Исследование нейроиммунных взаимодействий является перспективным направлением в изучении патогенеза рассеянного склероза (РС) [1]. Дофамин является прямым медиатором этого взаимодействия и участвует в иммунорегуляции при РС путем модуляции функций клеток как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа [1, 2]. Наибольшее внимание привлекает влияние дофамина на Th17-иммунный ответ, который имеет важное патогенетическое значение при РС [3]. Недавние исследования показали потенциальную возможность модулировать индуцируемый дендритными клетками Th17-иммунный ответ путем воздействия на D₁-рецепторы дофамина при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите у животных [4—6]. В то же время влияние антагонистов D₁-рецепторов дофамина на продукцию Th17-цитокинов непосредственно T-клетками больных РС мало изучено. Цель настоящего исследования — изучить влияние блокады D₁-рецепторов дофамина на продукцию интерлейкина-17 (ИЛ-17) и интерферона-γ (ИФН-γ) мононуклеарными клетками периферической крови (МНКПК), а также CD4⁺ T-клетками больных РС и здоровых доноров in vitro.

Материал и методы

Проведено комплексное клиническое и иммунологическое обследование 41 больного (26 женщин и 15 мужчин) в возрасте от 23 до 47 лет с диагнозом «ремиттирующий РС» по критериям МакДональда в модификации 2017 г. [7]. Длительность заболевания на момент включения в исследование составляла от 1 года до 10 лет. Все больные получали терапию препаратом глатирамера ацетат >9 мес. Все пациенты находились в стадии клинической ремиссии (>6 мес). Всем пациентам проводился стандартный неврологический осмотр с оценкой уровня инвалидизации по шкале Expanded Disability Status Scale (EDSS) [8]. На момент забора крови все исследуемые больные >6 мес не получали лечение глюкокортикостероидной терапией или терапией антидепрессантами (16 пациентам, находящимся в стадии обострения, глюкокортикостероидная терапия была проведена после забора крови). Контрольную группу составили 25 условно здоровых доноров (16 женщин и 9 мужчин). Группы были сопоставимы по полу и возрасту. Клинико-демографические характеристики больных РС и группы здоровых доноров представлены в табл. 1.

Таблица 1. Клинико-демографические характеристики больных РС и здоровых доноров. Представлено значение медианы, в скобках — 25-й и 75-й процентили

Примечание. * — на момент включения в исследование.

Все больные подписали информированное согласие на участие в данном исследовании. Проведение исследования было одобрено этическим комитетом Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова (протокол №192).

Для определения функциональной активности Th17-клеток из венозной крови (взятой в утренние часы в пластиковую пробирку с гепарином) выделяли МНКПК путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина («ПанЭко», Россия), трижды отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ, Ph=7,3) и ресуспендировали в культуральной среде RPMI 1640 («ПанЭко») с добавлением 2 mM L-глутамина («ПанЭко») и 2% донорской AB сыворотки («PAA», Австрия). Затем из части образцов МНКПК методом иммуномагнитной сепарации (негативная селекция, «Miltenyi Biotec», Германия) выделяли CD4⁺ T-клетки. Согласно данным многоцветной проточной цитометрии, чистота выделения CD4⁺ T-клеток составляла >95%.

Затем образцы МНКПК и CD4⁺ T-клеток в количестве 8·10⁴ в 200 мкл на лунку вносили в 96-луночный круглодонный планшет («SPL», Республика Корея) и стимулировали микрочастицами, покрытыми анти-CD3/анти-CD28-антителами («Life Technologies», Норвегия). Для оценки влияния дофамина, а также блокады D₁-рецепторов дофамина на функции Th17-клеток образцы МНКПК и CD4⁺ T-клеток стимулировали в присутствии дофамина («Sigma», США), антагониста D₁-рецепторов дофамина (SCH23390, «Sigma», США) или совместно (предварительное инкубирование в присутствии SCH23390 с последующим внесением дофамина) в конечной концентрации 10^—5 М, после чего образцы клеток стимулировались анти-CD3/анти-CD28-микрочастицами [1]. Затем образцы инкубировали 72 ч в CO₂-инкубаторе, после чего отбирали супернатант и замораживали при –70 °C.

