Эритроциты являются доминирующей частицей крови и определяют ее вязкость, микроциркуляцию, потенциал транспорта кислорода, а следовательно, и эффективность микроциркуляции [1]. Ввиду того что состояние гипоксии органов и тканей является важным механизмом в патогенезе хронической ишемии головного мозга (ХИМ), необходимо учитывать структурно-функциональные свойства эритроцитов, определяющие их кислородтранспортную функцию [2, 3]. Кроме того, известно, что нарушение реологических свойств эритроцитов является определяющим звеном в патогенезе микроциркуляторных расстройств у больных с цереброваскулярными заболеваниями [4].

Увеличение содержания холестерина (ХС) в мембранах эритроцитов играет существенную роль в патогенезе многих заболеваний, в том числе при цереброваскулярной патологии [5]. Огромное количество эритроцитов в кровотоке, бо́льшая адсорбционная поверхность, интенсивный обмен ХС между ними и плазмой крови создают мощный и быстро обменивающийся эритроцитарно-плазменный пул Х.С. Нарушения регуляции обмена ХС крови вследствие изменения состава и физической организации мембран эритроцитов могут приводить к возникновению гиперхолестеринемии, являющейся важным фактором риска ХИМ [6].

Реологические свойства эритроцита определяются состоянием мембраны клетки. Известно, что ведущей причиной изменений свойств мембраны эритроцита служит накопление в ней Х.С. Следствием этого процесса является нарушение вязкостно-эластических свойств мембран, способствующее развитию микрогемоконцентрации и, как следствие, тканевой гипоксии, что является одним из звеньев этиопатогенеза ХИМ [7, 8]. Все это побудило нас к изучению степени влияния общего ХС плазмы на электрокинетические свойства мембран эритроцитов.

Электрофизиологические характеристики мембраны позволяют судить об интенсивности метаболических процессов в эритроцитах, их энергообеспеченности, активности ферментных и транспортных систем, играющих важную роль в регуляции проницаемости эритроцитарных мембран. Метод микроэлектрофореза служит основным источником информации об электрическом заряде поверхностной мембраны циркулирующих в крови красных кровяных клеток и основан на прямо пропорциональной зависимости между величиной заряда поверхностной мембраны эритроцита и скоростью его перемещения в переменном электрическом поле [9].

Цель настоящего исследования — изучение влияния на электрокинетические свойства мембран эритроцитов общего ХС плазмы крови в условиях относительной нормы и при ХИМ.

Обследованы 95 пациентов с ХИМ. Группу сравнения составили 54 практически здоровых с нормальным уровнем артериального давления (АД), не имевших каких-либо неврологических нарушений.

Все пациенты были включены в исследование после письменного согласия и подробного обследования с оценкой выраженности когнитивных расстройств в структуре ХИМ. В работе использовали возрастную классификацию ВОЗ, согласно которой молодым считается возраст от 25 до 44, средним — от 45 до 59, пожилым — от 60 до 74, старческим — от 75 до 90 лет.

С целью оценки влияния общего ХС плазмы крови на электрокинетические свойства эритроцитов здоровые и пациенты с ХИМ, независимо от пола и возраста, были разделены на 2 подгруппы: здоровые с нормальным уровнем ХС плазмы крови на момент исследования по данным биохимического анализа крови («контроль ХС–», n=43) и здоровые с повышенным (>5,2 ммоль/л) уровнем ХС («контроль ХС+», n=13); пациенты с ХИМ с нормальным уровнем ХС плазмы крови («ХИМ ХС–», n=37) и пациенты с ХИМ с повышенным (>5,2 ммоль/л) уровнем ХС («ХИМ ХС+», n=58).

Материалом для исследований служили эритроциты периферической крови, которые получали стандартным способом, отмывая в растворе 0,3 М сахарозы. Электрокинетические показатели эритроцитов периферической крови оценивали с использованием экспресс-метода компьютерного микроэлектрофореза (МЭФ) на базе модуля аппаратно-программного комплекса (АПК) Биони-МЭФ («Весттрейд», Москва). Электрокинетические свойства эритроцитов оценивались по следующим параметрам: среднее значение амплитуды колебаний эритроцитов, доля неподвижных эритроцитов относительно общего количества клеток; гистограмма распределения эритроцитов по амплитудам (график); асимметрия гистограммы (численный показатель ее симметричности — индекс асимметрии); эксцесс гистограммы (численный показатель ее пирамидальности), электрофоретическая подвижность эритроцитов (ЭФПЭ). Показатели асимметрии и эксцесса позволяют оценить степень гетерогенности клеток по их размерам.

