Актуальной проблемой акушерства и гинекологии является привычное невынашивание беременности (ПНБ) — 15—50% наблюдений [1—5]. В ранние сроки беременности до 12-й недели происходит более 80% репродуктивных потерь. Среди самопроизвольных абортов в ранние сроки привычные потери беременности составляют от 5 до 20% [1, 6]. Согласно данным литературы [7], недифференцированная дисплазия соединительной ткани (НДСТ) диагностируется в 80% случаев среди лиц молодого возраста. При тщательном отборе пациентов с 6 признаками НДСТ и более показатель уменьшается до 20—25% с одновременным увеличением клинической значимости аномалий [8].

ДСТ относят [1, 6] к одной из причин ПНБ. Считают, что с НДСТ связано не только привычное невынашивание беременности, но и другие ее осложнения [9—12]. Подтверждена негативная роль НДСТ в формировании истмико-цервикальной недостаточности, несостоятельности рубца на матке, инициации недонашивания беременности, аномалий родовой деятельности, преждевременного разрыва плодных оболочек, задержки роста плода и др. [10, 13—16]. Роль НДСТ в прерывании беременности ранних сроков и влияние ее на формирование осложнений и отдаленных последствий отражено в ограниченном количестве фрагментарных публикаций [5, 17, 18].

Известно значение ферментов, контролируемых гормонами, в процессах имплантации и плацентации [17, 19]. Благодаря фибринолизу в эндометрии не формируются внутриматочные тромбы, адгезия и синехии. Действие эстрогенов, стимулирующих фибринолиз, противоположно действию прогестерона, повышающего концентрацию ингибиторов и подавляющему процесс [20]. Исследовано влияние факторов роста, воспаления, эндокринных факторов и иммунного статуса на эндометрий при физиологической беременности и ее невынашивании [21—23].

В научной литературе отсутствуют сведения о структуре и функции эндометрия у женщин с ПНБ в ранние сроки. Особенности ферментативной активности эндометрия у пациенток с НДСТ и влияние этой патологии на исходы беременности в ранние сроки находятся на начальных этапах изучения.

Цель исследования — изучение структурных и функциональных изменений в эндометрии и выявление новых механизмов патогенеза привычного невынашивания беременности ранних сроков у женщин с недифференцированной дисплазией соединительной ткани.

В гинекологических отделениях клиники ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова» однократно были обследованы 160 пациенток. В 1-ю (основная) группу были включены 73 пациентки с ПНБ ранних сроков и НДСТ, во 2-ю группу (группа сравнения) — 57 пациенток с ПНБ без НДСТ; контрольную группу составили 30 здоровых женщин без НДСТ и репродуктивных потерь в анамнезе. Степень НДСТ определяли по классификации Т. Милковской-Димитровой и А. Каркашева (1987). Дополнительно выявляли стигмы дисэмбриогенеза костной, соединительной и мышечной тканей. В основную группу включали пациенток с 4 признаками НДСТ и более или с повреждением двух систем и более.

Материалом для исследования служили биоптаты эндометрия и периферическая венозная кровь, в которой стандартным лабораторным методом определена фибринолитическая активность (ФА). В биоптатах эндометрия ФА выявлена методом фибриновых пластинок [24, 25].

Эндометрий, взятый методом пайпель-биопсии на 23—26-й день менструального цикла, изучали с использованием морфологических обзорных (окраска гематоксилином и эозином), элективных — PAS-реакция (реакция с перйодной кислотой с помощью реактива Шиффа), а также иммуногистохимических и электронно-микроскопических методик. Нативный материал фиксировали в 10% нейтральном и забуференном растворах формалина, фиксаторе Караганова, осуществляли последовательные стандартные операции проводки и заключения материала в среды, готовили срезы от 4—5 мкм до ультратонких, окрашивали красителями и изучали в оптическом микроскопе при различных увеличениях. Исследовали изменения структур эндометрия в ультратонких срезах в электронном микроскопе ТЭМ-ЭВМ-100АК, в полутонких, окрашенных метиленом-азур II-фуксином, в светооптическом микроскопе.