Уровни спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-17 и ИФН-γ в супернатантах клеточной культуры определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для измерения концентрации цитокинов использовали наборы фирмы «Invitrogen» (США). Уровни аналитов выражали в пг/мл или процентах по отношению к стимулированной продукции цитокинов в отсутствие дофамина или антагониста D₁-рецепторов дофамина.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Prizm 6. Для оценки различий двух групп использовались непараметрический U-критерий Манна—Уитни или знаковый ранговый критерий Уилкоксона. Для множественных сравнений использовали односторонний дисперсионный анализ с последующей поправкой по критерию Бонферрони. Статистически значимыми различия считались при p<0,05.

Результаты

По данным ИФА, анти-CD3/CD28-стимулированная продукция ИЛ-17 и ИФН-γ МНКПК больных РС в стадии обострения была достоверно выше, чем у больных РС в стадии клинической ремиссии или в контрольной группе (табл. 2). При этом стимулированная продукция цитокинов МНКПК больных РС в стадии ремиссии и здоровых доноров была сопоставима (см. табл. 2). Стимулированная продукция ИЛ-17 и ИФН-γ CD4⁺ T-клетками больных РС в стадии ремиссии и здоровых доноров также была сопоставима (табл. 3). Дофамин в конечной концентрации 10^–5 М оказывал достоверный ингибирующий эффект на продукцию цитокинов как МНКПК, так и CD4⁺ T-клетками во всех группах (рис. 1), не оказывая при этом влияния на пролиферативный ответ согласно данным реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) (данные не представлены). Предварительная блокада D₁-дофаминовых рецепторов специфическим антагонистом SCH23390 не влияла на ингибирующий эффект дофамина на продукцию цитокинов как МНКПК, так и CD4⁺ T-клетками больных РС и здоровых доноров (рис. 2). Блокада D₁-дофаминовых рецепторов (без последующего внесения дофамина) подавляла продукцию ИЛ-17 и ИФН-γ МНКПК и CD4⁺ T-клетками в обеих группах (рис. 3), не оказывая влияния на клеточную пролиферацию согласно результатам РБТЛ (данные не представлены).

Таблица 2. Продукция ИЛ-17 и ИФН-γ мононуклеарными клетками периферической крови больных РС и здоровых доноров. Представлено значение медианы, в скобках — 25-й и 75-й процентили

Примечание. * — достоверное отличие от больных РС в стадии ремиссии и группы здоровых доноров с p<0,05 (Манн—Уитни U-тест).

Таблица 3. Продукция ИЛ-17 и ИФН-γ CD4⁺ T-клетками больных РС и здоровых доноров. Представлено значение медианы, в скобках — 25-й и 75-й процентили*

Примечание. * — не выявлено достоверного отличия между группами (Манн—Уитни U-тест).

Рис. 1. Влияние дофамина на продукцию ИЛ-17 и ИФН-γ МНКПК (а и б) и CD4⁺ T-клетками (в и г) больных РС и здоровых доноров in vitro.

МНКПК или CD4⁺ клетки (в количестве 8·10⁴ в 200 мкл на лунку), полученные от больных РС и группы здоровых доноров, были активированы микрочастицами, покрытыми анти-CD3/анти-CD28 антителами, в присутствии/отсутствие дофамина в конечной концентрации 10^–5 М. После 72-часовой инкубации в CO₂-инкубаторе в супернатантах клеточной культуры определяли уровни стимулированной продукции ИЛ-17 и ИФН-γ методом ИФА. Значения представлены в виде медианы, 25-го и 75-процентиля (в процентах по отношению к анти-CD3/анти-CD28-стимулированной продукции цитокинов в отсутствие дофамина).

Рис. 2. Влияние антагониста D₁-рецепторов дофамина (SCH23390) на продукцию ИЛ-17 (а и б) и ИФН-γ (в и г) МНКПК больных РС и здоровых доноров in vitro.

