неполноценной секреторной трансформации эндометрия определялась сходная с группой контроля экспрессия ER и PR: в основной группе — 3% (n=1 из 39), в группе сравнения — 10% (n=4 из 38) [18].
В ряде случаев у женщин с репродуктивной дисфункцией в сформированных ТМА-матрицах отсутствовал люминальный эпителий. В изученных образцах эндометрия, содержащих люминальный эпителий, в 82% (n=37 из 45) случаев у женщин с синдромом гипопластического эндометрия сниженная экспрессия ЛИФ встречалась чаще, чем у женщин группы контроля (p<0,05). У остальных 18% (n=8 из 45 образцов с люминальным эпителием) женщин наблюдалась сходная с группой контроля экспрессия ЛИФ.
Сниженная экспрессия ЛИФ в железах эндометрия встречалась чаще (80%, n=42 из 52) у женщин с «тонким» эндометрием, чем у женщин группы контроля (p<0,05). У 20% (n=10 из 52) женщин с «тонким» эндометрием, у которых характеристики слизистой оболочки тела матки (экспрессия ER, PR; средняя секреторная трансформация эндометрия) были сходны с группой контроля, экспрессия ЛИФ в железах эндометрия не отличалась от таковой у здоровых фертильных женщин.
В строме эндометрия сниженная экспрессия ЛИФ выявлена чаще у всех женщин с репродуктивной дисфункцией в анамнезе, чем у здоровых женщин (p<0,05). Сниженная экспрессия ЛИФ в строме эндометрия чаще встречалась у женщин с «тонким» эндометрием, неполноценной секреторной трансформацией и неадекватными вариантами экспрессии ER, PR, чем у женщин основной группы с нормальной толщиной эндометрия и полноценной фазовой трансформацией слизистой оболочки тела матки. Показатели экспрессии ЛИФ представлены в табл. 7.
Таблица 7. Показатели счета экспрессии лейкемия-ингибирующего фактора в люминальном эпителии, железах и строме эндометрия у женщин (6—8-й день после овуляции), включенных в исследование, в соотношении с вариантами гормон-рецепторного статуса эндометрия и гистологическими характеристиками
| Экспрессия ЛИФ | Основная группа (n=52) | Группа сравнения (n=62) | Группа контроля (n=16) | ||||||
| М-эхо <7 мм + ИФТ-1 + полноценная (n=10) | М-эхо <7 мм + ИФТ-2, 3, 4 + неполноценная (n=38) | М-эхо <7 мм + ИФТ-1 + неполноценная (n=1) | М-эхо <7 мм + ИФТ-2, 3, 4 + полноценная (n=3) | М-эхо ≥7 мм + ИФТ-1 + полноценная (n=16) | М-эхо ≥7 мм + ИФТ-2, 3, 4 + неполноценная (n=34) | М-эхо ≥7 мм + ИФТ-1 + неполноценная (n=4) | М-эхо ≥7 мм + ИФТ-2, 3, 4 + полноценная (n=8) | М-эхо ≥7 мм + ИФТ-1 + полноценная (n=16) | |
| Экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии, % (n) | |||||||||
| n | n=8 | n=33 | n=1 | n=3 | n=14 | n=23 | n=2 | n=6 | n=16 |
| сниженная (0—1/2 1) | 38 (3) | 33 (11) | 100 (1) | 67 (2) | 14 (2) | 13 (3) | 0 (0) | 33 (2) | 6,25 (1) |
| выраженная (2/2 0) | 62 (5) | 67 (22) | 0 (0) | 33 (1) | 86 (12) | 87 (20) | 100 (2) | 67 (4) | 93,75 (15) |
| р | р1—2=0,8; р1—3=0,2; р1—4=0,4; р1—5=0,2; р1—6=0,1; р1—7=0,3; р1—8=0,8; р1—9=0,06; р2—3=0,1; р2—4=0,2; р2—5=0,1; р2—6=0,08; р2—7=0,3; р2—8=1,0; р2—9=0,04; р3—4=0,5; р3—5=0,03; р3—6=0,02; р3—7=0,08; р3—8=0,2; р3—9=0,005; р4—5=0,04; р4—6= 0,02; р4—7= 0,1; р4—8= 0,3; р4—9=0,008; р5—6=0,9; р5—7=0,6; р5—8=0,3; р5—9=0,5; р6—7=0,6; р6—8=0,2; р6—9=0,5; р7—8=0,3; р7—9=0,7; р8—9=0,1 | ||||||||
| Экспрессия ЛИФ в железах эндометрия, % (n) | |||||||||
| n | n=10 | n=38 | n=1 | n=3 | n=16 | n=34 | n=4 | n=8 | n=16 |
| сниженная (0—1/2 1) | 20 (2) | 32 (12) | 100 (1) | 67 (2) | 24 (4) | 15 (5) | 50 (2) | 12,5 (1) | 6,25 (1) |
