Увеличение детской смертности и рост числа инвалидов вследствие черепно-мозговой травмы (ЧМТ) являются важнейшими проблемами медицины, имеющими значимые социальные и экономические аспекты. Основная причина этого кроется в массовости распространения ЧМТ и большом количестве неблагоприятных исходов, (высокий процент летальности и инвалидности), что требует длительного лечения и реабилитации [1—3]. ЧМТ включают в себя широкий спектр повреждений: очаговые, диффузно-аксональные; внутричерепные кровоизлияния и развитие вторичных нарушений. Первичное повреждение, связанное непосредственно с воздействием механических факторов, запускает различные патофизиологические механизмы и инициирует множественные биохимические и иммунологические деструктивные процессы в нейронах и глии, в значительной степени обусловленные развитием гипоксии и усугубляющие тяжесть поражения мозга [4]. В результате формируется порочный круг, который может стать определяющим в исходе ЧМТ. Механизмы, по которым развивается гипоксическое повреждение мозга, реализуются в результате сложного каскада патофизиологических процессов, конечным исходом которых является гибель нейронов и глиальных клеток [5, 6].
В последние годы внимание исследователей, занимающихся патофизиологией посттравматического периода, привлекает регуляция работы нейроваскулярной единицы — структурно-функционального комплекса, обеспечивающего работу гематоэнцефалического барьера и скоординированную активность нейронов, глии и эндотелия церебральных сосудов. Основные изменения при травматическом повреждении мозга происходят именно на его уровне [7]. Необходимо также учитывать, что ЧМТ одновременно запускает два противоположно направленных процесса, причем не только острых, но и отдаленных — дегенеративно-деструктивный и регенеративно-репаративный [8]. В связи с этим чрезвычайную важность приобретает разработка новых комплексных подходов к прогнозированию тяжести течения посттравматического периода и исходов ЧМТ у детей. Она должна основываться на выборе таких биохимических маркеров повреждения и репарации мозга, которые могут отражать структурно-функциональные изменения ключевых мишеней повреждения при ЧМТ. Такими мишенями могут быть функционально значимые белки: нейронспецифическая энолаза (NSE) [9—15], глиальный белок S100B [9—11, 14—22], рецепторы глутамата (GluRc) [5, 23—27], мозговой нейротрофический фактор (BDNF) [28—31]. В настоящей работе были проанализированы полученные нами данные об изменениях содержания указанных биохимических биомаркеров в крови детей в динамике посттравматического периода ЧМТ.
Цель исследования — определение содержания данных биомаркеров, обладающих диагностической и прогностической значимостью в оценке тяжести повреждения мозга у детей при ЧМТ.
Материал и методы
Были обследованы 177 детей с ЧМТ. Ее тяжесть оценивали в баллах по шкале комы Глазго (ШКГ): легкая — 13—15 баллов, средней тяжести — 9—12 баллов, тяжелая — 3—8 баллов. Согласно исходам ЧМТ по шкале исхода Глазго (ШИГ) все пациенты были разделены на группы: летальный исход (1-я группа); вегетативное состояние (2-я группа); тяжелая инвалидизация (3-я группа); инвалидизация средней тяжести (4-я группа) и полное восстановление (5-я группа). Дети, перенесшие легкую ЧМТ, как правило, выписывались из стационара с благоприятным исходом, т. е. в состоянии полного выздоровления.
В работе исследовали диагностическую значимость маркеров повреждения мозга: NSE, S100B, содержания аутоантител (аАТ) к рецепторам глутамата (типы АМРА и NMDA), аАТ к S100B (обозначенные как нАТ — естественные АТ), а также BDNF. Все показатели определялись в динамике на 1—3, 6—8, 14—15 и 20—23-й дни после травмы, а в отдельных случаях тяжелой ЧМТ и длительного пребывания пациентов в стационаре — также через 11—12 мес.