Статистическая обработка материала выполнена с помощью пакетов прикладных программ Microsoft Excel и Statistica 6.0 («StatSoft, Inc.», США). Применялись непараметрические методы анализа: сопоставление двух независимых групп по количественному признаку с использованием U-критерия Манна—Уитни; для выявления связи признаков применялся непараметрический корреляционный анализ по методу Спирмена. Данные представлены в виде средних значений и стандартного отклонения. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.

На первом этапе исследования изучали возрастные изменения анализируемых показателей. Так, с увеличением возраста был выявлен рост уровня ХС плазмы крови, что подтверждает прямая корреляционная связь (r=0,5, p<0,05, табл. 1). Следует отметить, что средние значения уровня ХС плазмы крови в контрольной группе у лиц молодого и среднего возраста находились в пределах нормы, у пожилых — на верхней ее границе, а в старческом возрасте превышали норму.

При анализе данных МЭФ в контрольной группе обнаружено, что по сравнению с обследуемыми молодого возраста у лиц среднего, пожилого и старческого возрастов процент неподвижных эритроцитов достоверно повышался соответственно в 1,4 (р=0,09), 2,4 (р=0,01) и 2,8 (р<0,01) раза. Средняя амплитуда колебаний эритроцитов у представителей старших возрастных подгрупп оказалась ниже показателей лиц молодого возраста в 1,5 раза (р<0,01). Также отмечалось возрастзависимое снижение уровня ЭФПЭ, что подтверждалось обратной линейной корреляцией (r= –0,52, p<0,0001, табл. 2).

У пациентов с ХИМ во всех возрастных подгруппах среднее значение ХС превышало норму. В группе пациентов с ХИМ уровень ХС у лиц пожилого возраста достоверно превышал показатель пациентов среднего возраста, причем при сравнении с соответствующей группой контроля статистически значимая разница показателя также определялась в подгруппах лиц среднего и пожилого возрастов (см. табл. 1). Анализ МЭФ-характеристик возрастных подгрупп пациентов не выявил достоверных изменений показателей между ними, характерных для контроля. Однако при сравнении с соответствующей группой контроля у пациентов среднего и пожилого возрастов отмечались достоверное увеличение доли неподвижных эритроцитов, снижение амплитуды колебания и уровня ЭФПЭ (р<0,05, табл. 3).

Следующим этапом исследования была оценка влияния общего ХС плазмы крови на электрокинетические свойства эритроцитов здоровых и пациентов с ХИМ независимо от пола и возраста. Усредненные показатели электрокинетических свойств мембран эритроцитов обследованных лиц представлены в табл. 4. Видно, что уровень ХС плазмы крови достоверно отличался в исследуемых подгруппах как в группе контроля, так и в группе пациентов (р<0,001). В то же время при сравнении уровней ХС в основной группе с группой контроля отмечено, что разница показателя у обследованных в подгруппах с нормальным значением ХС не имела достоверности, а у обследованных с высоким уровнем ХС в группе пациентов эта разница была выше показателя в группе контроля в 1,17 раза (р<0,01).

При анализе данных МЭФ выявлено, что и в условиях нормы, и в условиях ХИМ с увеличением уровня ХС отмечается рост доли неподвижных эритроцитов. В контрольной подгруппе лиц с нормальным уровнем ХС («контроль ХС–») процент неподвижных эритроцитов был выше показателя в подгруппе «контроль ХС+» плазмы крови в 1,2 раза.

Средняя амплитуда колебаний эритроцитов у здоровых в обеих подгруппах практически не имела различий. Установлено также, что у здоровых с ростом уровня ХС плазмы крови скорость перемещения эритроцитов в исследуемой среде снижалась: ЭФПЭ в подгруппе «контроль ХС+» оказалась ниже показателя в подгруппе «контроль ХС–» в 1,1 раза. При сравнительном анализе гистограмм амплитуд колебаний эритроцитов здоровых были обнаружены следующие особенности: в обеих подгруппах для гистограмм была характерна одна вершина с левосторонней асимметрией. При этом у лиц с нормальными показателями ХС («контроль ХС–») наблюдался правосторонний эксцесс, свидетельствующий о появлении в общем пуле красных клеток крови субпопуляции эритроцитов с высокой амплитудой колебаний. Диапазон был от 0 до 20 мкм (рис. 1, а). Среди эритроцитов лиц контрольной подгруппы с высоким ХС плазмы крови («контроль ХС+») выявлялась субпопуляция практически неподвижных клеток, что проявлялось левосторонним эксцессом: коэффициент Ex амплитуды колебаний в подгруппе «контроль ХС+» превышал соответствующий показатель в подгруппе «контроль ХС–» в 2 раза (р<0,05). Диапазон амплитуд красных клеток крови уменьшался до 13,12 мкм (см. рис. 1, б).