| выраженная (2/2 0) | 80 (8) | 68 (26) | 0 (0) | 33 (1) | 75 (12) | 85 (29) | 50 (2) | 87,5 (7) | 93,75 (15) |
| р | р1—2=0,4; р1—3=0,08; р1—4=0,1; р1—5=0,7; р1—6=0,7; р1—7=0,3; р1—8=0,7; р1—9=0,3; р2—3=0,1; р2—4=0,2; р2—5=0,6; р2—6=0,09; р2—7=0,5; р2—8=0,3; р2—9=0,04; р3—4=0,5; р3—5=0,1; р3—6=0,02; р3—7=0,4; р3—8=0,04; р3—9=0,005; р4—5= 0,1; р4—6= 0,02; р4—7= 0,6; р4—8= 0,07; р4—9=0,008; р5—6=0,4; р5—7=0,3; р5—8=0,4; р5—9=0,1; р6—7=0,08; р6—8=0,8; р6—9=0,4; р7—8=0,1; р7—9=0,02; р8—9=0,6 | ||||||||
| Экспрессия ЛИФ в строме эндометрия, % (n) | |||||||||
| n | n=10 | n=38 | n=1 | n=3 | n=16 | n=34 | n=4 | n=8 | n=16 |
| сниженная (0—1/2 1) | 80 (8) | 42 (16) | 100 (1) | 100 (3) | 69 (11) | 53 (18) | 75 (3) | 87,5 (7) | 12,5 (2) |
| выраженная (2/2 0) | 20 (2) | 58 (22) | 0 (0) | 0 (0) | 31 (5) | 47 (16) | 25 (1) | 12,5 (1) | 87,5 (14) |
| р | р1—2=0,03; р1—3=0,6; р1—4=0,4; р1—5=0,5; р1—6=0,1; р1—7=0,8; р1—8=0,7; р1—9=0,0006; р2—3=0,2; р2—4=0,04; р2—5=0,07; р2—6=0,3; р2—7=0,2; р2—8=0,02; р2—9=0,03; р3—4=1,0; р3—5=0,5; р3—6=0,3; р3—7=0,6; р3—8=0,7; р3—9=0,03; р4—5=0,3; р4—6=0,1; р4—7=0,3; р4—8=0,5; р4—9=0,002; р5—6=0,3; р5—7=0,8; р5—8=0,3; р5—9=0,001; р6—7=0,4; р6—8=0,07; р6—9=0,006; р7—8=0,6; р7—9=0,01; р8—9=0,0003 | ||||||||
Обсуждение
В изученной литературе описано, что недостаточная толщина эндометрия может быть прогностическим фактором для неудач репродукции [5]. «Тонким» считается эндометрий, величина М-эхо которого в преовуляторные дни менструального цикла составляет менее 7 мм по данным УЗИ [6, 19, 20]. Однако описаны случаи наступления беременности как при «тонком» эндометрии (менее 7 мм), так и при «абсолютно тонком» эндометрии (4—5 мм). Это позволяет предположить, что такой изолированный показатель, как величина М-эхо, не является абсолютным прогностическим маркером нарушений фертильности у женщин репродуктивного возраста [21, 22].
Важная роль в успешном наступлении имплантации принадлежит рецептивности эндометрия [4, 8]. Считается, что благополучная имплантация плодного яйца возможна при полноценном взаимодействии половых стероидов со своими эндометриальными рецепторами, полноценной фазовой трансформации эндометрия и достаточной экспрессии в нем протеомных маркеров [4, 7]. В литературе не описаны иммуногистохимические и гистологические характеристики гипопластического эндометрия у женщин с нарушениями фертильности.
Использование сочетанного иммуногистохимического и гистологического методов исследования позволило более детально изучить эндометриальные биоптаты, чтобы оценить, каким образом экспрессия ЛИФ реализуется в слизистой оболочке тела матки при различных вариантах трансформации эндометрия, гормон-рецепторных взаимодействий в нем, а также при разной величине М-эхо.
Мы провели сравнительный анализ экспрессии ЛИФ в люминальном эпителии, железах и строме эндометрия при различной толщине эндометрия у женщин с анамнезом репродуктивных нарушений неясного генеза и у здоровых фертильных женщин. Кроме того, мы выполнили более детальное изучение образцов эндометрия в подгруппах при различных вариантах секреторной трансформации эндометрия и гормон-рецепторных характеристик эндометрия в соотношении с толщиной слизистой оболочки тела матки.
У женщин с нарушениями фертильности в анамнезе (при различной толщине эндометрия) и женщин контрольной группы не было статистически значимых различий в уровнях E2 и P в периферической крови (все участницы исследования имели овуляторные значения Р и нормоэстрогенемию).