Концентрацию NSE и белка S100B в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом с помощью наборов фирмы «CanAg» (Швеция). В качестве нормальных величин использовали данные литературы [2, 9—11, 14—22], а также указанные фирмой-разработчиком нормативы и наши собственные неопубликованные данные, полученные при обследовании детей без неврологической и другой патологии внутренних органов. Верхней границей нормы для NSE считали 13 мкг/л, для S100B — 0,090—0,125 мкг/л cыворотки крови. Содержание нАТ к белку S100 В оценивали иммуноферментным методом, разработанным нами совместно с «ООО Герофарм»1. В качестве сорбента нАТ к S100B был использован химически модифицированный пептид, являющийся фрагментом человеческого белка S100B, состоящий из 15 аминокислотных остатков [32]. В качестве нормы нАТ использовали величины контрольных образцов («пулированный контроль», приготовленный из сыворотки крови здоровых людей). Содержание нАТ к S100B выражали в единицах оптической плотности (ЕОП) при λ=450 нм или в процентах от контрольных величин, принимаемых за 100. Верхней границей нормальных величин считали 0,085 ЕОП. Уровень аАТ к субъединице GluR
Содержание BDNF определяли в плазме крови иммуноферментным методом (диагностические наборы R&G Systems). В связи с большим разбросом величин BDNF в сыворотке и плазме крови проводили сравнение со средними значениями BDNF (4,137 нг/мл).
Полученные данные были статистически обработаны с помощью пакета программ Graf Prizm.
Результаты и обсуждение
Белок S100B является наиболее изученным маркером при нарушениях мозгового кровообращения и ЧМТ [9—11, 14—22]. Он синтезируется астроцитами в сером веществе мозга и олигодендроцитами в белом веществе [10, 18, 19]. Участие S100B в фосфорилировании белков обеспечивает внутриклеточную регуляцию передачи сигнала и таким образом поддерживает пластические процессы в ЦНС и Са2+-гомеостаз [32]. Увеличение содержания S100B в крови обнаружено при ишемическом инсульте, ЧМТ, субарахноидальном кровотечении, опухолях мозга, нейродегенеративных заболеваниях [9—11, 16—18, 20, 21, 32, 33]. В настоящее время этот маркер рассматривается как показатель целостности гематоэнцефалического барьера [15]. Мы изучили изменения в содержании S100B в крови у детей с различной степенью тяжести и различными исходами ЧМТ (табл. 1, рис. 1).
Анализ полученных данных показал, что уровень S100B повышался достоверно через 24 ч после ЧМТ независимо от ее тяжести. В дальнейшем (3—7-й дни) содержание S100B снижалось до контрольных величин или становилось ниже их. В случае полного восстановления неврологического статуса наблюдалось быстрое снижение концентрации S100B к 3-му дню после ЧМТ. Максимально повышенный уровень S100B отмечался у детей с летальным исходом ЧМТ. Обращает внимание, что у больных с сочетанной ЧМТ содержание S100B было примерно в 2 раза выше, чем с изолированной (табл. 2). Это связано прежде всего с тем, что S100B может образовываться в адипоцитах-, хондроцитах-, лимфоцитах, костном мозге, что вносит вклад в сывороточный пул белка S100B при повреждениях других тканей [2, 3, 18, 21]. Имеющиеся в литературе данные о роли этого белка и его диагностической значимости при ЧМТ у детей отличаются большой противоречивостью [20]. Так, например, было показано [21], что повышение содержания белка S100B в сыворотке крови лишь в 30% случаев соответствует данным КТ при ЧМТ у детей. Показано также [18], что у 48% детей с легкой ЧМТ без нарушения когнитивных функций в сыворотке крови наблюдалось увеличение концентрации S100B, что, скорее всего, свидетельствует об его участии в адаптационных процессах, развивающихся в ответ на стресс. Тем не менее многие авторы [10, 19, 20, 22] предполагают, что увеличенный уровень S100B в крови в 1-е сутки после ЧМТ может свидетельствовать о ее неблагоприятном исходе, что нашло подтверждение и в настоящей работе, так как наиболее высокий уровень белка S100B был обнаружен у больных с летальным исходом.
Таким образом, согласно представленным данным, белок S100B может быть предиктором неблагоприятных исходов ЧМТ у детей. Однако, как уже было отмечено выше, определение уровня белка S100B не указывает на его значимость при таких исходах тяжелой ЧМТ у детей, как тяжелая инвалидизация и вегетативный статус.