Для выявления зависимости биофизических параметров мембран эритроцитов от уровня ХС плазмы крови обследованных здоровых был проведен корреляционный анализ, который выявил прямую линейную статистическую связь уровня ХС плазмы с долей неподвижных эритроцитов (r=0,5, p<0,05) и обратную линейную корреляцию ЭФПЭ с уровнем ХС (r= –0,7, p<0,0001).

Анализ биофизических параметров эритроцитов крови пациентов с ХИМ показал, что, как и в группе контроля, с ростом уровня ХС плазмы крови увеличивалась доля неподвижных эритроцитов: в подгруппе пациентов с высоким уровнем ХС («ХИМ ХС+») процент неподвижных клеток оказался выше этого показателя в подгруппе пациентов с нормальным значением ХС («ХИМ ХС–») в 1,3 раза (р=0,3). Так же как и в контрольных подгруппах, средняя амплитуда колебаний эритроцитов у пациентов с ХИМ в исследуемых подгруппах практически не отличалась. При сравнении показателя доли неподвижных эритроцитов с показателями здоровых у пациентов с ХИМ процент неподвижных клеток был выше в подгруппах с нормальными и высокими значениями ХС соответственно в 2,0 (р<0,05) и 2,1 раза. Средняя амплитуда колебаний эритроцитов в обеих подгруппах контроля оказалась выше показателя соответствующей подгруппы пациентов с ХИМ в 1,4 раза (р<0,001). Уровень ЭФПЭ здоровых обеих подгрупп ХС– и ХС+ был достоверно выше показателя пациентов с ХИМ в 1,3 (р<0,05) и 1,1 раза (р<0,05) соответственно.

Гистограммы амплитуд колебаний эритроцитов в обеих группах пациентов имели 2 вершины распределения, более выраженные в подгруппе пациентов с повышенным уровнем ХС плазмы крови. В популяции эритроцитов пациентов с нормальным уровнем ХС в большинстве случаев (32%) амплитуда колебания составляла от 4,4 до 6,8 мкм, а в 14% случаев наблюдались практически неподвижные клетки (амплитуда от 0 до 2 мкм). Так же как и у здоровых с нормальным уровнем ХС, в подгруппе «ХИМ ХС–» отмечался правосторонний эксцесс, указывающий на наличие субпопуляции более подвижных эритроцитов. Диапазон амплитуд колебания эритроцитов составлял от 0 до 21,43 мкм (рис. 2, а). В подгруппе пациентов с повышенным уровнем ХС увеличивалось количество практически неподвижных клеток (до 20%), диапазон амплитуды колебания эритроцитов уменьшался до 14 мкм. Для гистограммы была характерна правосторонняя асимметрия (см. рис. 2, б).

Выявленная возрастная динамика общего ХС плазмы крови согласуется с данными литературы: повышение уровня ХС плазмы крови, а также триглицеридов и коэффициента атерогенности отмечаются у пациентов с разными вариантами ХИМ [10].

Таким образом, характер возрастзависимого изменения уровня ХС плазмы крови и биофизических параметров мембран эритроцитов в условиях относительной нормы (линейное повышение ХС было сопряжено с увеличением доли неподвижных клеток, снижением амплитуды колебания и ЭФПЭ) позволяет сделать вывод, что возрастные перестройки мембранных свойств красных клеток крови происходят в том числе и под действием ХС плазмы. Выявленная динамика изменения уровня ХС в условиях развития цереброваскулярной патологии также была ассоциирована с характером изменения электрокинетических свойств мембран эритроцитов, причем более выраженные изменения наблюдались у пациентов среднего и пожилого возраста. Отсутствие достоверных изменений электрокинетических свойств мембран эритроцитов у пациентов старческого возраста можно рассматривать как адаптивную реакцию крови в условиях развития патологического процесса. Считается, что увеличение уровня ХС неблагоприятно сказывается на динамических свойствах липидов мембран, так как он способствует повышению микровязкости мембраны благодаря своему влиянию на подвижность жирнокислотных «хвостов» липидного окружения. Накопление ХС в бислое может приводить к ингибированию процессов пероксидации структурированных липидов за счет ограничения молекулярной подвижности жирнокислотных остатков фосфолипидного бислоя, что в свою очередь способствует поддержанию необходимой жесткости мембраны ХС. В этом случае ХС выступает в роли структурного антиоксиданта и делает фосфолипидные молекулы более устойчивыми к действию свободных радикалов [11].