В предыдущих наших исследованиях мы показали, что каждая пятая женщина с синдромом гипопластического эндометрия и репродуктивной дисфункцией в анамнезе имела сходные со здоровыми женщинами варианты гормон-рецепторных взаимодействий в слизистой оболочке тела матки [18]. Таких данных в изученной литературе мы не обнаружили. Однако косвенно эти результаты согласуются с немногочисленными наблюдениями успешной имплантации плодного яйца у женщин с величиной М-эхо менее 7 мм [21, 22].
Иммуногистохимический метод исследования экспрессии ЛИФ в данной работе позволил нам уточнить значение протеомных маркеров в механизмах нарушения рецептивности слизистой оболочки тела матки как при нормальной толщине эндометрия, так и при синдроме гипопластического эндометрия.
Мы подтвердили, что при нарушениях фертильности в анамнезе чаще встречается сниженная экспрессия ЛИФ, чем у женщин без репродуктивных нарушений, что согласуется со многими данными литературы о важной роли этого протеомного маркера в процессах имплантации бластоцисты [14, 16, 17]. Однако мы не встретили в источниках определения протеомных маркеров в слизистой оболочке тела матки в соотношении с экспрессией ER, PR и/или фазовой трансформацией эндометрия.
Нами выявлено, что изолированное иммуногистохимическое изучение экспрессии рецепторов половых стероидов или гистологическое исследование биоптатов эндометрия и дальнейшее деление участниц исследования только по данным признакам не показывает статистически значимых различий в экспрессии ЛИФ. Однако мы решили разделить участниц на подгруппы в зависимости от гормон-рецепторных характеристик эндометрия и варианта фазовой трансформации слизистой оболочки тела матки. В нашей работе были 10 (20%) женщин основной группы, у которых наблюдался вариант гормон-рецепторных взаимодействий в эндометрии, сходный с таковым у здоровых женщин (ИФТ-1), а также выявлена полноценная средняя стадия фазы секреции. Данное разделение позволило выявить, что у этих женщин экспрессия ЛИФ такая же, как у здоровых женщин, без статистически значимых различий. Это объясняет, почему некоторые женщины с «тонким» эндометрием способны забеременеть в естественном менструальном цикле. В то же время у подавляющего большинства (80%) женщин основной группы наблюдались характеристики слизистой оболочки тела матки, отличные от характеристик здоровых женщин, в том числе и в экспрессии протеомных молекул, что объясняет бо́льшую частоту репродуктивных неудач у женщин с синдромом гипопластического эндометрия.
В целом результаты этой работы позволили подтвердить наши предыдущие данные о том, что величина М-эхо в преовуляторные дни по данным УЗИ не является главенствующей характеристикой эндометрия [18]. Комплексное иммуногистохимическое и гистологическое исследование в сочетании с изучением экспрессии протеомных маркеров дает более глубинные представления о нарушениях механизмов рецептивности эндометрия. Сам по себе «тонкий» эндометрий не является предопределяющим фактором для изучения его биоптатов. Однако нарушения репродукции неясного генеза в анамнезе являются показанием к детальному изучению механизмов рецептивности слизистой оболочки тела матки при гипопластическом эндометрии.
Заключение
«Тонкий» эндометрий (<7 мм на 11—13-й день менструального цикла по данным ультразвукового исследования при его длительности 28—30 дней) не является маркером, безусловно определяющим нарушения фертильности у женщин репродуктивного возраста. Получены данные о наличии небольшой когорты женщин с синдромом гипопластического эндометрия, у которых может происходить успешная имплантация бластоцисты в естественном менструальном цикле. Почти у каждой пятой женшины (~20%) с синдромом «тонкого» эндометрия показатели рецептивности слизистой оболочки тела матки на гистологическом и протеомном уровне (экспрессия ER, PR, лейкемия-ингибирующего фактора) сходны с показателями у здоровых фертильных женщин (с нормальной толщиной эндометрия). В то же время недостаточная величина М-эхо предопределяет бо́льшую частоту (~80%) нарушений фертильности. Сочетанное исследование эндометрия на гистологическом, рецепторном и протеомном уровне позволяет оценить основные характеристики рецептивности «тонкого» эндометрия при репродуктивных неудачах в анамнезе.
Благодарность. Коллектив авторов выражает благодарность к.м.н. В.Н. Эллиниди (на момент проведения данного исследования — заведующий патолого-анатомическим отделением ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России) за методологическую помощь и исследование эндометриальных биоптатов при проведении данного исследования.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Аганезова Н.В., Аганезов С.С.
Сбор и обработка материала — Аганезова Н.В., Аганезов С.С., Гогичашвили К.Э., Артемьева А.С., Нюганен А.О.
Написание текста — Гогичашвили К.Э., Аганезов С.С.
Редактирование — Аганезова Н.В., Артемьева А.С.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.