Сахарный диабет (СД) является одним из социально значимых заболеваний, приводящих к высокой инвалидизации населения [1]. Ежегодно фиксируют около 6 млн новых случаев этого заболевания [2, 3]. Диабетическую полинейропатию (ДПН), которая, по разным данным, развивается у 75% больных СД, классифицируют в соответствии с преимущественным вовлечением в патологический процесс либо спинно-мозговых и черепно-мозговых нервов (периферическая нейропатия), либо вегетативной нервной системы с нарушением иннервации внутренних органов (автономная нейропатия) [4—11]. Для диагностики ДПН используют анамнестический сбор жалоб (чувство жжения и покалывания, а также онемение и потеря чувствительности в конечностях, отечность стоп и чувство зябкости), биопсию кожи или участка икроножного нерва с пораженной поверхности конечности, а также электронейромиографию (ЭНМГ) с помощью игольчатых электродов [12—15].

В последнее время возрос интерес к изучению анатомо-физиологических свойств нервных волокон роговицы (НВР), что в значительной степени было вызвано предположением австралийского ученого Н. Эфрона о возможности их изменения в процессе развития ДПН [16]. Несмотря на то что число публикаций, посвященных данной проблеме, весьма велико, вопросы степени повреждения НВР при СД и возможности объективной интерпретации таких изменений остаются открытыми.

Визуализация НВР стала возможной благодаря внедрению в клиническую практику метода конфокальной микроскопии роговицы (КМР), позволяющего детально изучать состояние всех слоев роговицы. Весьма успешно данный метод применяют в медицинской школе университета Манчестера [17—19]. В качестве основных показателей состояния НВР используют следующие параметры: NFD (Nerve Fibre Density) — количество основных нервных стволов, NBD (Nerve Branch Density) — количество нервных ответвлений от основных нервных стволов, NFL (Nerve Fibre Length) — общая длина всех нервов, NFT (Nerve Fibre Tortuosity) — общий коэффициент извитости нервов роговицы.

Однако в связи с тем, что точное позиционирование оптической части прибора в идентичные участки роговицы практически невозможно, а площадь анализируемого участка роговицы мала, при динамическом наблюдении достаточно сложно идентифицировать аналогичные пучки нервных волокон. Кроме этого, с учетом глубины фокуса прибора велика вероятность получения изображения одновременно нескольких слоев НВР. В связи с этим использование таких параметров, как общая длина всех нервных волокон, количество нервных волокон и их ответвлений может давать ложные значения.

Дополнительные погрешности могут быть обусловлены зависимостью общей длины нервных волокон от их коэффициента извитости. В последних версиях программного обеспечения этот недостаток был частично устранен путем нормирования общей длины нервов роговицы к общему коэффициенту извитости [20]. Тем не менее принципиальный подход к интерпретации снимков остался неизменным: основным элементом анализа по-прежнему остается ручное выделение элементов НВР на конфокальном изображении.

Цель настоящего исследования — разработка нового подхода к морфометрическому анализу НВР и оценка на основе разработанного подхода возрастных изменений НВР и их состояния при СД 1-го и 2-го типа.

Вопрос целесообразности применения и апробирования данной методики в плане диагностики и мониторинга ДПН в данной работе не рассматривался. В дальнейшем планируется внедрение описанного ниже подхода и его сравнение с данными ЭНМГ.

Общая характеристика материала исследования представлена в табл. 1. В исследование были включены 37 пациентов (74 глаза) с СД 1-го типа и 51 пациент (102 глаза) с СД 2-го типа. Критериями исключения являлись патологические состояния структур переднего отрезка глаза, хирургические и лазерные вмешательства в анамнезе. В каждой из указанных групп осуществляли деление на подгруппы по возрастному признаку. Количественная разнородность возрастных диапазонов объясняется крайне редкой встречаемостью СД 1-го типа в старшей возрастной группе в связи с более ранними летальными исходами по сравнению с общей популяцией [21, 22], а также поздней манифестацией СД 2-го типа, чаще встречающегося в старшей возрастной группе (после 45 лет). СД 2-го типа, диагностируемый в детском возрасте, принято относить к MODY-диабету (Maturity-Onset Diabetes of the Young — болезнь зрелого типа у юных людей) [23—26]. Пациенты с диагностированным MODY-диабетом в исследование включены не были. Группа контроля была представлена 62 «здоровыми» добровольцами (124 глаза). Возраст пациентов в разных группах варьировал от 13 до 83 лет. При наличии СД формирование групп и анализ результатов исследования проводили с учетом уровня гликемии натощак и через 30 мин после еды, а также показателей гликированного гемоглобина.