В целом при увеличении уровня ХС плазмы крови вне зависимости от возраста и пола обследованных лиц как у здоровых, так и при ХИМ отмечались рост доли неподвижных эритроцитов, а также возрастание качественной гетерогенности эритроцитов по амплитуде колебаний. Полученные результаты демонстрируют наличие связи изменения уровня ХС плазмы крови с биофизическими параметрами эритроцитов. Это обстоятельство становится объяснимым в свете строения мембраны эритроцита, в состав которой входят липиды и белки. Липиды, участвующие в формировании мембраны эритроцита, распределены между наружным и внутренним листками ее бислоя неравномерно. Асимметрия мембраны по фосфолипидному составу и неодинаковое сродство ХС к фосфолипидам являются предпосылками для неравномерного распределения холестерина как между наружными и внутренними монослоями, так и в пределах каждого листка бислоя. Состояние и свойства липидов являются важными факторами регуляции пластичности мембраны и процессов ее проницаемости. Особое значение отводится ХС, составляющему 22,2% от всех липидов мембраны [12]. Оказывая влияние на плотность упаковки и подвижность «хвостов» мембранных липидов, ХС способствует в одних случаях уплотнению, в других — разжижению липидной части мембраны. Именно поэтому нарушение холестеринового обмена является одним из ведущих факторов развития ряда заболеваний.

Считается, что одной из причин повышения содержания ХС в мембране эритроцита при патологии является деградация фосфолипидного состава. В результате повышенной активности свободнорадикального окисления происходит разрушение фосфолипидных молекул, вследствие чего уменьшается их содержание в мембране, замещаясь на молекулы ХС [13]. В кровотоке постоянно происходит обмен липидными компонентами между мембраной эритроцитов и плазменными липопротеидами, причем ХС переходит в мембрану от липопротеидов очень низкой и низкой плотности, откуда возможно его включение в состав липопротеидов высокой плотности. Тем самым формируется равновесная система липопротеидов и плазмалеммы красных клеток крови, участвующая в регуляции структурного состояния последних [14]. Изменение соотношения липопротеидовых комплексов приводит к нарушению равновесия миграции ХС, при этом значительное превалирование количества липопротеидов атерогенных классов над содержанием липопротеидов высокой плотности создает условия для преимущественного поступления ХС в мембраны эритроцитов.

Накопление ХС в свою очередь приводит к снижению текучести мембраны, нарушению ее проницаемости и значительному возрастанию микровязкости, увеличению агрегационной способности эритроцитов, изменению активности различных ферментных систем мембраны, определяющих нормальное функционирование красных клеток крови [15]. Результатом нарушения мембранных свойств является также повышение ригидности мембраны и снижение скорости переноса газов. Встраивание Х.С. в мембрану эритроцита приводит к увеличению их размеров, изменению формы клеток, воздействует на рецепторный аппарат, снижает подвижность клетки в электрическом поле, что резко нарушает фильтрационную способность [16].

В заключение можно сказать, что изменения биофизических параметров крови, выявленные в настоящем исследовании как в условиях относительной нормы, так и при ХИМ, подтверждают имеющиеся данные о влиянии ХС на мембранные свойства эритроцитов при различной патологии. Регистрация тонких изменений мембраны эритроцитов, обусловленных различными воздействиями, предоставляет возможность решения задач ранней диагностики и профилактики многих заболеваний, в том числе и ХИМ, так как патоморфогенез болезни от субклеточного до органного уровней протекает несинхронно с существенным опережением субклеточных и клеточных изменений. Поэтому стабильность биофизических параметров мембран эритроцитов может быть использована в качестве диагностического и прогностического теста при цереброваскулярной болезни.