Болезнь Паркинсона (БП), занимающая по частоте второе место в ряду нейродегенеративных заболеваний, по-прежнему остается неизлечимой. Разработка эффективной терапии осложняется вследствие того, что моторные нарушения (тремор покоя, бради- и олигокинезия, мышечная ригидность), служащие обоснованием для постановки диагноза, проявляются только через десятилетия после начала заболевания, когда гибель дофаминергических нейронов черной субстанции и снижение уровня дофамина в стриатуме уже необратимы [1, 2]. Нейродегенеративный процесс при БП охватывает несколько структур головного мозга и затрагивает периферическую нервную систему [3], приводя к появлению немоторных симптомов болезни [4, 5]. До 80—90% пациентов с БП имеют расстройства сна и поведения [6—10], которые могут быть представлены бессонницей, фрагментацией сна, повышенной дневной сонливостью, парасомнией в виде парадоксального сна без мышечной атонии (rapid eye movement sleep behavioral disorder — RBD), а также кошмарными сновидениями, сноговорением, ночными галлюцинациями. Тем не менее вопрос о том, какие нарушения сна могут рассматриваться в качестве ранних маркеров БП, к настоящему моменту остается дискуссионным [8].

Имеющиеся на сегодняшний день способы лечения БП направлены главным образом на коррекцию возникающего в головном мозге нейрохимического дисбаланса и общее улучшение качества жизни пациентов [11], однако эффективность этого подхода достаточно ограничена [12]. Поскольку именно на начальной стадии БП нейропротективная терапия наиболее действенна, первостепенной задачей для неврологов и физиологов является поиск комплекса надежных маркеров для ранней диагностики заболевания [8, 13]. Следовательно, особое внимание должно быть уделено созданию адекватных моделей доклинической стадии БП у животных.

Ранее разработаны модели доклинической стадии БП у крыс среднего возраста (6—7 мес) [1, 14, 15], основанные на применении лактацистина — специфического ингибитора убиквитин-протеасомной системы (УПС). УПС в норме обеспечивает избирательную деградацию аномальных и поврежденных белков [16], в том числе олигомеров альфа-синуклеина, накопление которого в клетках сопровождается массовой гибелью нейронов при Б.П. Согласно современным представлениям о молекулярных механизмах патогенеза БП, нарушение работы УПС вносит значительный вклад в развитие заболевания [17—19]. Локальное введение лактацистина в черную субстанцию вызывает увеличение парадоксального сна как немоторного признака БП [14], а его интраназальное введение приводит к увеличению переходного состояния дремоты и спокойного бодрствования со сниженной сократительной активностью мышц у взрослых крыс [15, 20]. Моторные дисфункции при этом не обнаруживаются, что характерно для доклинической стадии БП [21].

Поиск ранних маркеров БП осложняется тем, что болезнь возникает, как правило, при старении организма, и ее развитие сопровождается утяжелением многих немоторных симптомов, характерных для стареющего мозга. В связи с этим цель настоящего исследования состояла в том, чтобы изучить изменения временных характеристик состояний суточного цикла сон—бодрствование и суммарной двигательной активности в каждом из этих состояний у старых крыс в модели доклинической стадии БП.

Экспериментальная работа проведена на крысах-самцах популяции Вистар возрастом 19—20 мес и массой тела 400—450 г. Полисомнографическое исследование выполнено на 7 животных, биохимическое — на 14 животных. Животных содержали в свето- и звукоизолированной экспериментальной камере при температуре окружающей среды 22±1 °С, фотопериоде 12/12 ч (5:00—17:00 — свет) и свободном доступе к воде и пище. До начала эксперимента крыс адаптировали к условиям камеры в течение 2 нед. Все экспериментальные процедуры с животными были проведены с соблюдением биоэтических правил, предъявляемых этической комиссией ИЭФБ РАН.

Моделирование доклинической стадии БП. Для приближения к длительным срокам развития БП у человека была выбрана пролонгированная модель доклинической стадии БП, основанная на двукратном интраназальном введении лактацистина («Enzo Life Sciences», США) [15]. Лактацистин в дозе 125 мкг, растворенный в 10 мкл апирогенного фосфатного буфера (0,1 М, pH 7,4), вводили крысам в каждую ноздрю дважды с интервалом 7 сут. Таким образом, суммарная доза лактацистина составила 500 мкг для каждого животного.