Помимо традиционных методов исследования, включающих визометрию в стандартных условиях освещенности, биомикроскопию переднего отрезка глаза, прямую и обратную офтальмоскопию в условиях медикаментозного мидриаза, периметрию и тонометрию, проводили конфокальную биомикроскопию на аппарате HRT III с модулем Rostock, в основу которого заложен принцип лазерной растровой когерентной техники.

Возможную зависимость изменений НВР и витреоретинального комплекса в данном исследовании не изучали.

Различие полученных в данном исследовании показателей состояния НВР на парных глазах оценивали с помощью модифицированной формулы [27], ранее предложенной для оценки межокулярной асимметрии при описании глаукомных изменений, адаптированной к условиям задачи настоящего исследования:

где ПМА — показатель межокулярной асимметрии; пОD — исследуемые показатели правого глаза; пОS — исследуемые показатели левого глаза.

Таким образом, вместо относительной разницы оцениваемых значений мы предложили использовать их абсолютную разницу, что позволило избежать ошибки, связанной с превышением исследуемого показателя для одного из глаз. Следует отметить, что такой упрощенный расчет ПМА позволяет оперировать исследуемыми показателями только в случае, если они заведомо описываются положительными величинами, отличными от нуля.

Обработку полученных данных производили в программе PSPP (Linux) и пакета статистического анализа Microsoft Excel 2006. Различия выборок оценивали в соответствии с непараметрическим распределением, используя U-критерий Манна—Уитни. Статистическую связь между группами оценивали при помощи коэффициента ранговой корреляции Спирмена r. Различия между выборками считали статистически значимыми при р<0,05.

Новый подход к морфометрическому анализу НВР базируется на объективном описании направленности НВР и алгоритме вычисления коэффициентов анизотропии направленности (K_ΔL) и симметричности направленности (K_sym). При этом полученные с помощью конфокальной микроскопии изображения подвергали анализу с использованием оригинального программного обеспечения Liner 1.1. Подробное математическое обоснование данного метода анализа, его ограничений, а также особенностей интерпретации конфокальных изображений с помощью данного алгоритма представлено в ранее опубликованной работе [28].

В отличие от ранее предложенного алгоритма (программный продукт «CCM Image Analysis Tool») изначально было решено отказаться от ручной трассировки нервных волокон для выделения ключевых точек. На первом этапе происходит полностью автоматизированное распознавание конфокальных цифровых изображений и картирование НВР. Программа автоматически интерпретирует изображение и генерирует карту вероятности прохождения НВР на участке, соответствующем этому изображению (рис. 1). При этом необходимо отметить, что участки нервных волокон, находящиеся вне фокуса, а также в пределах недоэкспонированных и зашумленных областей изображения, выделяются с использованием предлагаемого алгоритма лучше, чем при визуальном анализе.

Высокая эффективность автоматизированного распознавания изображения основана на применении оригинального алгоритма. Формализация изображения состоит в том, что нервное волокно на конфокальном изображении представляет собой относительно более светлую полосу определенной ширины на темном фоне (рис. 2). Программа предполагает последовательный анализ различных участков исходного снимка и оценку их сродства с «идеальным» участком нерва — сгенерированной математически светлой полосой в черном квадратном поле. При этом нервное волокно, проходящее через определенную точку, может быть расположено под любым углом, поэтому исследуемый участок нужно сравнить с серией «идеальных» модельных изображений, каждое из которых повернуто на некоторый угол α относительно исходного изображения в пределах 180° (рис. 3).

Для объективизации оценки сродства полученного изображения и модельной функции М был использован коэффициент корреляции, который может принимать значения от –1 до 1. При этом, чем более похожи два изображения, тем большее значение имеет коэффициент корреляции. После сравнения исследуемого изображения с серией модельных функций можно получить набор коэффициентов корреляции, соответствующих различным углам α (отрицательные значения коэффициента корреляции отбрасываются). Угол α, при котором коэффициент корреляции максимальный, является наиболее вероятным углом расположения нерва в данной точке изображения. В результате для каждой точки изображения определяется вероятность присутствия нервного волокна и угол его расположения α (рис. 4, а).