Для идентификации коллагеновых волокон в базальных мембранах и для оценки ферментативной активности соединительной ткани имуногистохимическими (ИГХ) методами изучали экспрессию коллагена IV (COLL-IV), матричной металлопротеиназы-9 (ММР-9), тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 (TIMP-1) и виментина с демаскировкой в парафиновых срезах антигена и блокировкой эндогенной пероксидазы 1% раствором перекиси водорода. В качестве первичных антител использовали моноклональные мышиные антитела к TIMP-1 (anti-TIMP-1, клон VT7, Dako, рабочее разведение 1:50), к виментину (anti-Vimentin, клон Vim 3B4, Dako, рабочее разведение 1:100), к COLL-IV (anti-CollagenIV, клон CIV 22, Dako, рабочее разведение 1:40). Согласно протоколу производителя, комплексыантиген—антитело визуализировали стрептавидин-биотин-пероксидазным методом, используя систему детекции. Контроль неспецифического окрашивания осуществляли замещением первичных антител 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина с исключением вторичных антител. Результаты ИГХ-реакции оценивали полуколичественным способом в 100 клетках, в 10 полях зрения микроскопа при увеличении 400. Индекс экспрессии (ИЭ) факторов рассчитывали по формуле: ИЭ =ΣP (i)∙i/100, где i — интенсивность окрашивания в баллах от 0 до 3; Р (i) — процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью, и выражали в условных единицах (усл. ед).

Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных лицензионных программ Statistica 6.0, Microsoft Office 2007, GenStat и Open Epi и расчетом достоверности по критериям t-Стьюдента, Колмогорова—Смирнова и Вилкоксона—Манна—Уитни. С целью оценки клинической значимости биохимических и морфологических показателей использовали программу MedCalk с созданием интерактивных диаграмм и проведением ROC-анализа.

Возраст обследованных пациенток варьировал от 18 до 43 лет, средний возраст женщин в группах сопоставим.

У пациенток из 1-й группы основными проявлениями НДСТ являлись деформация позвоночника (71,2%), миопия (57,5%), плоскостопие (53,4%), гиперрастяжимость кожи (34,2%), варикозное расширение вен нижних конечностей (31,5%) и вывихи суставов (30,1%), формирующие в 47,9% случаев легкую, в 42,6% — среднюю и в 9,5% — тяжелую степень НДСТ. Достоверно чаще, чем в контрольной группе и группе сравнения, отмечалось позднее становление менструальной функции (соответственно p<0,01 и p<0,05). Из гинекологической патологии у пациенток чаще диагностированы вторичное бесплодие (р<0,05), хронический эндометрит (p<0,001), в том числе вызванный различными сочетаниями микстинфекции (микоплазма, уреаплазма, хламидии, герпес, цитомегаловирус) (р<0,01) и миома матки (p<0,01).

У беременных основной группы статистически значимо чаще по сравнению с пациентками в контрольной группе и группе сравнения наблюдалась такая экстрагенитальная патология, как артериальная гипертензия (p<0,01), рефлюксная болезнь (p<0,05) и бронхиальная астма (p<0,05). У этих пациенток выявлены отягощенный аллергологический анамнез (p<0,001) и ОРВИ в ранние сроки беременности (p<0,01).

Учитывая значение показателей ФА на ранних этапах беременности, изучены показатели фибринолиза в эндометрии у пациенток. ФА в эндометрии контрольной группы, составившая 47,1 (28,26—63,60) мм², достоверно не отличалась от таковой в группе сравнения 56,5 (28,26—63,60) мм². В основной группе этот параметр был достоверно ниже — 15,7 (32,97—78,10) мм² (p<0,05).

Концентрация магния в эндометрии пациенток контрольной группы составила 0,012 (0,004—0,030) моль/л, что сопоставимо с параметрами в группе сравнения, но существенно меньше, чем у пациенток с ПНБ и НДСТ 0,04 (0,012—0,080) моль/л; p<0,05.

