Введение

Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) с сохраненной фракцией выброса (ФВ) левого желудочка (ЛЖ) (далее — ХСН-сФВ) признана синдромом, имеющим разнообразную этиологию и множество патогенетических механизмов, которые вносят вклад в гетерогенность этого состояния. ХСН-сФВ ответственна за ¹/₂ случаев сердечной недостаточности (СН) в развитых странах [1]. Прогнозируется рост распространенности ХСН-сФВ по мере улучшения качества диагностики, увеличения продолжительности жизни и распространенности ожирения, сахарного диабета (СД), артериальной гипертонии (АГ) и фибрилляции предсердий (ФП) [1]. Патологические процессы, происходящие в рамках ХСН-сФВ, приводят к развитию диастолической дисфункции ЛЖ. На более фундаментальном уровне это выражается в патологической гипертрофии, повышении ригидности кардиомиоцитов и интерстициальном фиброзе [2]. По данным анализа аутопсийного материала пациентов с ХСН-сФВ фиброз миокарда был определен как одно из ключевых патологических изменений при этом синдроме [3]. С другой стороны, в соответствии с новой концепцией развития ХСН-сФВ [4], детально описана роль системного вялотекущего воспаления, которое имеет истоки в комплексе коморбидностей в случае ХСН-сФВ. Коморбидности являются источником воспаления эндотелия коронарных микрососудов, одним из итогов которого признана субэндотелиальная миграция лейкоцитов с последующей активацией фибробластов с накоплением коллагена в миокардиальном внеклеточном матриксе [4]. Совокупность этих процессов способствует активации комплекса молекулярных путей, участвующих в прогрессировании фиброза миокарда и его ригидности в фазу расслабления. Диагностика ХСН-сФВ основана в большей степени на оценке клинической картины и параметров эхокардиографии (ЭхоКГ). Однако магнитно-резонансная томография (МРТ) признана золотым стандартом для большинства параметров визуализации, которые составляют основу оценки ХСН-сФВ [5]. При ХСН-сФВ для паттерна фиброза типичен диффузный интерстициальный характер, что создает ограничения для оценки с применением гадолиния. В свою очередь, контрастирование гадолинием в ходе Т1-картирования в рамках МРТ обеспечивает оценку объема внеклеточного матрикса (ECV) — суррогатного маркера диффузного фиброза миокарда, который получил гистологическую валидацию [6]. Оценка ECV миокарда у пациентов с ХСН-сФВ и группы контроля позволила сделать заключение о наличии более высоких значений этого показателя в основной группе [7].

К настоящему времени накоплены научные данные, которые свидетельствуют о роли состава кишечной микробиоты (КМ) и ее метаболитов — короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) и триметиламин-N-оксида — в развитии и прогрессировании ХСН [8]. Однако до сих пор фокус научных работ был сосредоточен на изучении преимущественно ХСН с низкой ФВ ЛЖ (ХСН-нФВ), в то время как группа ХСН-сФВ либо отсутствовала, либо не изучалась отдельно [9]. Стоит отметить, что изменения КМ в группе больных с ХСН не ограничиваются только дисбиозом. Гипотеза о роли КМ в развитии ХСН основана на том, что возникающая на фоне снижения перфузии кишечника ишемия ворсинок энтероцитов приводит к их повреждению и, как следствие, нарушению целостности кишечного барьера [10]. Итогом этого становится увеличение интенсивности транслокации бактерий кишечника и их компонентов, например, липополисахарида (ЛПС) в системный кровоток. ЛПС, в свою очередь, является провоспалительным агентом и, связываясь с Toll-подобными рецепторами 4-го типа, способствует активации сигнального пути, приводящего к экспрессии воспалительных молекул [11]. Примечательно, что указанный эффект реализуется в том числе в таких клетках, как макрофаги, дендритные клетки, кардиомиоциты и фибробласты сердца [12], находясь у истоков фиброза миокарда.

