Врожденная аниридия (ВА) (OMIM 106210) — генетически обусловленная панокулярная мальформация, которая характеризуется частичным или полным отсутствием радужной оболочки, гипоплазией фовеа и диска зрительного нерва, кератопатией, помутнениями в хрусталике, развитием глаукомы и нистагмом [1]. Комплексный характер нарушения развития связан с возникновением в 85—90% случаев гетерозиготных мутаций в гене РАХ6 [2]. Частота данной патологии в мире составляет 1 случай на 40 000—100 000 населения [3].

Ассоциированная с аниридией кератопатия (АК) встречается у 20—90% пациентов [4]. Причину ее возникновения связывают с первичной недостаточностью лимбальных стволовых клеток (НЛСК) и альтерацией лимбального микроокружения вследствие мутации в гене PAX6. В настоящее время доказана роль РАХ6 в метаболизме экстрацеллюлярного матрикса, нормальной экспрессии белков цитоскелета и молекул клеточной адгезии в роговице [5]. По данным К. Ramaesh и соавторов в 78% случаев в основе патогенеза АК лежит разрушение лимбального микроокружения, приводящее к формированию аномального репаративного ответа, нарушению миграции роговичных клеток и эпителиальной дифференцировки [6].

Кроме того, наличие лимбальных стволовых клеток (ЛСК) является необходимым условием для сохранения прозрачности роговицы и ее регенераторных свойств. В экспериментальных работах доказана локализация ЛСК в лимбальных палисадах Фогта (ЛПФ) и фокальных стромальных проекциях (ФСП) роговицы [6, 7]. Присутствие данных структур является клиническим маркером, указывающим на наличие ЛСК [8], а их отсутствие вследствие химического или термического ожога, генетического дефекта (ВА) приводит к развитию картины НЛСК [7]. «Золотым стандартом» визуализации морфологических изменений роговицы in vivo является конфокальная микроскопия. Оценка прогениторных структур лимба является необходимым условием для прогнозирования дальнейшего течения АК, предиктором переносимости хирургических вмешательств и зрительного прогноза в целом. Однако, учитывая большую хрупкость корнеального эпителия при АК, необходимость использования топикальных анестетиков, трудоемкость и длительность проведения лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (ЛСКМ) лимбальной зоны, требуется оценка информативности других, альтернативных, методов диагностики прогениторных структур роговицы и возможности их применения в клинической практике.

Цель данного исследования — изучение морфологических изменений в ЛПФ и эпителии роговицы при различных стадиях АК, возможности визуализации лимбальных прогениторных структур у пациентов с ВА при помощи оптической когерентной томографии (ОКТ), а также оценка согласованности результатов диагностики ЛПФ, выполненной методами ЛСКМ и ОКТ.

В основную группу вошли 34 пациента (63 глаза) в возрасте от 4 до 53 (в среднем 32,7±13) лет с АК, из них 18 женщин и 16 мужчин. Семейный характер наследования был отмечен у 24 человек, спорадические случаи ВА — у 10. В результате ранее проведенного генетического анализа на базе ФГБНУ «Медико-генетический научный центр» (Москва) методами прямого двунаправленного секвенирования и мультиплексной лигазозависимой амплификации зондов причинную мутацию удалось обнаружить у 31 пациента. Клинические признаки ВА в основной группе были представлены полным отсутствием радужной оболочки (95%), нистагмом (80%), катарактой (42%), вторичной глаукомой (44%) и гипоплазией фовеа (86%), косоглазие было отмечено в 25% случаев. В 27 глазах были выполнены хирургические вмешательства по поводу экстракции катаракты с имплантацией заднекамерной интраокулярной линзы (10 глаз), иридохрусталиковой диафрагмы (ИХД) производства «Репер-НН» (Нижний Новгород, Россия) (12 глаз) и с сохранением афакии (5 глаз).

В группу контроля вошли 15 здоровых лиц (30 глаз), описанных нами в предыдущей статье [9], без признаков лимбальной недостаточности, без видимых изменений роговичной поверхности, оперативных вмешательств и травм в анамнезе.