У женщин с ПНБ на фоне НДСТ структуры эндометрия в 89,7% наблюдений не соответствовали его строению на 23—26-й день менструального цикла. Соответствие морфологии эндометрия его структуре на 23—26-й день менструального цикла выявлено только у 10,3% пациенток (p<0,05). Согласно морфологической характеристике, у 24% (р<0,01) пациенток основной группы эндометрий соответствовал средней стадии секреции, у 15,2% — ранней. В 40,5% (р>0,05) эндометрий трансформировался в секреторный под воздействием прогестерона, но с отставанием стадий секреции. Кроме того, у 10% пациенток основной группы диагностирована секреторная недостаточность эндометрия. Структурные изменения проявлялись отставанием трансформации сосудов и клеток стромы, замедлением формирования отека.

В эндометрии у пациенток основной группы существенно отстает трансформация фибробластоподобных клеток стромы в промежуточные формы вплоть до предецидуальных и децидуальных. Замедленная и неполноценная трансформация фибробластоподобных клеток у женщин 1-й группы сопряжена с отставанием структурных изменений железистого компонента. Железы в стадию секреции умеренно были извиты, имели расширенные просветы, что свидетельствует не только о неадекватной реакции рецепторов на половые стероиды, но и о недостаточной секреторной активности железистых клеток.

Исследование материала с помощь трансмиссионной электронной макроскопии (ТЭМ) выявило изменение структуры и соотношения всех компонентов стромы наряду с задержкой последовательной трансформации фибробластоподобных клеток, проявившееся неравномерностью внутриклеточных преобразований. В секреторную стадию цикла ядра клеток стромы, имеющие от одного до нескольких ядрышек, отличались набором хроматина, обеспечивающего вариабельность от гиперхромии до эухроматизации. Трансформация ядер сопровождалась деструкцией органелл, особенно гранулярного ретикулума, с дегрануляцией и фрагментацией его мембран. Промежуточные клетки стромы приобретали различную, порой причудливую форму, за счет многочисленных инвагинатов нуклеолеммы. Прослеживалась четкая тенденция к количественному уменьшению в секреторном эндометрии функционирующих клеток стромы, за счет денуклеитизации и лизиса ядер с последующим некрозом цитоплазмы и ее элиминацией. В сохранившихся стромальных клетках визуализировались либо фрагменты ядерной субстанции, либо скопления органелл. Цитоплазма предецидуальных клеток при некрозе органелл гомогенизировалась, появлялись вакуолеподобные структуры, усиливалось везикулообразование, микроклазматоз и клазматоз^​*​.

Установлено, что в эндометрии у женщин с ПНБ и НДСТ нарушена васкуляризация, обусловленная гипоплазией вертикальных ветвей сосудов с уменьшением их количества в поперечных срезах до одного—двух. Горизонтальные ветви спиральных артерий были в состоянии замедленной спирализации, поскольку формировали мелкие сосудистые скопления не только с количественным уменьшением сосудов в «сосудистых клубках», но и самих «клубков». За счет гипоплазии сосудов и очаговой аплазии стромально-мышечного компонента в стенках артериол сосуды с неравномерной толщиной стенок были дилатированы. В эндотелии капилляров в поверхностных отделах эндометрия в лютеиновую фазу цикла при электронной микроскопии наблюдались кариопикноз, деструкция органелл, плазморексис и/или плазмолизис, завершающиеся некрозом клеток. В связи с нестабильностью мембран эритроциты, контактирующие с сохранившимися уплощенными клетками эндотелия в капиллярах, были аномальной формы. Цитоплазма эндотелия была вакуолизирована, мембраны органелл находились в состоянии клазматоза. Прогрессирующая деструкция эндотелиоцитов капилляров завершалась их редукцией. Периваскулярные клетки стромы подвергались апоптозу.

Отставание трансформации фибробластоподобных клеток стромы эндометрия у пациенток основной группы доказано обзорным и элективным (PAS-реакция) методами исследования. В структурах эндометрия пациенток в стадию секреции выявлено снижение PAS-позитивной активности, свидетельствующее об уменьшении содержания нейтральных мукополисахаридов (НМПС) в базальных мембранах железистого эпителия, сосудов и находящегося в просвете желез секрета. Одновременно количество НМПС увеличивалось в строме. Следовательно, у женщин с НДСТ в эндометрии формируется диспропорция в распределении НМПС, свидетельствующая о нарушениях обменных процессов и влияющая на железистый и стромальный компоненты слизистой оболочки.