Можно предположить, что одним из объединяющих звеньев между патогенезом ХСН-сФВ и дисбиозом кишечника является системное вялотекущее воспаление, которое, согласно описанным данным, вносит вклад в развитие фиброза миокарда.

Цель настоящего исследования — оценка связи между составом КМ на уровне родов с объемом внеклеточного матрикса, оцененного в ходе Т1-картирования миокарда, у пациентов с ХСН-сФВ.

Материал и методы

В группу исследования вошли 42 пациента в возрасте 18—79 лет (67,0 [64,0; 71,5] года) с доказанной ХСН-сФВ. Диагностику ХСН-сФВ осуществляли на основании рекомендаций Европейского кардиологического общества по диагностике и лечению острой и хронической сердечной недостаточности (2016) [13]. В работу были включены пациенты, имеющие симптомы и клинические признаки ХСН, ФВ ЛЖ ≥50% по данным ЭхоКГ, признаки диастолической дисфункции ЛЖ, а также уровень N-концевого предшественника мозгового натрийуретического пептида (NT-proBNP) более 125 пг/мл. Среди критериев невключения были: возраст моложе 18 и старше 79 лет, индекс массы тела (ИМТ) 35 мг/м² и более, скорость клубочковой фильтрации (СКФ) менее 30 мл/мин/1,73 м² (по формуле CKD-EPI), аллергическая реакция на гадолинийсодержащие контрастные вещества в анамнезе, СД, курение или отказ от курения до 10 лет назад, хроническая обструктивная болезнь легких средней, тяжелой и крайне тяжелой степени тяжести, бронхиальная астма тяжелой и среднетяжелой степени тяжести по данным анамнеза, диагностированные кардиомиопатии, радиационное или лекарственное поражение сердца, констриктивный перикардит, признаки нарушения локальной сократимости миокарда при ЭхоКГ, постоянная форма ФП, системные заболевания соединительной ткани, онкологические заболевания без радикального излечения, перенесенные острые инфекционные заболевания или обострение хронических в течение 2 нед до включения в исследование, беременность и период лактации, воспалительные заболевания кишечника, а также прием антимикробных или пробиотических препаратов в течение последних 3 мес. Исследование прошло процедуру оценки и было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины» Минздрава России (07.06.18). Пациенты были осведомлены о целях и процедуре настоящего исследования и подписали добровольное информированное согласие.

Всем пациентам проводили анализ электрокардиографии в 12 отведениях, ЭхоКГ с допплерографией, определение уровня NT-proBNP натощак методом иммуноферментного анализа с применением реактива компании «Вектор-Бест» (Россия) и фотометра Multiscan FC (Termofisher Scientific, США). Кроме того, оценивали выраженность ХСН в ходе теста 6-минутной ходьбы по стандартной методике [14] и с помощью анкеты Шкала оценки клинического состояния пациента с ХСН (ШОКС) [15]. Согласно протоколу исследования пациентам выдавали стерильные контейнеры для сбора кала, проводили объяснение процедуры сбора кала и детали его хранения. Накануне сбора кала участникам было рекомендовано исключить прием алкоголя, интенсивные физические нагрузки, изменения в питании, использование слабительных и ректальных свечей. После совершения дефекации контейнер с калом транспортировали в холодильной камере при температуре до +8 °C в течение не более 2 ч до лаборатории, в которой осуществляли пробоподготовку, выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и подготовку библиотек секвенирования. Использовали метод селективного захвата регионов V3-V4 гена 16S рибосомальной рибонуклеиновой кислоты (рРНК) бактерий. Амплификацию фрагментов вариабельных регионов V3-V4 гена 16S рРНК проводили с применением универсальных праймеров. Анализ V3-V4 региона 16S рРНК КМ осуществляли на секвенаторе Illumina MiSeq методом парно-концевого чтения с суммарным покрытием не менее 10 000 пар ридов на образец. Фильтрацию ридов и классификацию таксонов проводили при помощи программного комплекса QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology). В итоге классификации было получено число ридов, пришедшихся на операционные таксономические единицы. Этот метод позволяет оценить структуру микробного сообщества, что может быть использовано для изучения ассоциаций относительной представленности бактерий с ECV. Результат секвенирования 16S рРНК КМ включает процентное описание в каждом образце кала относительной представленности таксонов разного уровня (тип, класс, порядок, семейство и т.д.).

