Одной из актуальных задач современной стоматологии и челюстно-лицевой хирургии является своевременная диагностика предопухолевых состояний и злокачественных новообразований различной локализации, в том числе плоскоклеточной внутриэпителиальной неоплазии (Squamous Intraepithelial Neoplasia - SIN) и плоскоклеточного рака (ПР) слизистой рта (СР). В настоящее время для ее решения изучают гены и белковые продукты, лежащие в основе онкогенеза [7].
Отличительная особенность многослойного плоского эпителия - то, что отдельные клетки прочно связаны между собой и с базальной мембраной за счет кадгерин-катениновой системы и плотных контактов [3].
Плотные контакты формируются из мембранных, цитоплазматических белков и белков цитоскелета. Клаудины относятся к группе мембранных белков, состоящей из 24 видов, с молекулярной массой от 20 до 27 кДа. Их основная функция - формирование волокон, структурных и функциональных центров плотных контактов в плазматической мембране клеток [5, 6, 8, 10]. Изменения экспрессии клаудинов часто ассоциируются со злокачественными опухолями разной локализации, что свидетельствует об их потенциальном участии в онкогенезе [10].
Цель данного иммуногистохимического (ИГХ) исследования - изучение особенностей экспрессии белка клаудина-1 (Cl1) в зависимости от уровня пролиферативной активности клеток в неизмененном эпителии, при простой гиперплазии (ПГ), SIN и ПР.
Материал и методы
В работе использовали операционный и архивный материал лаборатории патологической анатомии ЦНИИС и ЧЛХ Минздрава России за период с января 2007 г. по декабрь 2012 г. Были исследованы биоптаты СР 40 пациентов (11 мужчин и 29 женщин; средний возраст - 45,1 года). У 10 (25%) больных диагностирована ПГ СР, у 10 (25%) - SIN, у 10 (25%) - ПР СР и у 10 (25%) патологических изменений выявлено не было.
Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине. Для гистологического и ИГХ-исследования серийные срезы толщиной 5 мкм монтировали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Тканевые антигены определяли с помощью моноклональных антител к Ki-67 (MM1, «Diagnostic Biosystems») и очищенных антител кроличьей антисыворотки к Cl1 («LabVision»). Иммунные комплексы выявляли с помощью безбиотиновой системы детекции на основе пероксидазы хрена («BioGenex», США), срезы докрашивали гематоксилином Майера. Индекс пролиферации (ИП; %) по Ki-67 (ИП Ki-67) определяли как отношение количества иммунореактивных ядер клеток к общему числу ядер. Экспрессию клаудина на наружной мембране эпителиальных клеток оценивали по интенсивности окрашивания в ИГХ-реакции в условных единицах:
0 - экспрессии не отмечалось; 1 - слабая экспрессия; 2 - умеренная экспрессия; 3 - выраженная экспрессия. В связи с тем, что основной объем пролиферирующих клеток при ПГ и SIN наблюдается в нижних 2/3 эпителия, указанные маркеры определяли в 300 клетках 3 зон эпителия: 1-я зона - базальный слой - клетки, непосредственно прилегающие к базальной мембране; 2-я зона - парабазальный слой - 2 ряда клеток над базальным слоем; 3-я зона - шиповатый слой эпителия. При ПР исследовали экспрессию маркеров в периферической и центральной зонах. Показатели определяли в соответствующих участках тканей. Подсчет клеток производили при увеличении ×400.
Статистическая обработка данных проводилась в программном пакете STATISTICA 10.0 стандартными методами с определением среднего арифметического (М) и среднего квадратичного отклонения (ॣ). Сравнение средних осуществляли непараметрическим методом с использованием U-критерия Манна-Уитни. Достоверными считали различия средних при уровне статистической значимости p<0,05. Корреляционные взаимоотношения между ИП клеток и экспрессией Cl1 оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена.
Результаты и обсуждение
Пролиферативную активность в исследуемом материале оценивали с помощью маркера Ki-67, который определяли в ядрах пролиферирующих клеток. В неизмененном эпителии СОР иммунопозитивные клетки локализовались в базальном слое, при ПГ - в базальной и парабазальной зонах, при SIN - во всех 3 исследуемых зонах. При ПР СОР пролиферативная активность отмечалась преимущественно по периферии. Средние значения количественных показателей представлены в таблице.
Иммуногистохимически белок клеточной адгезии Cl1 выявлялся на поверхности плазматической мембраны эпителиальных клеток. При ИГХ-исследовании неизмененного многослойного плоского эпителия СР выраженная экспрессия отмечалась в клетках базального, парабазального и шиповатого слоев. При ПГ СОР в базальном слое экспрессия Cl1 отсутствовала; в парабазальном слое в 4 случаях из 10 выявлена слабая ИГХ-реакция, в то время как в 6 случаях она отсутствовала; в шиповатом слое наблюдалась выраженная экспрессия Cl1. При SIN белок Cl1 в 8 случаях из 10 отсутствовал во всех 3 зонах, а в 2 случаях в незначительном количестве был обнаружен только в шиповатом слое. Экспрессия Cl1 при ПГ и SIN во всех исследуемых слоях эпителия достоверно отличалась от нормы. При ПР экспрессия Cl1 определялась только в центральной зоне; в 2 (20%) случаях низкодифференцированного ПР СР Cl1 выявлен не был. Экспрессия Cl1 при ПР достоверно отличалась от таковой в неизмененном эпителии и при ПГ, в то время как при SIN отмечалась схожая картина ИГХ-реакции из-за значительного снижения его экспрессии на поверхности клеток шиповатого слоя с признаками дисплазии.
Исследование корреляционных взаимоотношений между ИП клеток и экспрессией Cl1 на клеточных мембранах в неизмененном эпителии, при ПГ, SIN и ПР СР выявило выраженную отрицательную корреляцию (r=–0,83; р<0,001).
Повышение пролиферативной активности клеток является основным звеном патогенеза опухолей. Универсальным маркером пролиферации при ИГХ-исследованиях служит белок Ki-67, поскольку он выявляется в клетке во всех фазах митотического цикла, кроме G0 [1]. Исследование показало, что повышение пролиферативной активности клеток многослойного плотного эпителия при ПГ, SIN и ПР СР сопровождается уменьшением экспрессии Cl1 на поверхности плазматической мембраны, что ведет к снижению межклеточной адгезии и обмена сигнальными субстанциями, которые могли бы тормозить деление и миграцию клеток [2, 4, 9, 10]. В свою очередь приобретение злокачественными клетками свойства отделяться от исходной клеточной массы вследствие ослабления межклеточных контактов может приводить к опухолевой прогрессии и последующему метастазированию.
Итак, в исследовании выявлена обратная взаимосвязь между выраженностью пролиферации клеток и экспрессией в них Cl1. Высокий уровень клеточной пролиферации при ПГ, CIN и ПР СР характеризовался снижением уровня экспрессии Cl1, а выраженная клеточная неоплазия - полным отсутствием данного белка на клеточной поверхности. Таким образом, белок клеточной адгезии Cl1 может служить маркером при ранней диагностике неопластической трансформации клеток многослойного плоского эпителия СР.