Регистрация и анализ состояний бодрствования и сна. Компьютерная регистрация полисомнограмм осуществлялась в условиях свободного поведения животных с помощью телеметрического оборудования Dataquest A.R.T. System (DSI, США). Под общим наркозом (золетил, 70 мг/кг, внутримышечно) крысе вживляли подкожно телеметрический модуль 4EТ (DSI, США) для регистрации электроэнцефалограммы (ЭЭГ), электроокулограммы глазных мышц (ЭОГ), электромиограммы (ЭМГ) мышц шеи, температуры тела. Регистрацию электрофизиологических показателей начинали через 10—14 сут после проведения операции; суточные записи проводили непрерывно в течение 24 ч, начиная с темной фазы суток (17:00—05:00). Контрольные записи выполняли через 1 нед после введения фосфатного буфера (n=7), экспериментальные записи у тех же животных регистрировали через 13—14 сут (2 нед) и 20—21 сут (3 нед) после первого введения лактацистина. Идентификацию состояний цикла сон—бодрствование и количественный анализ данных проводили с использованием программы Sleep_Pro (DSI, США). При обработке данных анализировали временные характеристики (общее время, длительность и число эпизодов) состояний бодрствования, дремоты, медленноволнового и парадоксального сна. Амплитудно-частотные характеристики ЭЭГ вычисляли с помощью быстрого преобразования Фурье. Эпоха анализа всех показателей составляла 10 с; для каждого из состояний рассчитывали среднее значение исследуемых показателей за 12 ч темной (активной) и светлой (неактивной) фаз суток и 24 ч.

Анализ двигательной активности в цикле сон—бодрствование. Параллельно с телеметрической записью полисомнограмм регистрировали двигательную активность животных с помощью видеокамеры с инфракрасной подсветкой. Для оценки этого параметра применялся разработанный в среде MatLAB алгоритм, автоматически детектирующий движения с временным разрешением 1 с. Движения разделялись на 4 типа в зависимости от площади двигающегося фрагмента относительно общей площади животного в кадре в соответствии со следующими порогами: I тип (движение 0,1—1% от общей площади тела животного) — мелкие, преимущественно фазические движения отдельных частей тела и головы, моргания глаз; II тип (1—10%) — выраженные движения отдельных конечностей или хвоста, вздрагивания головы; III тип (10—40%) — одновременное движение нескольких конечностей, значительные движения головы или всего тела животного; IV тип (40—100%) — движение всего тела животного, в основном связанное с перемещением по клетке. Далее с помощью программы Sleep_Pro данные видеорегистрации синхронизировались с полисомнограммой с точностью 1 с. Использование этой методики позволило впервые определить изменения суммарной двигательной активности (сумма всех 4 типов движений) в модели доклинической стадии БП у крыс во всех состояниях цикла сон—бодрствование.

Определение содержания дофамина выполнено на отдельной группе животных, которых декапитировали на 21-е сутки после первого введения лактацистина (опытная группа, n=7) или его растворителя — фосфатного буфера (контрольная группа, n=7). Головной мозг извлекали, из правой половины мозга выделяли дорсальный стриатум. Образцы ткани взвешивали, охлаждали в жидком азоте и хранили при температуре ‒70 °С. Содержание дофамина в гомогенате клеток дорсального стриатума определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией на хроматографе LC-20 («Shimadzu», Япония) с использованием обращенно-фазовой колонки (длина алкильной цепи C18). Определение концентрации дофамина проводили с помощью метода внешнего стандарта при потенциале +0,70 В и выражали в нг/мг белка. Состав подвижной фазы: 75 мМ фосфатный буфер, содержащий 2 мМ лимонной кислоты (pH 4,6), 0,1 мМ октансульфоновой кислоты и 15% ацетонитрила (V/V). Скорость элюции подвижной фазы составляла 0,8 мл/мин.

Статистическая обработка. С учетом характера распределения данных, изменения в характеристиках цикла сон—бодрствование оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна—Уитни. Для анализа биохимического показателя применяли t-критерий Стьюдента для двух независимых выборок с неравными дисперсиями. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0.05.

Анализ данных, полученных с помощью суточной телеметрической регистрации полисомнограмм, не выявил изменений в общем времени, числе и длительности эпизодов медленноволнового сна, парадоксального сна и бодрствования у старых крыс в модели доклинической стадии БП (рис. 1).

Изменения относительной спектральной плотности ЭЭГ в дельта-диапазоне в эпизодах медленноволнового сна у старых крыс в модели доклинической стадии БП оказались разнонаправленными. У 2 животных с исходно выраженным преобладанием волн дельта-диапазона в медленноволновом сне отмечено незначительное снижение этого показателя. Однако у большинства (70%) старых крыс, характеризующихся изначально пониженным уровнем дельта-волновой активности, относительная спектральная плотность в дельта-диапазоне в медленноволновом сне увеличивалась в период с 13-х по 21-е сутки после введения лактацистина (на 10% относительно контрольного уровня, р<0,05). В те же сроки после первого введения лактацистина изменений в значениях тонуса шейных мышц в состояниях сна и бодрствования и в суточных ритмах температуры тела у старых крыс не выявлено.