На основе данных биомикроскопии определяли выраженность АК в основной группе. С целью верификации стадии АК использовали классификацию, предложенную U. Eden в 2010 г. (табл. 1)

Детальное обследование центральной зоны роговицы, определение плотности крыловидных, базальных, а также эндотелиальных клеток, оценку структур ЛПФ и зоны перехода между лимбальной и роговичной тканью, выявление воспалительных изменений в верхнем и нижнем лимбе проводили с помощью Гейдельбергского лазерного ретинального томографа HRT3 с роговичным модулем Rostock Cornea Module («Heidelberg Engineering», Германия). Средние значения плотности крыловидных, базальных и эндотелиальных клеток в центральной зоне роговицы определяли после их трехкратного измерения в каждом слое. Плотность эндотелиальных клеток подсчитывали у пациентов с АК, не подвергавшихся интраокулярным вмешательствам в прошлом. Подсчет клеток осуществляли в специальной оригинальной программе конфокального микроскопа Cell Count. Конфокальная микроскопия во всех случаях выполнялась одним оператором по ранее описанному алгоритму [9].

К морфологическим критериям сохранности прогениторных структур лимбальной зоны относили мозаичный рисунок лимбальных базальных клеток с темной цитоплазмой и четкими светлыми границами, визуализацию ЛПФ и ФСП. При отсутствии хорошо видимых интактных прогениторных зон снимки оценивали на наличие различимых палисадоподобных структур. Конъюнктивальный эпителий определяли по визуализации клеток со светлой цитоплазмой и трудно различимыми клеточными стенками, присутствию бокаловидных и округлых воспалительных клеток.

ЛПФ изучали с помощью спектрального оптического когерентного томографа RTVue XR Avanti («Optovue», США, версия программного обеспечения 2016.1.0.26) с насадкой для исследования переднего отрезка глаза. С целью визуализации ЛПФ в верхнем и нижнем лимбе применяли протоколы 3D-Cornea в режиме En Face и Cornea Cross Line по ранее описанному алгоритму [9]. В протоколе Pachymetry+CPwr оценивали центральную толщину роговицы (ЦТР) и ее эпителия в пределах двухмиллиметровой зоны. Учитывая наличие у большинства пациентов нистагма, с целью нивелирования вероятности ошибки в результате смещения центра роговицы проводили трехкратные измерения с вычислением среднего значения.

Данные были статистически проанализированы с помощью программы Statistica v. 6.1 («StatSoft Inc.»). Полученные результаты с нормальным распределением оценивали по критерию Стьюдента (t-тест), при ненормальном распределении признака использовали непараметрический критерий Манна—Уитни. Данные считали достоверными при уровне значимости меньше 0,05. Анализ корреляции между методами прямой (ЛСКМ) и непрямой (ОКТ) визуализации ЛПФ осуществляли на основе корреляции по Спирмену. Значения непараметрических признаков были заменены на следующие ранги: 0 — отсутствие палисад, 1 — наличие измененных палисад или палисадоподобных структур, 2 — наличие полноценных палисад. С целью снижения влияния парных глаз на результаты статистического анализа в исследование был включен лишь один глаз каждого пациента, выбранный путем рандомизации.

Демографические характеристики, данные генетического анализа, стадия АК, результаты ЛСКМ и ОКТ зоны лимба у пациентов основной группы представлены в табл. 2.

У 4 пациентов (8 глаз) по данным биомикроскопии была обнаружена полностью прозрачная роговица без признаков НЛСК (0 стадия АК). У одного из сибсов (1А) с семейным анамнезом ВА и 3´ делецией регуляторной области гена PAX6 были обнаружены неизмененные ЛПФ как в верхнем, так и нижнем лимбе. Морфология прогениторных структур была полностью сохранена и соответствовала картине ЛСКМ здоровых пациентов [9]. Структура лимбальных крипт в верхней гемисфере роговицы носила сетчатый характер, хорошо визуализировалась зона темных «ручейков» (чередование гипер- и гипорфлективных участков базального эпителия). Палисады Фогта в нижней половине роговицы располагались в виде классического частокола. Данные ОКТ лимбальных зон соответствовали результатам обследования роговицы методом ЛСКМ и хорошо визуализировали структуру ЛПФ (рис. 1).