Перед проведением МРТ сердца с гадолинием для получения результатов Т1-картирования всеми пациентами было подписано информированное согласие, в том числе на введение гадолинийсодержащего контраста. Исследование проводили с применением магнитно-резонансного томографа General Electric Optima MR 450w GEM, напряжение магнитного поля составляло 1,5 Тл, использовали поверхностную кардиальную принимающую 32-канальную катушку. Исследование сердца было выполнено согласно стандартной программе функционального и морфологического исследования до и после раннего и отсроченного контрастного усиления. С целью контрастирования применяли пентауксусный гадолиний-диэтилентриамин 1:70 кислоты (Gd-DTPA) в дозировке 0,3 мл/кг массы тела пациента. Картирование миокарда проводили по методике получения изображения 2D MOLLI (3-3-5) толщина среза составила 18 мм по короткой оси, через базальный, средний и апикальный сегменты. Ход исследования был следующим: после серии обзорного и аксиального сканирования грудной клетки выполняли серию функционального исследования Fiesta-CINE в стандартных осях, далее — серию нативного Т1 картирования, введение контрастирующего препарата, серии Т1 PS MDE (phase sensitive myocardial delayed enhancement) по длинной 2-камерной и 4-камерной осям, затем — функциональную серию изображений 2 камер по короткой оси. На 10-й минуте от введения контрастного препарата была получена серия отсроченных постконтрастных изображений по методике T1 PS MDE по короткой 2-камерной оси. На 18—20-й минуте после введения контрастного препарата проводили серию отсроченного постконтрастного картирования. Расчет результатов картирования был осуществлен в полуавтоматическом режиме выделения миокарда, коррекции смещения от движения, расчета ECV с коррекцией результатов по значению гематокрита в программе CVI42 (Circle Cardiovascular Imaging Inc. Calgary, Canada). Время получения отсроченных T1-MOLLI-изображений составляло не менее 20 мин от момента введения контрастного препарата.

Статистическая обработка проведена с помощью языка программирования Python v3.8. Для количественных показателей определяли характер распределения (с помощью теста Шапиро—Уилка), среднее значение, стандартное отклонение, медиану, интерквартильный размах [25-й процентиль; 75-й процентиль], 95% доверительный интервал, минимальное и максимальное значения. Для категориальных и качественных признаков определяли долю и абсолютное количество значений. При нормальном распределении признака вычисляли среднее и стандартное отклонение, (результаты представлены как M±SD). Для количественных признаков, распределение которых не соответствовало нормальному, вычисляли медиану и интерквартильный размах (результаты представлены как Me [25%; 75%]). Для оценки связи факторов между собой использовали корреляционный анализ по Спирмену с определением коэффициента rho и его значимости. Кроме того, проводили многомерный регрессионный анализ. Уровень значимости для вышеупомянутых статистических методов — p<0,05.

