Введение
В настоящее время в мировой литературе сложилось устойчивое согласованное мнение о хроническом эндометрите (ХЭ) как существенном факторе этиопатогенеза нарушений репродуктивной функции женщины [1—4].
Распространенность ХЭ варьирует от 10 до 85%. Широкий разброс частоты данной патологии эндометрия связан с трудностями диагностики, клинической и морфологической верификации заболевания [5, 6].
Как правило, ХЭ диагностируется с помощью биопсии эндометрия [3, 4]. В настоящее время среди многочисленных диагностических методов широко используется лабораторное исследование менструальных выделений (МВ). По данным ряда исследователей, это малоизученный, неинвазивный, перспективный способ ранней диагностики заболеваний женских репродуктивных органов [7]. Доказано, что наибольший объем клинически важной информации о формировании патологических процессов в репродуктивной сфере заключен в эндометриальных смывах и МВ [8]. По этой причине изучение состава МВ в последние годы становится актуальным вектором многих исследований в гинекологии как для решения проблем диагностики, так и для контроля эффективности проводимого лечения при различных заболеваниях.
Так, многочисленные научные работы посвящены исследованию свойств менструальной крови (МК), отличительных от «нормальной» (периферической) крови [9]. В состав МВ входит тканевой детрит, простагландины и значительное количество плазмина (фибринолизина) из эндометрия. Плазмин лизирует сгустки, поэтому менструальная кровь в норме их не содержит, пока кровопотеря не становится чрезмерной. Следует отметить, что менструальная кровь является преимущественно артериальной, венозное происхождение имеет не более 25% ее объема [10].
Доказано, что многие патологические процессы, особенно воспалительные, в женском организме тесно связаны с нарушением равновесия между перекисным окислением липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системой защиты (АОСЗ) [11—13].
При воспалении и нарушении микроциркуляции появляется целый каскад воспалительных факторов, которые запускают процесс ПОЛ и повреждение клеточных мембран [14, 15].
Ранее определение концентрации малонового диальдегида (МДА) как конечного продукта ПОЛ в периферической венозной крови использовалось для прогноза и контроля лечения ишемической болезни сердца, оценки тяжести поражения печени при вирусном гепатите C [16], для диагностики обострения хронического панкреатита и оценки эффективности его лечения [17], а также в качестве прогностического маркера острого нарушения мозгового кровообращения [18]. У женщин с ХЭ также изучали ПОЛ, но в качестве материала использовали сыворотку и плазму крови, гемолизат из эритроцитов периферической крови. Так, И.Н. Данусевич и соавт. (2016) [15] пришли к выводу, что процессы пероксидации липидов протекают менее агрессивно и сопровождаются низким содержанием диеновых конъюгатов и отсутствием повышения конечного продукта пероксидации — МДА. В то же время Г.О. Гречканев и соавт. (2016) [13] выявили значимое снижение активности антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы) и интенсификацию ПОЛ (увеличение содержания Imax, S, tg2ά, оснований Шиффа, диеновых и триеновых конъюгатов) у пациенток с ХЭ.
ХЭ характеризуют нарушения в системе ПОЛ—АОСЗ, как и при любом воспалительном процессе [12, 15].
Цель исследования — выявить особенности биохимических параметров МК у женщин с ХЭ при бесплодии.
Материал и методы
Обследуемую (основную) группу составили 90 пациенток в возрасте 18—40 лет, находившихся на стационарном лечении по поводу ХЭ и бесплодия с целью проведения прегравидарной подготовки в Ивановском НИИ материнства и детства (ИвНИИ МиД) им. В.Н. Городкова МЗ РФ. В контрольную группу были включены 30 пациенток в возрасте 18—40 лет с наличием в супружеской паре изолированного мужского фактора бесплодия (МКБ-10 N97.4) и с гистологически исключенным ХЭ, проходивших подготовку к экстракорпоральному оплодотворению (ЭКО) в отделении вспомогательных репродуктивных технологий в ИвНИИ МиД им. В.Н. Городкова МЗ РФ.