Анализ данных второго сибса (1В) с той же мутацией выявил значительно измененные структуры ЛПФ в верхнем лимбе. Лимбальные крипты плохо дифференцировались, просматривались утолщенные гиперрефлективные палисадоподобные образования с нечеткими контурами и единичные ФСП. Клетки базального эпителия с характерной мозаичностью визуализировались хорошо, была видна зона «треснувшей земли» или зона «ручейков», описанная ранее у здоровых пациентов [9, 11, 12]. По данным ОКТ роговицы в этой зоне не удалось достоверно визуализировать лимбальные структуры. В то же время обследование нижнего лимба выявило сохранные ЛПФ и высокую степень соответствия результатов, полученных двумя диагностическими методами (рис. 2).

У пациентки (2) в возрасте 35 лет с 0 стадией АК и сходной делецией 11p13 3´ цис-регуляторной области гена PAX6 измененные палисады по данным ЛСКМ были обнаружены в нижней половине лимба. Анализ изображений ОКТ в нижней половине также выявил менее контрастные измененные укороченные лимбальные крипты, потерявшие вид частокола и четкие границы, однако узнаваемые и визуализируемые (рис. 3).

У пациентки (3) в возрасте 45 лет с доказанным отсутствием мутации в гене РАХ6 были найдены измененные лимбальные структуры в верхней и нижней половинах лимба, расположенные локально и не распространяющиеся по всей полуокружности. Несмотря на перенесенную интраокулярную хирургию (в анамнезе экстракция катаракты с имплантацией ИХД на обоих глазах), у данной пациентки не наблюдалось прогрессирования АК, роговица на протяжении всего периода наблюдения (4 года) оставалась интактной (рис. 4).

У всех пациентов с 0 стадией АК не было нистагма, что позволяло хорошо визуализировать структуры лимбальной зоны методом ЛСКМ, избегать артефактов и дополнительных шумов при проведении ОКТ. Во всех случаях в лимбальной зоне хорошо дифференцировались эпителий роговичного типа без признаков конъюнктивальной инвазии, а также зона волнистых «дорожек» в виде гипер- и гипорефлективных участков базального эпителия, берущих начало у апикального конца ЛПФ и распространяющихся к центру роговицы.

У 15 пациентов (25 глаз) была диагностирована I стадия АК в виде характерного периферического помутнения роговицы. В глазу одного пациента (4А) удалось обнаружить палисадоподобные структуры, значительно отличающиеся от лимбальных крипт нормальной роговицы. Морфологически наблюдалась выраженная деградация структур ЛПФ с потерей их упорядоченности и контрастности, лимбальные крипты с трудом визуализировались, ФСП отсутствовали.

В других глазах с АК I стадии не удалось выявить прогениторные структуры в лимбальной зоне. На периферии роговицы наблюдалось внедрение конъюнктивальной ткани в виде конъюнктивальных выростов или конъюнктивальных островков различной степени выраженности. Разрушение лимбального барьера сопровождалось появлением в роговице единичных клеток воспаления и бокаловидных клеток. Мозаичная структура базальных клеток была сохранена, клетки имели роговичный фенотип, однако границы клеток были менее четкими, в 4 случаях в крыловидных и базальных клетках визуализировались проминирующие клеточные ядра (рис. 5, а,

Из 10 человек (13 глаз) со II стадией АК с признаками периферической неоваскуляризации и помутнения роговицы у двух родственных пациентов (21А, 21В) (2 глаза) были обнаружены измененные, частично деформированные ЛПФ в нижней половине лимба (см. рис. 5, в). В остальных глазах прогениторные структуры не определялись, в лимбальной зоне отмечалась инвазия большого количества воспалительных и бокаловидных клеток на фоне потери эпителием роговичного фенотипа. Мозаичная картина базальных клеток была нарушена, их границы теряли четкость, а в центре клетки просматривалось небольшое светлое ядро (см. рис. 5, г). Бокаловидные клетки с диффузной отражающей способностью имели округлую форму и большие размеры, клетки поменьше, с высокой рефлективностью, соответствовали лейкоцитам. Метаплазированный по конъюнктивальному типу эпителий роговицы в виде клеток со светлыми ядрами и нечеткими контурами распространялся в центральные зоны роговицы в 9 глазах.