Результаты

Возраст пациентов в изучаемой популяции составил 67,0 [64,0; 71,5] года, доля мужчин — 57,1%, ИМТ — 30,2 [26,7; 33,3] кг/м². Все пациенты имели анамнез длительной АГ и клинические признаки ХСН: одышку при физической нагрузке (100% больных), пастозность или отеки нижних конечностей (35,7%), перебои в работе сердца (38,1%). Проявления СН у этих пациентов имели в основном легкую степень тяжести: из них 69,05% относились к I функциональному классу (ФК) ХСН, 30,95% — ко II ФК ХСН. Результат теста 6-минутной ходьбы среди пациентов составил 434,5 [417,0; 441,0] м, оценка по ШОКС — 3,0 [2,0; 3,0]. Основными группами препаратов, которые принимали пациенты с ХСН-сФВ, являлись: β-адреноблокаторы (90,5%), мочегонные (83,3%), статины (54,7%), антагонисты рецепторов ангиотензина II (42,8%), ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (52,4%) и антикоагулянты (40,5%). Среднее значение СКФ у обследованных составило 76,9±12,9 мл/мин/1,73 м². У пациентов отсутствовали имплантированные устройства и чрескожное коронарное вмешательство в анамнезе. ФП была диагностирована у 47,6% больных, в то время как катетерная абляция ФП в анамнезе отмечалась в 21,4% случаев. Значения систолического и диастолического артериального давления (АД) составили 143,6±13,7 и 90,0 [80,0; 90,0] мм рт.ст. соответственно. Диастолическую функцию ЛЖ пациентов с ХСН-сФВ определяли посредством оценки пика E (максимальной скорости потока в фазу раннего наполнения), среднее значение которого составило 76,2±13,6, максимальной скорости движения фиброзного кольца митрального клапана в раннюю диастолу (e’), которая имела значение 5,7±1,1 см/с, и их отношения E/e’, которое составило 13,0 [13,0; 14,0]. Медиана и интерквартильный размах для NT-proBNP в сыворотке крови пациентов с ХСН-сФВ составили 178,0 [136,0; 295,0] пг/мл. По результатам секвенирования 16S рРНК наиболее широко представленными в выборке пациентов оказались типы Firmicutes (48,7±22,2%), Bacteroidetes (47,4±22,6%) и Proteobacteria (1,5% [0,5%; 2,5%]). По результатам Т1-картирования среднее значение ECV было равным 31,0±4,3%.

Результаты корреляционного анализа выявили, что низкая относительная представленность Blautia (p=0,005), Faecalibacterium (p=0,024) и Lachnoclostridium (p=0,037) соответствовала большей выраженности фиброза миокарда, оцененного на основании показателя ECV. С другой стороны, при увеличении представленности родов Holdemania (p=0,009), Victivallis (p=0,012), Dehalobacterium (p=0,014), Enterococcus (p=0,032), Catabacter (p=0,037) и неклассифицированных родов семейств Mogibacteriaceae (p=0,005) и Peptostreptococcaceae (p=0,044) наблюдалось увеличение ECV. Статистическая значимость и размер эффекта представлены в табл. 1. По результатам многомерного регрессионного анализа скорректированный коэффициент детерминации составил 0,411. Это свидетельствует о том, что набор факторов, перечисленных в уравнении регрессии, объясняет 41,1% распределения значений ECV. Среди всех таксономических единиц только относительная представленность рода Butyricimonas имела прямую связь со значением ECV (нормализованный коэффициент 0,416) (табл. 2). Относительное обилие перечисленных родов бактерий представлено в табл. 3.

Таблица 1. Корреляционные связи родов кишечной микробиоты и объема внеклеточного матрикса

Таблица 2. Результаты многомерного регрессионного анализа связи относительной представленности бактерий кишечника с объемом внеклеточного матрикса

Таблица 3. Относительная представленность родов бактерий, продемонстрировавших статистически значимую связь с объемом внеклеточного матрикса

Примечание. *Максимальное значение относительной представленности для Holdemania составило 0,1%, для Victivallis — 0,5%, для Dehalobacterium — 0,1%, для Enterococcus — 0,2%, для Peptostreptococcaceae, неопределенный — 5,7%, для Mogibacteriaceae, неопределенный — 0,5%.