Экспрессия COLL-IV как в спиральных артериях, капиллярах, так и в железах эндометрия пациенток основной группы выявлена лишь в 12,5% случаев, что достоверно ниже, чем в контрольной группе и группе сравнения (p<0,01). COLL-IV в виде тонких и прерывистых структур в 50% случаев обнаружен только в стенках спиральных артерий; в 25% наблюдений — только в базальных мембранах железистого эпителия, при этом стенки спиральных артерий и капилляров оставались иммунонегативными. В эндометрии пациенток основной группы в 12,5% наблюдений COLL-IV-позитивные структуры не были обнаружены. Исследованием с помощью ТЭМ установлены не только резкое, вплоть до аплазии, уменьшение коллагеновых волокон в изучаемых структурах, но и их аномальная структура.

В клетках стромы эндометрия у женщин с ПНБ и НДСТ индекс экспрессии MMP-9 составил 280 (260—290) усл. ед. и достоверно превысил таковой в группе с ПНБ без НДСТ 230 (210—260) усл. ед. (p<0,001). Индекс экспрессии TIMP-1 в цитоплазме стромальных клеток, составивший 235 (210—245) усл. ед., у пациенток основной группы статистически значимо отличался от аналогичного показателя пациенток группы сравнения 150 (120—210) усл. ед. (p<0,01). ИЭ TIMP-1 в клетках эндотелия спиральных артерий основной группы превысил 200 (175—210) усл. ед. Параметр был достоверно увеличен при сопоставлении с таковым группы сравнения 140 (110—160) усл. ед. (p<0,01).

С помощью ROC-анализа выявлены изложенные в таблице информативные показатели, предложенные в качестве дополнительных диагностических критериев НДСТ у женщин с ПНБ.

Согласно полученным показателям, а именно ФА эндометрия менее 23,5%, концентрации магния более 0,035 моль/л, экспрессии ММР-9 в стромальных клетках >240,0 усл. ед., экспрессия TIMP-1 в стромальных клетках >200,0 усл. ед. и в эндотелии артериол эндометрия >160,0 усл. ед. у пациенток с ПНБ следует диагностировать НДСТ.

Основную роль в процессах миграции и нидации оплодотворенной яйцеклетки играют факторы адгезии и инвазии, в том числе ФА, свойственная физиологическому эндометрию [20]. Фибринолиз играет важную роль в подготовке эндометрия к нидации бластоцисты, васкуляризации ворсин, секреторной трансформации слизистой оболочки матки [26].

Нарушения фибринолиза приводят к гипообразованию лакун, аномалиям дифференцировки и формирования ворсин, к повышению тромбообразования и неполноценной инвазии цитотрофобласта.

Гипоактивность плазминовой системы при угнетении ФА влияет на формирование сосудов эндометрия, поскольку плазмин, определяющий активность фибринолиза, является одним из основных ангиогенных факторов [27]. Недостаточная активность плазмина приводит к гипоплазии вертикальных артерий и ретардации спирализации горизонтальных сосудов.

Нельзя исключить, что при НДСТ в эндометрии на фоне нарушенного фибринолиза реализуется тромбофилия, влияющая на первую волну инвазии цитотрофобласта, обеспечивающую дальнейшее прогрессирование беременности. Гемореологическая диспропорция в системе гемокоагуляции, обусловленная снижением ФА, способствует прогрессированию обтурирующего тромбоза устьев спиральных артерий [27]. Нарушение процессов фибринолиза, проявляющееся резким снижением ФА, повышенное тромбообразование в зоне имплантации зародыша и формирования плаценты опосредованно через гемореологические нарушения приводят к гибели или экспульсии плодного яйца.

Важным показателем, характеризующим состояние соединительной ткани при НДСТ, является концентрация ионов магния в сыворотке крови. Не случайно многочисленные исследователи отводят основную роль в формировании НДСТ преимущественно дефициту магния в эритроцитах [28, 29].