При оценке с помощью методики видеорегистрации изменения в уровне суммарной двигательной активности у старых крыс (рис. 2)

Изменения суммарной двигательной активности через 21 сут после первого введения лактацистина оказались сопряженными с развитием дефицита дофамина в дорсальном стриатуме. Согласно полученным данным, содержание дофамина в стриатуме снижается на 48% (р<0,05) по сравнению с контрольным уровнем: от 129±8,3 нг/мг белка в контроле до 67±2,1 — в эксперименте.

Согласно современным представлениям о молекулярных механизмах патогенеза БП, большой вклад в нейродегенеративный процесс вносят дисфункция УПС и, как следствие, накопление аномальных белковых молекул и нейротоксических агрегатов белка α-синуклеина [1, 8, 17—19]. В настоящей работе для моделирования доклинической стадии БП у старых животных впервые применен разработанный ранее протокол интраназальной доставки в мозг природного ингибитора протеасомной системы лактацистина [15]. Двукратное введение лактацистина и увеличение периода наблюдения за животными до 3 нед после первого введения позволило исключить острые эффекты препарата и приблизить сроки развития доклинической стадии БП в модели на животных к длительным срокам развития заболевания у человека [14, 15]. Ранее при моделировании БП у взрослых (6—7 мес) крыс по такой схеме показано, что морфологические и функциональные изменения в нигростриатной системе соответствуют доклинической стадии и не сопровождаются появлением моторных феноменов, характерных для клинической стадии БП [21]. Помимо основных патоморфологических признаков, данная модель воспроизводит у взрослых крыс симптомы нарушений сна, тревожноподобного поведения и когнитивных функций на начальном этапе нейродегенерации в модели БП [15, 20, 22].

При анализе данных полисомнографии у старых крыс в модели доклинической стадии БП впервые выявлено повышение представленности дремоты, особенно выраженное в темное время суток, которое для крыс является активной фазой. Сходные изменения найдены и у взрослых животных [15, 20] и могут рассматриваться как ранний немоторный признак, который соответствует повышенной дневной сонливости у пациентов с БП, встречающейся с частотой от 12—15 [23, 24] до 50 [25, 26] и 85% [27] в зависимости от возраста и стадии заболевания.

В отличие от взрослых крыс [15, 20], у старых животных после введения лактацистина не происходило достоверного снижения общего времени медленноволнового сна и увеличения числа его более коротких эпизодов, которое свидетельствовало бы об усилении фрагментации сна. Различия между взрослыми и старыми крысами в модели доклинической стадии БП отражались также на спектральных характеристиках медленноволнового сна. У взрослых крыс после введения лактацистина дельта-волновая активность в медленноволновом сне и представленность глубокого медленноволнового сна отчетливо снижались по сравнению с контролем [20], а у 70% старых крыс наблюдалось предположительно компенсаторное усиление дельта-волновой активности, указывающее на увеличение глубокой фазы медленноволнового сна. Наличие возрастных особенностей при моделировании БП показывает важность разработки адекватных моделей для исследования механизмов патогенеза и поиска ранних признаков заболеваний, ассоциированных со старением.

С помощью новой методики видеорегистрации определены изменения суммарной двигательной активности у старых крыс в течение каждого состояния в суточном цикле сон—бодрствование. Впервые выявлено ее выраженное уменьшение в эпизодах дремоты и медленноволнового сна и менее выраженное — в бодрствовании. Изменения в эпизодах медленноволнового сна были обнаружены раньше остальных — уже на 13—14-е сутки после введения лактацистина. Увеличение дремоты и уменьшение суммарной двигательной активности оказались сопряжены с падением содержания дофамина в дорсальном стриатуме на 48%, что соответствует его уровню в доклинической стадии БП по сравнению с уровнем падения дофамина на 60—70% в клинической стадии [28, 29]. Дисфункция дофаминергической нигростриатной системы при моделировании доклинической стадии БП у крыс при старении может являться причиной снижения суммарной двигательной активности в состояниях сна и бодрствования.

На основе полученных данных сделан вывод, что возрастание дремоты и снижение суммарной двигательной активности в состояниях суточного цикла сон—бодрствование, отражающие доклинический дефицит дофамина в нигростриатной системе, являются ранними предвестниками развития моторных дисфункций, характерных для клинической стадии Б.П. Эти показатели могут быть рекомендованы для апробации в клинических исследованиях как ранние незатратные маркеры доклинической стадии БП.

Исследование поддержано грантом Российского научного фонда (проект № 16−15−00278).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: pastukh36@mail.ru