МНКПК (в количестве 8·10⁴ в 200 мкл на лунку), полученные от больных РС и группы здоровых доноров, были активированы микрочастицами, покрытыми анти-CD3/анти-CD28 антителами в присутствии/отсутствие дофамина/SCH23390 в конечной концентрации 10^–5 М. После 72-часовой инкубации в CO₂-инкубаторе в супернатантах клеточной культуры определяли уровни стимулированной продукции ИЛ-17 и ИФН-γ методом ИФА. Значения представлены в виде медианы, 25-го и 75-процентиля (в процентах по отношению к анти-CD3/анти-CD28-стимулированной продукции цитокинов в отсутствие дофамина или SCH23390).

Рис. 3. Влияние антагониста D₁-рецепторов дофамина (SCH23390) на продукцию ИЛ-17 (а и б) и ИФН-γ (в и г) CD4⁺ T-клетками больных РС и здоровых доноров in vitro.

CD4⁺ T-клетки (в количестве 8·10⁴ в 200 мкл на лунку), полученные от больных РС и группы здоровых доноров, были активированы микрочастицами, покрытыми анти-CD3/анти-CD28 антителами в присутствии/отсутствие дофамина/SCH23390 в конечной концентрации 10^–5 М. После 72-часовой инкубации в CO₂-инкубаторе в супернатантах клеточной культуры определяли уровни стимулированной продукции ИЛ-17 и ИФН-γ методом ИФА. Значения представлены в виде медианы, 25-го и 75-процентиля (в процентах по отношению к анти-CD3/анти-CD28-стимулированной продукции цитокинов в отсутствие дофамина или SCH23390).

Обсуждение

Лечение больных РС остается одной из наиболее актуальных проблем современной неврологии [9]. Учитывая критическое патогенетическое значение T-хелперов 17-го типа в патогенезе РС, модуляция их функций является важной задачей патогенетической терапии. Практически все препараты, изменяющие течение РС (ПИТРС), прямо или опосредованно влияют на функции Th17-клеток [10]. В то же время важно отметить, что модуляция функций Th17-клеток в центральной нервной системе (ЦНС) ограничена, что связано с неспособностью многих ПИТРС проникать через гематоэнцефалический барьер [11].

Существование механизмов, позволяющих модулировать иммунный ответ в ЦНС, обсуждается длительное время. Исследования последних лет указывают на потенциальную способность подавлять нейровоспаление путем воздействия на рецепторы биогенных аминов. Немаловажным является участие биогенных аминов в регуляции оси «мозг—кишечная микробиота», которая также вовлечена в патогенез аутоиммунных заболеваний ЦНС [12, 13]. В связи с этим обсуждается перепрофилирование норадренергических, дофаминергических и серотонинергических препаратов с целью их применения в качестве патогенетической терапии РС [14—16].

Среди нейротрансмиттеров, участвующих в регуляции нейроиммунного взаимодействия, дофамин является наиболее изученным. Модулирующий эффект дофамина на функции Th17-клеток при РС на культуре МНКПК уже исследовался [3]. Результаты настоящего исследования в целом согласуются с ранее полученными данными. Важно, что дофамин способен подавлять продукцию провоспалительных цитокинов МНКПК больных РС, находящихся как в стадии клинической ремиссии, так и в стадии обострения (рис. 1). Кроме того, было установлено ингибирующее влияние дофамина на продукцию ИЛ-17 и ИФН-γ выделенными CD4⁺ T-клетками больных РС в стадии клинической ремиссии и здоровых доноров, что также подтверждает противовоспалительный эффект дофамина при РС (см. рис. 1).

Следует отметить, что используемая в исследовании концентрация дофамина in vitro (10^–5 М) является относительно высокой и не соответствует уровню дофамина в периферической крови. Однако в некоторых отделах ЦНС уровень дофамина может достигать 10^–3 М [17]. Кроме того, установленный в настоящем исследовании ингибирующий эффект дофамина на продукцию цитокинов как МНКПК, так и CD4⁺ T-клетками не сопровождался угнетением клеточной пролиферации. Рецепторы, опосредующие влияние дофамина на Th17-клетки, нуждаются в уточнении. В настоящее время выделяют пять типов рецепторов дофамина (D₁—D₅-рецепторы), которые подразделяются на две группы: D₁-подобные и D₂-подобные рецепторы. К D₁-подобным рецепторам относятся D₁- и D₅-рецепторы. Они сопряжены с G-белками семейства Gαs, которые активируют аденилатциклазу и приводят к увеличению уровня внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Напротив, D₂-подобные рецепторы, включающие в себя D₂-, D₃- и D₄-рецепторы, сопряжены с G-белками семейства Gαi и ингибируют аденилатциклазу, снижая уровень цАМФ [18]. Согласно данным литературы, T-хелперы способны экспрессировать все пять типов рецепторов дофамина [1].