Учитывая значительный вклад аутоиммунного ответа в развитие патологических процессов при ЧМТ [7, 8, 34], мы предположили, что уровень нАТ к белку S100B может зависеть от тяжести повреждений мозга при ЧМТ. Исследование содержания нАТ к белку S100B в сыворотке крови детей, перенесших ЧМТ различной степени тяжести, было проведено нами в динамике при сопоставлении данных с концентрацией самого белка. Если уровень S100B у детей с ЧМТ снижался до контрольных величин и ниже уже к 3—5-му дню после ЧМТ и не зависел от тяжести повреждения мозга, то содержание нАТ к белку S100B, начиная с 6—7-го дня, увеличивалось пропорционально тяжести повреждения мозга (см. рис. 1). Причем чем тяжелее исход ЧМТ, тем больше подъем уровня нАТ к белку S100B. Обращает внимание, что если у больных при вегетативном статусе после ЧМТ уровень белка S100B был ниже нормы, то содержание нАТ к нему было достоверно повышено. Следовательно, у детей с ЧМТ необходимо определять не только содержание белка S100B, но и уровень нАТ к нему. Этот маркер отражает не только тяжесть ЧМТ, но и является предиктором ее неблагоприятных исходов.
NSE является димером цитоплазматического изофермента гликолитической энолазы, локализованной в центральных и периферических нейронах, а также нейроэндокринных клетках [12]. Измерения содержания NSE в сыворотке крови при ЧМТ выявили увеличение содержания этого белка [9, 10], причем имеются данные, что уровень NSE у детей с ЧМТ выше, чем у взрослых. Авторами указанных работ была высказана гипотеза, что у детей развивающийся мозг более чувствителен к гибели нейронов после ЧМТ, чем у перенесших травму мозга взрослых. Мы проанализировали полученные данные об изменениях уровня NSE у детей с ЧМТ (см. табл. 1). Как видно, аналогично динамике S100B через 24 ч после ЧМТ уровень этого фермента повышался, но к 3-му дню снижался до контрольного уровня. Степень повышения содержания NSE в сыворотке крови не во всех случаях коррелировала с тяжестью ЧМТ. Наибольшее увеличение концентрации NSE в посттравматическом периоде было обнаружено у умерших больных, что совпадает с данными A. Guzel и соавт. [13]. Таким образом, на основании полученных данных можно предположить, что крайне высокий уровень NSE является биомаркером только летальных исходов ЧМТ.
Как отмечалось выше, при ЧМТ наряду с первичным повреждением мозга в ответ на воздействие механических факторов развиваются вторичные повреждения, запускающие каскад патогенетических механизмов, приводящих в итоге к гибели нейронов в результате развития глутаматной эксайтотоксичности [4, 6]. В результате эксайтотоксичности происходит деградация ионотропных глутаматных рецепторов подтипов GluR1 (АМРА) и NR2 (NMDA) [23—25]. Пептидные фрагменты этих рецепторов проникают в общий кровоток из мозга, являющегося «забарьерным» органом для общей иммунной системы, и инициируют образование аАТ, содержание которых в крови увеличивается [23, 24, 26]. В цитируемых работах аАТ к рецепторам глутамата в основном определялись при инсультах и судорожных синдромах [5, 23, 26]. В настоящей работе, используя методические подходы, разработанные для указанных выше заболеваний, мы определили изменения в содержании двух типов аАТ — к GluR1 (АМРА) — и NR2 (NMDA)-подтипам глутаматного рецептора у детей с ЧМТ различной тяжести и различными исходами. Анализ данных показал, что в посттравматическом периоде в первые 10—15 дней происходит рост содержания аАТ во всех группах, при этом на протяжении всего периода наблюдения концентрация аАТ к NR2 (NMDA)-рецепторам была более высокой, чем к GluR1 (AMPA)-рецепторам глутамата (табл. 3). Результаты наших исследований подтверждаются данными, показывающими, что при эпилепсии в сыворотке крови отмечается повышенный уровень aАТ преимущественно к различным субъединицам АМРА-рецепторов [23], а при гипоксических/ишемических повреждениях мозга более выражено увеличение содержания аАТ к NR2-рецепторам [24, 25]. В то же время нами было показано, что низкий уровень содержания аАТ к рецепторам глутамата в 1-е сутки после тяжелой ЧМТ является прогностически неблагоприятным признаком. Так, в 1-й день после травмы мозга наименьший уровень аАТ к NR2 (NMDA)-рецепторам в сыворотке крови характерен для самой тяжелой группы детей — с летальными иcходами после ЧМТ (рис. 2). Аналогичные данные были получены С.А. Дамбиновой и соавт. [24, 25] у больных с инсультом.