Критерии включения в основную группу: репродуктивный возраст 18—40 лет (STRAW+10 — репродуктивный период), наличие бесплодия и гистологически подтвержденного ХЭ (МКБ-10 N97.2).
Критерии включения в контрольную группу: репродуктивный возраст 18—40 лет (STRAW+10 — репродуктивный период), наличие в супружеской паре изолированного мужского фактора бесплодия (МКБ-10 N97.4) и гистологически исключенного ХЭ.
Критерии невключения в основную и контрольную группы: наличие у женщин абсолютных форм бесплодия, аномалий развития гениталий, миомы матки малых размеров, аденомиоза.
Исследование проведено в соответствии с научными и этическими принципами, одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздрава России. Всем пациенткам до начала исследования была предоставлена письменная информация о его проведении, разъяснены суть исследования и связанный с участием в нем риск для здоровья. Перед началом исследования каждая пациентка подписывала форму информированного согласия (с указанием даты), подтверждающую ее добровольное участие. Подпись участницы заверялась подписью исследователя.
Всем пациенткам на момент госпитализации в рамках прегравидарной подготовки проводилась стандартная комплексная диагностика в соответствии с современными рекомендациями и дополнительным сравнительным анализом показателей ПОЛ, С-реактивного белка (СРБ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), суммарного содержания нитратов и нитритов (NOx) в периферической крови и МК на 2-й день менструального цикла.
Образцы венозной крови в объеме 5 мл брали с помощью стандартной методики — венепункцией. Образцы МК в объеме 5 мл брали с использованием индивидуальной менструальной чаши.
Биохимические методы для оценки ПОЛ сводились к определению следующего: 1) уровня конечного продукта ПОЛ — МДА методом K. Jagi (1968), основанным на образовании триметинового комплекса МДА с 2-тиобарбитуровой кислотой с оценкой на спектрофотометре Solar SM 2203 (длина волны 532 нм); 2) ПОЛ биохемилюминесцентным методом — БХЛ (Кузьмина, 1983) с помощью биохемилюминометра БХЛ‐07 ( «Медозон», Нижний Новгород, Россия). Для оценки БХЛ-методом наиболее информативны следующие показатели: Imax — максимальная интенсивность — отражает потенциальную способность биологического объекта к свободнорадикальному окислению (СРО), мВ; S — светосумма — указывает на содержание радикалов, соответствующих обрыву цепи свободнорадикального окисления, мВ×с; SImax — светосумма после максимального значения хемилюминесценции; Z — нормированная светосумма (S/Imax), с; α — относительная светосумма — S/(Imax×t); tg2ά — антиоксидантный потенциал — показатель антиоксидантной активности в исследуемой пробе, мВ/с. Содержания СРБ определяли с использованием автоматизированного метода иммунотурбидиметрии с использованием реактивов BioSystems в надосадочной жидкости после центрифугирования МВ и в сыворотке периферической крови (длина волны 536 нм). Концентрацию ЛДГ — маркера степени клеточной деструкции — в надосадочной жидкости после центрифугирования МВ и в сыворотке периферической крови определяли с помощью стандартной методики — реакции окисления лактата до пирувата, происходящей с восстановлением НАД+ до НАДН, увеличение которого прямо пропорционально активности фермента в пробе (длина волны 340 нм). Исследование данных показателей проводили на анализаторах Beckman Coulter серии AU. Определение NOx проводили спектрофотометрическим методом K. Miranda (2001) с использованием прибора Solar СМ 2203 (длина волны 532 нм) путем восстановления нитратов в нитриты с помощью хлорида ванадия (III) и дальнейшего их окрашивания реактивом Грисса (N-(1-нафтил) этилендиаминдегидрохлорид и сульфаниламид).