В проведенном исследовании не было обнаружено влияния специфического антагониста D₁-подобных рецепторов (SCH23390) на ингибирующий эффект дофамина на продукцию ИЛ-17 и ИФН-γ стимулированными МНКПК (рис. 2) или CD4⁺ T-клетками (см. рис. 3) в группе как больных РС, так и здоровых доноров, что позволяет предположить участие D₂-рецепторов дофамина в опосредовании ингибирующего эффекта дофамина. На это также указывает и прямой ингибирующий эффект блокирования D₁-рецепторов дофамина на продукцию ИЛ-17 и ИФН-γ МНКПК (см. рис. 2) и CD4⁺ T-клетками (см. рис. 3). Полученные данные об ингибирующем эффекте антагониста D₁-рецепторов дофамина на продукцию провоспалительных цитокинов T-клетками согласуются с результатами других исследований. Так, в работе K. Nakano и соавт. [4] блокада D₁-рецепторов дофамина специфическим антагонистом SCH23390 подавляла индуцированный дендритными клетками Th17-иммунный ответ. Схожие результаты были получены при использовании других антагонистов D₁-рецепторов дофамина (SKF83566, LE300). Напротив, блокада D₂-рецепторов дофамина на дендритных клетках здоровых доноров усиливала индуцированную дендритными клетками продукцию ИЛ-17 CD4⁺ T-клетками. В экспериментах in vivo введение грызунам SCH23390 предупреждало развитие экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита. T-лимфоциты, выделенные из селезенки таких мышей, продуцировали меньшее количество ИЛ-17, чем клетки мышей контрольной группы [4]. В последующих исследованиях было показано, что у грызунов с выключенным D₅-рецептром дофамина (относится к D₁-подобным рецепторам дофамина) экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит развивается позже и протекает в более мягкой форме по сравнению с контрольной группой [5, 6].

Обнаружение ингибирующего эффекта блокады D₁-рецепторов дофамина на способность дендритными клетками индуцировать Th17-иммунный ответ является важным фактом, так как дендритные клетки могут локализоваться в ЦНС, а также мигрировать в глубокие шейные лимфатические узлы и презентировать антигены миелина [19]. В то же время о прямом ингибирующем эффекте блокады D₁-рецепторов дофамина на функции Th17-клеток, установленном в настоящем исследовании, ранее не сообщалось.

Молекулярные механизмы, объясняющие эффект активации/блокады рецепторов дофамина на функции Th17-клеток, до конца не ясны. В исследовании Y. Huang и соавт. [20] было установлено, что агонист D₂-рецепторов дофамина подавляет экспрессию фактора транскрипции Th17-клеток (ROR-γt), а также мРНК ИЛ-17 в конканаволин A-стимулированных лимфоцитах. При этом также было обнаружено снижение уровня экспрессии мРНК цАМФ, что подтверждает предположение о роли D₂-рецепторов дофамина в модуляции функций Th17-клеток. Эти данные согласуются с результатами проведенного ранее исследования, в котором было обнаружено положительное влияние агониста D₂-подобных рецепторов дофамина бромокриптина на течение экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита [21]. В то же время в клиническом исследовании бромокриптина при РС не было получено данных о его терапевтической эффективности [22]. Возможно предположить, что лечение дофаминергическими препаратами может быть более эффективно в качестве дополнительной терапии к ПИТРС первой линии (ИФН-β или глатирамера ацетат) [15]. В нескольких исследованиях было показано, что продукция катехоламинов стимулированными МНКПК снижена у больных РС, тогда как терапия ИФН-β в течение 6 мес нормализует эндогенную выработку катехоламинов [23, 24]. Вероятно, дальнейшие клинические исследования позволят уточнить значение дофаминергической терапии при РС.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №19-75-00075)

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.