Обсуждение

В проведенном исследовании использовали ECV с целью оценки диффузного фиброза миокарда при ХСН-сФВ. К настоящему времени ввиду отсутствия широкого распространения метода Т1-картирования были предприняты немногочисленные попытки оценки ECV. В исследовании M. Su и соавт. [16] среднее значение ECV для пациентов ХСН-сФВ составило 28,9%, в то время как в группе контроля этот показатель был равен 27,9%. В другой работе значение ECV пациентов с доказанной ХСН-сФВ составило 29±4% (в группе контроля 25±3%) и при этом положительно коррелировало с отношением E/A, давлением в правом предсердии, уровнем NT-proBNP и отрицательно — с дистанцией, пройденной в тесте 6-минутной ходьбы [17]. Исходя из полученных в настоящем исследовании данных ECV, пациенты группы исследования имели более выраженный интерстициальный фиброз миокарда, чем лица в упомянутых работах.

Проведенный в настоящей работе фундаментальный анализ является первым исследованием ассоциаций между представителями КМ и ECV, который отражает процесс диффузного фиброза миокарда, играющего ключевую роль в патогенезе ХСН-сФВ. Обращает на себя внимание наличие обратной связи между ECV и родами бактерий, известными как продуценты масляной кислоты (Faecalibacterium, Lachnoclostridium и Blautia). Данная КЦЖК представляет интерес в свете влияния на метаболизм колоноцитов, поскольку она обеспечивает до 70% их энергетического обмена, а также в связи с ее ролью в поддержании целостности кишечного барьера посредством регуляции клеточного роста и дифференцировки. Известно свойство бутирата ингибировать гистонодеацетилазу (фермент, уплотняющий структуру ДНК). Подавление активности этого фермента приводит к изменению транскрипции генов таких цитокинов, как интерферон-γ (IFN-γ), фактор некроза опухоли-α (TNF-α), а также к изменению активности сигнального пути ядерного фактора κB (NF-κB). Впоследствии бутират снижает стимулированную ЛПС и цитокинами продукцию воспалительных медиаторов (TNF-α, IFN-γ, интерлейкина (IL) 6), одновременно усиливая секрецию противовоспалительного IL-10 [18]. Выявлена способность бутирата улучшать сердечную функцию и подавлять ремоделирование миокарда (гипертрофию и интерстициальный фиброз) посредством ингибирования активности гистондеацетилазы и повышения экспрессии супероксиддисмутазы-1 [19].

Род Faecalibacterium, представленность которого была обратно связана со значением ECV в группе ХСН-сФВ, представлен единственным видом — F. prausnitzii. Последний признан одним из ключевых продуцентов масляной кислоты в кишечнике и одной из наиболее представленных бактерий в КМ здоровых людей. Противовоспалительные свойства были описаны для F. prausnitzii благодаря ее способности индуцировать толерогенный профиль цитокинов, который заключается в низкой секреции провоспалительных IL-12 и IFN-γ и высокой секреции противовоспалительного IL-10. Бутират также способствовал снижению воспаления на уровне слизистой оболочки кишечника благодаря up-регуляции рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PPARγ). Также была отмечена роль в этом эффекте метаболитов F. prausnitzii, которые улучшают барьерную функцию кишечного эпителия и участвуют в экспрессии белков плотных контактов. Клеточный и бесклеточный супернатант F. prausnitzii продемонстрировал способность снижать уровень острого, хронического и вялотекущего воспаления, что было частично ассоциировано с увеличением продукции регуляторных Т-клеток, а также секрецией метаболитов, блокирующих активацию NF-κB и продукцию IL-8 [20]. M. Luedde и соавт. [9] выявили сниженный уровень Blautia в наблюдении за группой, включаающей 20 пациентов с ХСН-нФВ. Также стало известно, что бо́льшая представленность рода Blautia ассоциирована с уменьшением смертности у пациентов в ситуации «трансплантат против хозяина» [21]. Такие результаты поддерживают потенциально негативную роль низкой представленности рода Blautia в развитии системных воспалительных реакций и фиброза, что также было обнаружено в настоящем исследовании. С другой стороны, в свете описанных данных о влиянии масляной кислоты на кишечный барьер и системное вялотекущее воспаление [22] неожиданной находкой в настоящем исследовании стало обнаружение прямого характера связи между относительной представленностью рода Butyricimonas, продуцирующего бутират, и ECV. К сегодняшнему моменту единственным объяснением подобной связи может быть факт того, что как минимум один из изученных видов данного рода обладает патогенными свойствами (Butyricimonas virosa) [23].