Для III и IV стадий АК (10 и 3 глаза соответственно) было характерно распространение роговичных изменений в центральную зону с преобладанием неоваскуляризации и субэпителиальных помутнений стромы. Изменения роговицы затрагивали все субпопуляции эпителиальных клеток, кератоциты и полностью разрушали структуру оптической поверхности. Бокаловидные клетки формировали криптоподобные скопления и в значительном количестве присутствовали вдоль новообразованных сосудов (см. рис. 5, д—и). Результаты ОКТ зоны лимба соответствовали данным ЛСКМ и не обнаруживали ЛПФ (рис. 8).

Оценка согласованности результатов диагностики ЛПФ, выполненной методом ЛСКМ и ОКТ, выявила сильную положительную связь (r_S=0,85, p<0,05) при визуализации прогениторных структур в нижней половине лимба. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена для верхнего лимба был несколько меньшим (r_S=0,53, p<0,05). Статистически определялась отрицательная связь между стадией АК и сохранностью ЛПФ (r_S=–0,5, p<0,05), связь между стадией АК и возрастом пациента выявить не удалось (r_S=0,169, р=0,174).

Анализ плотности эпителиальных клеток и клеток эндотелия был выполнен при 0—II стадии А.К. Невозможность получения данных при III и IV стадиях АК была определена нарушением морфологии эпителиоцитов, преобладанием клеток с конъюнктивальным фенотипом, нечеткостью получаемых изображений и выраженностью структурных изменений роговицы. Была выявлена статистически значимая разница плотности базальных и крыловидных эпителиальных клеток в глазах с I и II стадиями АК в сравнении с плотностью клеток в норме (измеренной в группе контроля) и при 0 стадии АК (p<0,05). Разница в плотности эндотелиальных клеток во всех исследуемых группах была статистически незначима (p>0,05) (табл. 3).

Данные ЦТР и толщины эпителия приведены в табл. 4.

АК наряду с глаукомой и катарактой является ведущей причиной прогрессирующего снижения зрения у пациентов с В.А. Потеря прозрачности центральных отделов роговицы в связи с центростремительным ростом васкуляризированного паннуса либо вследствие формирования в оптическом центре бело-серых узелков Зальцманна наблюдается уже в возрасте 18—20 лет. Оптически значимые помутнения роговицы с течением времени прогрессируют и являются причиной слепоты у 37% пациентов с ВА старше 30 лет. Естественное течение АК может усугубиться выполнением хирургических вмешательств, повреждающих лимбальную стволовую зону. Однако, несмотря на увеличивающуюся долю АК с возрастом, в литературе описаны случаи отсутствия признаков роговичных изменений у аниридийных пациентов в старших возрастных группах [13—15]. Так, в ходе исследования у 3 пациентов (1А, 1 В, 2) с 3´делецией на уровне гена ELP4 нами были верифицированы сохранные и несколько измененные прогениторные структуры лимбальной зоны (см. рис. 1—3). Подобная делеция регуляторной области нарушает нормальную экспрессию гена РАХ6 [16, 17] и приводит к формированию аниридийного фенотипа. Однако обнаружение прогениторных лимбальных структур и сохранных эпителиальных клеток роговичного типа у этих пациентов объясняет отсутствие признаков А.К. Наличие механизма, позволяющего сохранить функционирующие ЛСК на фоне РАХ6-гаплонедостаточности, требует дальнейшего изучения и анализа.

Таким образом, следует отметить, что диагноз ВА не исключает наличия лимбальных структур с сохранной прогениторной функцией, которые обеспечивают регенерацию и самообновление роговицы, а также позволяют длительно поддерживать прозрачность глазной поверхности, даже после перенесенных хирургических вмешательств.

Измененные деформированные ЛПФ были также обнаружены в нижней половине роговицы при I (1 глаз) и II (2 глаза) стадиях АК. В работах шведских ученых, изучавших корреляцию между стадией АК и выраженностью НЛСК, палисадоподобные структуры были обнаружены в нижнем лимбе только при I стадии (5 глаз). Отсутствие ЛПФ в глазах со II стадией исследователи связывали с прогрессированием лимбальной недостаточности [15]. Нами также была выявлена отрицательная корреляция между сохранностью прогениторных структур лимба и стадией АК, только меньшей силы (r_S=–0,5, p<0,05).