В акушерско-гинекологической практике с дефицитом магния при НДСТ связывают такие осложнения беременности, как преэклампсия, преждевременное развитие родовой деятельности, плацентарная недостаточность и синдром задержки роста плода [8, 9]. Известна так называемая секвестрация магния в органах и тканях, относящихся к эстрогензависимым (матка, костная ткань) [30]. Вероятно, при магнийдефицитных состояниях (НДСТ), в условиях нарушенного обмена эстрогенов при ПНБ, происходит перераспределение магния с накоплением его ионов в тканях матки.

Отек стромы эндометрия в среднюю стадию лютеиновой фазы вызван синтезируемым лютеиновыми клетками эстрадиолом [31]. Отставание трансформации стромы с уменьшением степени и распространения отека можно объяснить неадекватной секрецией эстрадиола либо снижением чувствительности рецепторов эндометрия к эстрогенам. Формирование отека в стромальном компоненте эндометрия осуществляется за счет усиления проницаемости сосудистой стенки и перехода основного вещества из золя в гель [31]. Дисбаланс ионных взаимоотношений с повышением содержания ионов магния замедляет трансформацию стромы, межклеточного матрикса и основного вещества в эндометрии у женщин с НДСТ. Следствием нарушенных функциональных и структурных преобразований является сближение стромального и железистого компонентов в эндометрии.

Неполноценной трансформацией клеток стромы можно объяснить ранее представленное снижение ФА в эндометрии, поскольку фибробластоподобные клетки являются основным источником синтеза протеиновых субстанций [31].

Общеизвестно, что цитоплазматический ретикулум синтезирует биологически активные субстраты, поэтому деструкция ретикулума при НДСТ приводит к снижению синтеза белков и, следовательно, к неадекватной трансформации фибробластоподобных клеток стромы и железистого эпителия с нарушением деления клеток и увеличением количества клеток, находящихся в состоянии амитоза.

Патология сосудистого русла, проявляющаяся гипоплазией вертикальных артерий и замедлением спирализации горизонтальных ветвей, сопровождается нарушением адекватной перфузии эндометрия кровью и развитием гипоксии, которые усугубляют аномальную трансформацию эндометрия.

В структурах эндометрии пациенток с ПНБ и НДСТ установлено существенное уменьшение экспрессии и количественное снижение COLL-IV-позитивных структур, что обусловлено нарушением трансформации фибробластоподобных клеток и соответственно снижением синтеза коллагена [32, 33], а также повышением активности MMP-9, регулирующей формирование коллагена [32, 33].

MMP-9 — фермент широкого спектра действия, осуществляющий протеолиз не только коллагена, но и желатина, эластана, фибронектина и плазмина [32]. Активность фермента в эндометрии у женщин с НДСТ повышена. Вероятно, плазмин изначально стимулирует ММР-9 [33], которая инактивирует предшественник плазмина плазминоген, являющегося субстратом для ММР-9 и плазмина [32]. Результатом последовательных влияний ММР-9 являются снижение ФА эндометрия и вторичное повышение активности TIMP-1 в эндометрии у пациенток с НДСТ и ПНБ.

Сопряженное увеличение ММР-9 и TIMP-1 приводит к разбалансировке синтеза коллагена в эндометрии женщин с НДСТ. Не исключено, что одновременное увеличение экспрессии ММР-9 и TIMP-1, сопровождающееся повышением их активности, является одной из причин нарушенной инвазии цитотрофобласта в период первой волны, поскольку согласно данным литературы, одну из ключевых ролей в инвазии цитотрофобласта играет ММР-9, регулирующая глубину инвазии [34]. По-видимому, при наступлении беременности в условиях повышенного синтеза и активности TIMP-1 ингибируется ММР-9, что влечет нарушение процессов инвазии цитотрофобласта.

1. На основании проведенного исследования установлено, что одной из возможных причин привычного невынашивания беременности у пациенток с НДСТ является неадекватное состояние эндометрия, которое характеризуется морфологическими изменениями эндометрия, несоответствующими фазе и дню менструального цикла, нарушенным ангиогенезом и синтезом коллагена, основой которых служат снижение ФА, избыток магния, нарушение трансформации фибробластоподобных клеток, диссонанс системы ММР-9 — TIMP-1.

2. Выявлены новые механизмы привычного невынашивания беременности ранних сроков у пациенток с недифференцированной дисплазией соединительной ткани.