Относительная представленность строгого грамположительного анаэроба Dehalobacterium formicoaceticum, который утилизирует дихлорметан в качестве единственного источника энергии, продемонстрировала прямую связь с выраженностью фиброза миокарда у пациентов с ХСН-сФВ. По данным ряда авторов, воспаление слизистой оболочки кишечника у мышей связано с увеличением представленности Dehalobacterium [24], что может быть одним из механизмов, опосредующих установленную в настоящем исследовании ассоциацию. По другим данным, низкий уровень Dehalobacterium, наряду с Ruminococcus, ассоциирован с повышенной проницаемостью кишечника [25]. Ранее было показано увеличение представленности Holdemania в группе женщин, следующих вегетарианской диете, а также высказано предположение о том, что этот род напрямую ассоциирован с потреблением пищевых волокон и полиненасыщенных жирных кислот и может быть маркером диеты, бедной животным белком [26]. Кроме того, в работе K. Lippert и соавт. [27] представленность Holdemania коррелировала с клиническими показателями нарушений липидного и углеводного обменов. При этом данные исследований в отношении этого рода, схожие с полученными нами результатами о его прямой ассоциации с фиброзом миокарда, в настоящее время отсутствуют.

Данные литературы о родах Victivallis и Catabacter, которые продемонстрировали прямую связь с ECV в настоящем исследовании, очень ограничены, в связи с чем находки в группе пациентов с ХСН-сФВ являются уникальными. Известно, что относительная представленность Victivallis увеличивалась при потреблении устойчивого крахмала и коррелировала со снижением стеатоза печени [28]. Catabacter hongkongensis была впервые изолирована из крови, и информация об этой бактерии в первую очередь сосредоточена на ее роли в развитии сепсиса. Отмечается, что наиболее вероятным источником бактериемии в этих ситуациях являлась КМ [29]. Согласно полученным в настоящем исследовании данным, высокая представленность рода Enterococcus, который относится к продуцентам лактата, связана с бо́льшим значением ECV при ХСН-сФВ. Этот род включает более 15 основных видов бактерий, спектр влияния которых простирается от пробиотического потенциала до патогенных свойств. Энтерококки, входящие в состав нормальной микрофлоры человека, играют важную роль в обеспечении колонизационной резистентности слизистых оболочек. В то же время они являются представителями группы условно-патогенных бактерий, способных вызывать аутоинфекцию. Большинство инфекций, вызываемых энтерококками, носят эндогенный характер и обусловлены инвазией микроорганизмов при избыточной колонизации этими бактериями сайтов прикрепления [30].

Заключение

Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о связи низкого уровня ключевых бактерий-продуцентов масляной кислоты с большим объемом внеклеточного матрикса, отражающего выраженность интерстициального фиброза миокарда. Данные исследования позволяют углубить представления о связи состава КМ с механизмами патогенеза ХСН-сФВ.

Финансирование работы осуществлялось в рамках договора между ФГБУ «НМИЦ ТПМ» Минздрава России и ФГБУ «ЦСП» ФМБА России.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — А.Н. Кабурова, О.М. Драпкина, С.М. Юдин, В.В. Макаров, С.А. Краевой; оценка микробиоты кишечника — С.М. Юдин, В.В. Макаров, С.А. Краевой; проведение Т1-картирования — А.С. Абраменко, М.В. Вишнякова; сбор материала и статистическая обработка данных — А.Н. Кабурова, И.А. Ефимова, А.С. Абраменко, М.С. Покровская, С.Н. Корецкий, Б.Б. Шойбонов; написание текста — А.Н. Кабурова; редактирование — О.М. Драпкина, М.С. Покровская, Б.Б. Шойбонов, М.В. Вишнякова.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors declare no conflict of interest.