Особенностью ЛСКМ области лимба является обнаружение участков неравномерной рефлективности базального эпителия, расположенных центральнее ЛПФ. Эта зона так называемой «треснувшей земли» или «ручейков» визуализируется у здоровых лиц без признаков НЛСК [9, 11, 12] и связана с центростремительным движением клеток базального эпителия к центру роговицы [18]. При В.А. вследствие мутации в гене PAX6 подобная способность к миграции клеток нарушается, что является одной из причин развития АК [19]. Анализ данных ЛСКМ у пациентов с АК показал наличие характерной картины «треснувшей земли» у всех лиц с обнаруженными лимбальными прогениторными структурами (см. табл. 2, рис. 1—4). По нашему мнению, выявление подобной транзитной зоны у пациентов с подозрением на НЛСК является хорошим прогностическим признаком, указывающим на сохранную герминативную функцию ЛСК, даже в случаях затрудненной визуализации ЛПФ и ФСП при нистагме и нарушенной фиксации взора.

Время появления и прогрессирования первых признаков АК вариабельно [4], наименьший описанный возраст обнаружения признаков периферического помутнения роговицы равен 14 мес [20]. В нашей работе впервые была выполнена ЛСКМ и ОКТ лимбальной зоны у детей и подростков с ВА 4, 10 и 14 лет. Клинически у них определялась I стадия АК, однако ни в одном случае ЛПФ обнаружить не удалось. Морфологически у части детей наблюдалась инвазия в роговицу конъюнктивальной ткани в виде небольших островков, встречались единичные бокаловидные клетки (см. рис. 7).

У детей, несмотря на отсутствие явных прогениторных структур и нарушение барьерной функции лимба, состояние роговицы долгое время остается компенсированным. Причина подобной стабильности до конца непонятна и не соответствует скорости развития роговичных изменений при НЛСК другой этиологии (последствия химического ожога, синдром Стивенса—Джонсона, глазной рубцовый пемфигоид). В ходе своего исследования мы наблюдали 2 пациентов в возрасте 43 лет (15) и 51 года (10С) с отсутствием лимбальных прогениторных структур по данным ЛСКМ и длительно сохраняющейся I стадией А.К. Результаты статистического анализа также не подтвердили корреляции между стадией АК и возрастом пациентов (r_S=0,169, р=0,174). Механизм сдерживающего воздействия, который препятствует распространению циркулярного периферического помутнения в центральные отделы роговицы при АК и поддерживает прозрачность оптического центра на протяжении нескольких лет, в настоящее время до конца не изучен. Возможно, он связан с существованием небольшого количества ЛСК, которые, несмотря на разрушение лимбальных ниш, способны выживать и давать начало эпителиальным клеткам роговичного фенотипа [21].

В данной работе впервые была проведена оценка информативности и согласованности результатов диагностики ЛПФ, выполненной методами ЛСКМ и ОКТ у пациентов с АК. ЛСКМ является важнейшим клиническим диагностическим методом, позволяющим прижизненно изучать клеточную морфологию глазной поверхности, в особенности всех слоев роговицы, конъюнктивы и лимба. Ее проведение необходимо для диагностики НЛСК. Однако ЛСКМ не всегда выполнима у пациентов с В.А. Ограничения применения метода связаны с контактностью процедуры, необходимостью использования местных анестетиков, наличием выраженного птоза, нистагма, длительностью и сложностью ее осуществления у детей. В то же время ОКТ переднего отрезка глаза позволяет визуализировать ЛПФ, лимбальные сосудистые аркады, суббазальные нервные сплетения [9, 22], выступая в качестве альтернативного метода диагностики.

В предыдущих сообщениях была показана высокая степень согласованности результатов визуализации ЛПФ методом ОКТ и ЛСКМ у здоровых пациентов и на кадаверных глазах [9, 23, 24]. В отличие от монопольных снимков ЛСКМ, панорамное изображение ОКТ верхнего или нижнего лимба позволяет получать представление о протяженности, форме, рисунке ЛПФ и ФСП. Обзорность и быстрота получаемых снимков, бесконтактность процедуры, повторяемость результатов исследования, возможность применения у детей и регистрации клинических данных делают ОКТ привлекательным методом для динамического контроля лимбальных структур. Высокое качество получаемого изображения позволяет сравнивать идентичные участки на снимках ЛСКМ и ОКТ и наблюдать зоны интереса в дальнейшем.