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 13.0, Microsoft Office 2010. Достоверность различий между показателями в группах определяли по критерию χ2 Пирсона или двустороннему точечному критерию Фишера, с помощью критериев Манна—Уитни, и считали различия статистически значимыми при p<0,05. Результаты представлены в виде медианы с указанием 25-го и 75-го перцентилей — Me [25-й П; 75-й П].
Результаты и обсуждение
При сравнительном анализе показателей ПОЛ в сыворотке периферической крови не выявлено существенных различий между обследуемыми группами (таблица). При анализе показателей интенсивности ПОЛ в МК выявлено изменение некоторых параметров хемилюминесценции: увеличение S (p=0,002) и снижение tg2ά (p=0,002) как следствие активации процессов ПОЛ и снижения АОСЗ при ХЭ. При этом следует отметить, что параметры S были статистически значимо различны в периферической и менструальной крови во всех изучаемых группах.
Содержание показателей ПОЛ, ЛДГ, СРБ, NOx в периферической и менструальной крови обследованных женщин
| Показатель | Контрольная группа, n=30 Me [25-й П; 75-й П] | Основная группа, n=90 Me [25-й П; 75-й П] | ||
| периферическая кровь | менструальная кровь | периферическая кровь | менструальная кровь | |
| Imax, мВ | 103 [91; 112] | 111 [93; 121] | 107 [94,5; 117] | 110 [84; 142] |
| S, мВ·с | 955 [861; 1086] | 1097 [891; 1477] p1=0,03 | 974,5 [830; 1153] | 1383 [701; 1202] p=0,002 p1=0,000 |
| SImax, мВ·с | 880 [796; 1018] | 1016 [809; 1398] | 900 [767; 1088] | 1005 [820; 1104] |
| α | 0,26 [0,17; 0,33] | 0,27 [0,17; 0,36] | 0,25 [0,2; 0,29] | 0,24 [0,18; 0,32] |
| Z, с | 9,6 [8,2; 10,8] | 9,76 [8,3; 12,4] | 9,7 [8,5; 11,5] | 9,98 [7,95; 11,64] |
| ZImax | 8,7 [7,7; 10] | 9,03[7,8; 11,7] | 8,6 [7,5; 9,8] | 9,2 [8,1; 10,1] |
| tg2ά, мВ/с | 27 [22,5; 34,5] | 25,5 [16,5; 34,5] | 27,8 [24; 34,5] | 19,5 [16,5; 22,5] p=0,002 p1=0,0001 |
| МДА, нмоль/мл | 3,1 [2,7; 3,8] | 4,3 [3,4; 4,8] | 3,63 [3; 4,4] | 7,53 [5,7; 9,9] p=0,0001 p1=0,0001 |
| СРБ, мг/л | 1,28 [0,7; 1,5] | 0,26 [0; 0,58] p1=0,03 | 1,92 [0,57; 11,04] | 1,45 [0,4; 9,2] p=0,0001 |
| ЛДГ, мг/л | 191,2 [158,5; 228,3] | 1847,2 [855,2; 2324,7] p1=0,000 | 185,1 [153,6; 229,7] | 4778,5 [2284,6; 6284] p=0,0001 p1=0,0001 |
| NOx, мкмоль/л | 16,8 [7,1; 27,6] | 33,1 [17,6; 45,3] p1=0,004 | 16,8 [10,1; 21,5] | 33,3 [23; 47] p1=0,0001 |
Примечание. p — статистически значимые различия показателей основной и контрольной групп по критерию Манна—Уитни; p1 — статистически значимые различия показателей периферической и менструальной крови по критерию Манна—Уитни.
Содержание МДА — конечного продукта ПОЛ — в сыворотке периферической крови в основной группе до лечения статистически значимо не отличалось от аналогичного параметра контрольной группы (p>0,05; см. таблицу). При сравнительном анализе МДА отмечено увеличение его содержания в МК у женщин с ХЭ и бесплодием в отличие от такового в контрольной группе. Так, в контрольной группе индивидуальные уровни этого маркера колебались от 1,81 до 6,94 нмоль/мл с медианой 4,3 [3,4; 4,8] нмоль/мл, а у пациенток с ХЭ и бесплодием — от 4,34 до 19,43 нмоль/мл с медианой 7,53 [5,7; 9,9] нмоль/мл (p=0,0001).