Полностью изображение можно охарактеризовать, просуммировав все вектора для каждой точки, а результат удобно представить в виде розы-диаграммы (см. рис. 4, б). Если на конфокальном изображении нервные волокна, в основном, расположены под одинаковым углом, то на розе-диаграмме лучи, идущие в этом направлении, будут существенно длиннее остальных, что делает диаграмму вытянутой, однонаправленной под одним вектором. Это свойство можно выразить в виде коэффициента анизотропии K_ΔL, равного отношению самого длинного луча на розе-диаграмме к самому короткому (рис. 5). Таким образом, коэффициент анизотропии направленности нервов K_ΔL в числовом виде описывает наличие общего (генерального) направления нервов на конфокальном снимке.

В том случае, когда нервные волокна на снимке имеют одно превалирующее направление, роза-диаграмма приближается по форме к овалу. Если же таких направлений два или более, то форма диаграммы искажается, становится несимметричной относительно генерального направления. Степень искажения можно выразить как отношение площадей половины диаграммы с одной и другой стороны от направления самого длинного луча. Для удобства сравнения этой характеристики был введен коэффициент симметричности направленности нервов K_sym, вычисляемый как отношение большей из площадей к меньшей. Указанный алгоритм реализован в специально разработанном программном обеспечении, за счет которого все измерения полностью автоматизированы.

Основными достоинствами нового подхода к морфометрическому анализу НВР являются отсутствие зависимости от способа получения конфокального изображения нервной сети, толерантность к условиям локального освещения и прозрачности сред, а также минимальная зависимость от выбора точки получения конфокального изображения в пределах роговицы.

В табл. 2 и 3 представлены средние величины коэффициентов анизотропии и симметричности направленности НВР, полученные с помощью описанного выше метода у здоровых добровольцев и при СД в различных возрастных группах.

В норме степень извитости нервов роговицы возрастает, при этом до 35—40 лет изменения извитости происходит быстрее, чем у пожилых людей. Коэффициент анизотропии направленности нервов роговицы закономерно снижается в среднем от 3,9 в постпубертатной возрастной группе до 2,7 у пожилых лиц, а коэффициент симметричности направленности НВР увеличивается в среднем от 0,79 до 0,87 в соответствующих возрастных группах (рис. 6). Указанная ситуация может быть связана как с нарушением трофики самого нерва, так и общими инволютивными процессами, происходящими в организме.

При СД 1-го и 2-го типа выявлено статистически достоверное снижение коэффициента анизотропии K_ΔL и увеличение коэффициента симметричности K_sym. Коэффициенты анизотропии и симметричности направленности НВР при СД 1-го типа соответственно составили 2,49±0,79 и 0,89±0,11 (возрастная группа 13 лет — 34 года), 2,45±0,63 и 0,94±0,05 (возрастная группа 35—56 лет); при СД 2-го типа — 2,62±0,59 и 0,88±0,11 (возрастная группа 35—56 лет), 2,51±0,64 и 0,9±0,07 (возрастная группа 57 лет — 83 года).

На рис. 7 показаны типичные варианты розы-диаграммы направленности НВР в «норме» и при наличии СД. В последнем случае имеет место характерная изометричная форма розы-диаграммы, более приближенная по своей форме к кругу. Такая форма розы-диаграммы объясняется разнонаправленным ходом НВР. В норме форма розы-диаграммы однонаправленная, схожая с резко удлиненным овалом, что отражает преимущественно однонаправленный ход НВР.

Уменьшение коэффициента анизотропии K_ΔL и увеличение коэффициента симметричности K_sym при СД, возможно, связано с сосудистыми нарушениями, накоплением продуктов распада глюкозы, снижением уровня (или активности) факторов роста нервов, оксидативным стрессом, а также генетическими нарушениями или наследственными факторами [29, 30].