Основываясь на высокой степени корреляции результатов ЛСКМ и ОКТ, выявленной у здоровых лиц [9], мы применили данные диагностические методы у пациентов с А.К. Так, во всех случаях обнаружения интактных ЛПФ по данным ЛСКМ характерный рисунок прогениторных структур хорошо определялся на панорамных снимках ОКТ. Однако чувствительность метода снижалась при визуализации измененных, укороченных ЛПФ, локализованных преимущественно в верхнем лимбе. ОКТ в режиме En Faсe у таких пациентов не позволяла с большой долей достоверности говорить о наличии ЛПФ, объясняя более низкую согласованность результатов для верхнего лимба. Во всех 4 случаях обнаружения частично сохранных ЛПФ в верхнем лимбе по данным ЛСКМ их контуры на снимках ОКТ либо нечетко визуализировались, либо были трудноотличимы от тени поверхностных кровеносных сосудов или глубжележащих волокон склеры в месте их корнеосклерального перехода. В отличие от ЛПФ верхней половины роговицы, частично деформированные, но более широкие и гиперрефлективные крипты нижнего лимба визуализировались лучше с помощью обоих методов исследования (см. табл. 2). По нашему мнению, снижение диагностической ценности ОКТ в обнаружении измененных деформированных ЛПФ верхнего лимба объясняется особенностями лимбальной архитектуры и структурной организацией ЛПФ в данной области.

В случае отсутствия лимбальных прогениторных структур использование ОКТ при АК также позволяет оценивать протяженность, площадь и размеры конъюнктивальных выростов, что дает возможность следить за их прогрессированием в дальнейшем. Наиболее важным лимитирующим фактором для ОКТ у пациентов с ВА является наличие нистагма, величина и размах которого в некоторых случаях не позволяют получать качественное изображение. В нашей работе по причине выраженных нистагмоидных движений глаз выполнение ОКТ было затруднено в 15% случаев, ЛСКМ — в 8,2%.

В настоящее время на основе данных ЛСКМ доказана корреляция между толщиной корнеального и лимбального эпителия и выраженностью НЛСК [25]. Однако измерение слоев роговицы с использованием конфокальной микроскопии требует большой аккуратности и прецизионности в связи с небольшой толщиной эпителиального слоя. Результаты таких измерений демонстрируют плохую повторяемость [26], вероятность получения корректных измерений у пациентов с АК еще более снижается в связи с наличием у большинства из них выраженного нистагма. ОКТ в этой ситуации позволяет несколько раз провести диагностический протокол Pachymetry+CPwr с возможностью постоянного визуального контроля положения линии сканирования на роговице.

В своей работе мы впервые использовали данный протокол ОКТ для измерения ЦТР и ее эпителия у пациентов разных возрастных групп и с разными стадиями АК. ЦТР в любой стадии АК отличалась от возрастной нормы [27] с достоверной разницей (p<0,05) (см. табл. 4). В группе контроля ЦТР составила 552±17 μm, толщина эпителия — 54,6±2,7 μm, что соответствует данным литературы [28]. Несмотря на отсутствие клинических признаков НЛСК у пациентов с 0 стадией АК, толщина роговицы также превышала норму, а толщина эпителиального слоя в центральной зоне была несколько снижена. Значимая разница в ЦТР была отмечена только между 0 и III—IV стадиями АК (p<0,05), что объясняется формированием в поздних стадиях АК субэпителиальных помутнений и рубцов в центральной оптической зоне. Толщина эпителия по мере прогрессирования АК имела тенденцию к уменьшению, что является признаком выраженности НЛСК [25]. Полученные данные демонстрируют увеличение толщины роговицы за счет ее стромальной части, в то время как эпителиальный слой значительно меньше нормы. Причины увеличения объема стромы роговицы не объясняются дисфункцией эндотелиальных клеток, так как их плотность в глазах с ВА статистически не отличается от таковой у здоровых пациентов (см. табл. 3). Возможно, утолщение роговичной стромы связано с нарушением экспрессии гена РАХ6, приводящим к нарушению запрограммированного апоптоза кератоцитов, персистенции клеток и связанного с ними внеклеточного матрикса.

Анализ данных измерения плотности базальных и крыловидных клеток в центре роговицы в зависимости от стадии АК показал ее значимое снижение, начиная с I стадии. Уменьшение количества клеток роговицы го?