При сравнительном анализе содержания СРБ выявлены следующие особенности (см. таблицу): у 34 (37,8%) пациенток основной группы уровни СРБ в периферической крови превышали нормативные параметры. Содержание СРБ в МК в основной группе было выше, чем в контрольной группе. Индивидуальные показатели колебались от 0 до 1,8 мг/л с медианой 0,26 [0; 0,58] мг/л (контрольная группа), а у женщин с ХЭ и бесплодием — от 0,04 до 89,27 мг/л с медианой 1,45 [0,4; 9,2] мг/л (p=0,0001).
Анализ количественного содержания ЛДГ (маркера клеточной деструкции в условиях гипоксии) в изучаемых биологических жидкостях показал существенную разницу между показателями сыворотки периферической крови и МВ как внутри групп, так и между группами. Так, содержание ЛДГ в МК в отличие от периферической крови было в 10 раз больше в контрольной группе (p=0,0001) и в 25 раз больше в группе с ХЭ (p=0,0001; см. таблицу). В контрольной группе в периферической крови индивидуальные колебания уровня ЛДГ составили от 107,2 до 299,9 мг/л с медианой 191,2 [158,5; 228,3] мг/л, у пациенток с ХЭ и бесплодием — от 113,5 до 556,8 мг/л с медианой 185,1 [153,6; 229,7] мг/л. В 16 (17,8%) наблюдениях показатели основной группы превышали максимальный показатель контрольной группы. В контрольной группе индивидуальные колебания уровней ЛДГ в МК составили от 527,3 до 3202,1 мг/л с медианой 1847,2 [855,2; 2324,7] мг/л, а у женщин с ХЭ и бесплодием — от 589,6 до 10767,4 мг/л с медианой 4778,5 [2284,6; 6284] мг/л (p=0,0001).
Оценивая суммарное содержание нитритов NOx, мы установили, что внутри обследуемых групп их содержание в МК и сыворотке периферической крови статистически значимо различалось (p<0,05; см. таблицу). При этом, сравнивая данные основной и контрольной групп между собой, различий выявить не удалось. Индивидуальные показатели NOx в сыворотке периферической крови в контрольной группе колебались в пределах от 0 до 84,9 мкмоль/л, тогда как в основной группе — от 0 до 100,4 мкмоль/л и лишь в 2,3% наблюдений показатели основной группы превышали максимальный показатель контрольной группы. В то время как в МК индивидуальные показатели нитритов в контрольной группе колебались в пределах от 1,8 до 77,1 мкмоль/л, то в основной группе — от 2,7 до 151,1 мкмоль/л. Причем в 10,8% наблюдений показатели основной группы превышали максимальный показатель контрольной группы.
Таким образом, при ХЭ у женщин с бесплодием биохимические параметры на локальном уровне, а именно в МК, по сравнению с таковыми сыворотки периферической крови реагируют более чувствительно изменением своего количественного содержания.
Общепризнано, что универсальным механизмом развития всех патологических процессов, в том числе воспалительных заболеваний органов малого таза, является окислительный стресс [13]. С точки зрения нормальной физиологии, ПОЛ — необходимый процесс для образования стероидных гормонов, медиаторов воспаления, цитокинов и тробоксанов. Однако, когда количество продуктов обмена указанных химических реакций превышает максимально допустимое значение, продукты ПОЛ повреждают органеллы клетки, нарушают синтез ДНК и белков. Для предотвращения этого в действие вступает АОСЗ, снижающая количество свободных радикалов кислорода. Если АОСЗ не успевает утилизировать метаболические продукты ПОЛ с необходимой скоростью, то они начинают накапливаться в тканях и выступать в роли эндогенных токсинов. Окислительный стресс возникает в случаях нарушения баланса между избыточной продукцией активных форм кислорода и АОЗ, приводя к нарушению функции и гибели клеток [19, 20].