Анализ литературы и наши собственные данные позволяют предположить, что увеличение концентрации аАТ к антигенам рецепторов мозга может иметь двойственный характер. С одной стороны, это может быть реакцией на повреждение соответствующих структур мозга, с другой — аАТ способны выполнять защитные функции [5, 34, 35]. Выявленное увеличение уровня аАТ к NR2-рецепторам у больных с благоприятным течением может указывать на компенсаторный характер изменений, направленный на блокаду рецептора глутамата и снижение его гиперстимуляции. Антитела могут «прикрывать» поверхностные структуры нейронов от лигандов, разрушающих структуру рецепторов, или способствовать активации систем внутриклеточной сигнализации, связанных с развитием компенсаторно-приспособительных реакций [27, 34]. Так, имеются экспериментальные данные, свидетельствующие о способности аАТ к рецепторам глутамата оказывать защитное действие при инсульте и эпилепсии [35]. В отдаленные сроки после ЧМТ у больных с неблагоприятным исходом наблюдались повторный подъем и волнообразное значительное повышение их концентрации. На основании этого можно предположить, что чрезмерно высокий уровень аАТ к NR2-рецепторам в отдаленном посттравматическом периоде отражает длительную гипоксию мозга после тяжелой ЧМТ.
Проведенные нами ранее экспериментальные и клинические исследования показали, что в стимуляции продукции аАТ к глутаматным рецепторам существенную роль играет оксид азота (NO) [26, 36]. У детей с легкой ЧМТ уровень NO в сыворотке крови был выше, чем в контрольной группе, но значительно ниже, чем у детей с тяжелой ЧМТ. В группе детей с тяжелой ЧМТ уровень метаболитов NO в сыворотке крови в десятки раз превышал как контрольный уровень, так и содержание при легкой ЧМТ [26]. Наиболее высокий уровень продуктов метаболизма NO в сыворотке крови отмечался у детей с неблагоприятными исходами ЧМТ. Вероятно, накопление NO и его токсичных продуктов способствует вторичным повреждениям нейронов и значительному увеличению уровня аАТ к NR2-рецепторам. Эти данные являются достаточным обоснованием для проведения у таких больных активной антиоксидантной терапии.
Одним из осложнений ЧМТ, особенно у детей, является снижение когнитивных функций мозга в различные периоды после тяжелой травмы [17, 30]. Важную роль в этих процессах играет BDNF, являющийся эндогенно образуемым в мозге нейротрофином, который, блокируя апоптоз и усиливая нейрогенез, защищает мозг от повреждений, в том числе при ЧМТ [30, 31, 37]. В настоящей работе мы изучили изменения уровня BDNF у детей с ЧМТ. Легкая ЧМТ, а также тяжелая ЧМТ с полным восстановлением сопровождались более высокими значениями ВDNF в 1-й день с последующим снижением к 3-му дню (рис. 3). При тяжелой ЧМТ с летальным исходом уровень BDNF в 1-й день после ЧМТ оказался наиболее низким из всех групп и в последующем после небольшого подъема продолжал снижаться.
Таким образом, проведенные исследования посттравматической динамики выбранных нами показателей явились началом для формирования панели биомаркеров для оценки тяжести повреждений мозга и прогноза ЧМТ у детей. Эта панель включает определение содержания S100 В, нАТ к белку S100B, NSE, аАТ к глутаматным рецепторам, уровень BDNF в крови. Полученные данные свидетельствуют, что выбранные маркеры лишь до определенной степени отражают тяжесть повреждений мозга и имеют ограничения в использовании для прогноза исходов.
Наибольшей информативностью для прогнозирования летальных исходов ЧМТ обладают S100B, NSE и аАТ к NR2-субъединице рецепторов глутамата, определение которых проводится в первые дни после ЧМТ. Определение содержания нАТ к S100B через 3 дня после ЧМТ c большей достоверностью дает возможность оценить проницаемость гематоэнцефалического барьера и помогает в прогнозировании степени инвалидизации после ЧМТ.
Дальнейшие исследования изменений в содержании этих, а возможно и других биомаркеров, и сопоставление их изменений с данными КТ и МРТ необходимы для выявления маркеров с большей клинической значимостью в оценке тяжести повреждения мозга детей с ЧМТ.
Работа поддержана грантами РГНФ № 12−06−00943 и № 15−06−10952а .
1Гранстрем О.К., Сорокина Е.Г., Пинелис В.Г. Модифицированный пептид и его использование для тестирования неврологических нарушений, онкологических заболеваний ЦНС и эффективности терапии. Патент Р.Ф. № 2491291.