Установлена сильная обратная корреляция между коэффициентом анизотропии K_ΔL и уровнем гликированного гемоглобина у пациентов с СД 1-го и 2-го типа (r=–0,83, р<0,001 и r=–0,79, р<0,005 соответственно), а также длительностью заболевания (r=–0,7, р<0,005 и r=–0,72, р<0,001 соответственно). Выявлена корреляция между коэффициентом симметричности направленности НВР и показателями гликированного гемоглобина в группе пациентов с СД 1-го и 2-го типа (r=0,64, p<0,005 и r=0,78, р<0,05 соответственно), а также длительностью заболевания (r=0,62, p<0,05 и r=0,73, р<0,05 соответственно). Выявленные закономерности изменений показателей состояния НВР можно охарактеризовать следующим образом: чем выше уровень гликемии (и соответственно, ниже уровень компенсации заболевания), тем меньше коэффициент анизотропии K_ΔL и больше коэффициент симметричности K_sym. Более высокая корреляция с текущим уровнем гликемии может косвенно говорить о непосредственном воздействии СД на нейротрофическую функцию НВР.

Рядом проспективных мультицентровых исследований — DCCT (1993—1995), DEKAN (1995), ALADIN 1, ALADIN 2, ALADIN 3 (1995—2000) — показана ведущая роль гипергликемии в патогенезе ДПН. Выявлено, что частота ДПН, вызванной повышенным уровнем гликированного гемоглобина, у больных СД 1-го и 2-го типа одинакова, несмотря на различный патогенез этих форм диабета [6]. В данном исследовании в одновозрастной выборке средние значения коэффициента анизотропии направленности НВР при СД 1-го типа оказались ниже, чем в случаях СД 2-го типа (2,45±0,63 и 2,62±0,59 соответственно), однако указанная разница была статистически незначимой (r=0,34, р<0,05). При сравнении показателей в разновозрастной выборке пациентов с СД коэффициент анизотропии направленности НВР оказался ниже при СД 1-го типа, а коэффициент симметричности, наоборот, — выше, несмотря на то что в группе пациентов с СД 2-го типа имеет место «наложение» отмеченных выше возрастных изменений НВР. В частности, в возрастной группе 57—83 лет у пациентов с СД 2-го типа средние значения K_ΔL и K_sym составили 2,51±0,64 и 0,9±0,07, в то время как аналогичные показатели в группе пациентов с СД 1-го типа были равны 2,49±0,79 и 0,89±0,11 соответственно. Графически зависимость коэффициентов K_ΔL и K_sym от возраста в разных группах отображена на рис. 8.

Кроме этого, при СД была выявлена асимметрия коэффициентов K_ΔL и K_sym на парных глазах, чего практически не наблюдали в группе здоровых добровольцев (рис. 9). Так, показатель асимметрии для коэффициента анизотропии направленности НВР при СД 1-го и 2-го типа составил 0,78±0,26 и 0,65±0,14, а для коэффициента симметричности направленности НВР — 0,08±0,03 и 0,06±0,03 соответственно. В популяции здоровых добровольцев показатели асимметрии K_ΔL и K_sym составили всего 0,17±0,09 и 0,02±0,01, а в процентном выражении средневзвешенное различие коэффициентов анизотропии K_ΔL и симметричности K_sym в «норме» не превышает 3%. Кроме этого, при наличии СД была выявлена прямая корреляция между показателем асимметрии указанных коэффициентов на парных глазах и длительностью СД (для СД 1-го типа r=0,44, p<0,05, для СД 2-го типа r=0,35, p<0,05).

1. Впервые на достаточном клиническом материале на основе оригинального метода морфометрического анализа состояния НВР, предполагающего вычисление коэффициентов анизотропии и симметричности направленности нервов, проведена оценка возрастных изменений НВР, а также их потенциальных изменений при СД 1-го и 2-го типов.

2. В «норме» возрастные изменения НВР проявляются в усилении степени извитости и уменьшении анизотропии направленности НВР. При С.Д. эта тенденция усиливается, при этом имеет место сильная обратная корреляция между уровнем гликированного гемоглобина, длительностью заболевания и коэффициентом анизотропии направленности НВР, а для коэффициента симметричности направленности НВР эта зависимость имеет прямой характер. Кроме этого, при СД выявлена асимметрия указанных коэффициентов на парных глазах, чего практически не наблюдается в «норме».

3. Полученные результаты подтверждают принципиальную возможность использования показателей состояния НВР в качестве критериев диагностики и мониторинга ДПН, однако для формирования доказательной базы требуется проведение дальнейших исследований на основе специального протокола исследования.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.А., З.С., И.Н.

Сбор и обработка материала: З.С., И.Н., С.М.

Статистическая обработка: З.С., И.Н.

Написание текста: З.С., И.Н.

Редактирование: С.А.

Конфликт интересов отсутствует.