В мировой научной литературе имеются результаты исследований, подтверждающие, что у больных с очагами хронического воспаления процессы ПОЛ значительно усилены и приводят к развитию окислительного стресса. Причем эта чрезмерная активация наблюдается как в фазу ремиссии, так и в фазу обострения, и ведет к накоплению в организме конечного продукта ПОЛ — МДА [21].
Одним из классических проявлений воспалительного процесса служит менструация, сопровождающаяся повышением концентрации простагландинов, цитокинов, фактора некроза опухоли альфа в эндометрии [10], при избыточности выработки этих провоспалительных субстанций развивается ХЭ. Об избыточности воспалительной реакции в нашем исследовании свидетельствует повышенное содержание СРБ в МК у женщин с ХЭ в отличие от такового в контрольной группе (см. таблицу). Повышение содержания МДА с учетом данных предыдущих исследований [21], также может быть связано с усиленным воспалительным ответом. При этом повышение содержания МДА может быть связано и с угнетением АОСЗ. Считается, что наиболее важными параметрами АОСЗ являются следующие: S — светосумма за 30 с — в относительной степени отражает содержание радикалов, соответствующих обрыву цепи свободнорадикального окисления; эта величина обратно пропорциональна антиоксидантной активности пробы; tg2ά — параметр, характеризующий скорость спада процессов ПОЛ, который обратно пропорционален активности АОСЗ [12]. В нашем исследовании мы проследили тенденцию увеличения S и снижения tg2ά на локальном уровне как следствие ускорения процессов ПОЛ и угнетения АОСЗ при ХЭ.
Проведенные ранее исследования доказывают взаимосвязь системы гемостаза и свободнорадикальных процессов. Регулярный контакт токсина с мембранами тромбоцитов приводит не только к увеличению содержания МДА и других липоперекисей, но и ускоряет синтез тромбоксана с последующим нарушением микроциркуляции и развитием тканевой гипоксии за счет сужения сосудов и активации агрегации тромбоцитов [22]. Реакция нитритов в нашем исследовании указывает на отсутствие компенсаторной вазодилатации сосудистого компонента эндометрия при ХЭ.
Известно, что на определенном этапе гипоксии, развивающейся в тканях, энергетический дефицит становится причиной дополнительного повреждения клеточных мембран [23]. При ХЭ избыточный воспалительный ответ протекает с интенсификацией ПОЛ и сопровождается деструкцией клеток без регенерации эндометрия, что подтверждается высоким содержанием ЛДГ на локальном уровне.
Заключение
Таким образом, выявленные изменения в изученных биохимических параметрах подтверждают нарушение равновесия между ПОЛ и АОСЗ на локальном уровне, а именно в МК у женщин с ХЭ и бесплодием, что свидетельствует о выраженной активации перекисного стресса. В свою очередь, это может быть причиной нарушений васкуляризации и регенерации эндометрия, требующих коррекции путем добавления в традиционные схемы терапии средств для купирования избыточной липопероксидации.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — А.М. Герасимов, Д.В. Смирнова
Сбор и обработка материала — Д.В. Смирнова, А.М. Герасимов, Т.В. Вертелецкая, Н.В. Васильева
Статистическая обработка — Д.В. Смирнова, Л.В. Кулида
Написание текста — А.М. Герасимов, Д.В. Смирнова, Л.В. Кулида
Редактирование — А.И. Малышкина, А.М. Герасимов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of the authors:
Concept and design of the study — A.M. Gerasimov, D.V. Smirnova
Data collection and processing — D.V. Smirnova, A.M. Gerasimov, T.V. Verteletskaya, N.V. Vasil’eva
Statistical processing of the data — D.V. Smirnova, L.V. Kulida
Text writing — A.M. Gerasimov, D.V. Smirnova, L.V.Kulida
Editing — A.M. Gerasimov, A.I. Malyshkina
Authors declare lack of the conflicts of interests.