Препарат церебролизин, основой которого является высокоочищенный экстракт пептидов головного мозга молодых свиней, успешно используется в клинической практике для восстановления неврологических функций пациентов с инсультом, деменцией и черепно-мозговой травмой. Известно, что применение церебролизина достоверно уменьшает неврологический дефицит [1], снижает объем зоны инфаркта при инсульте [2], оказывает нейрорегенеративное [3], противоспалительное и антиоксидантное действие [4, 5]. Также на модели у животных (крысы линии Вистар) тиосемикарбазидовых судорог было показано, что церебролизин обладает противосудорожными эффектами [6].

Действующим началом церебролизина являются аминокислоты и пептиды с молекулярной массой не более 6000 Да, которые преодолевают гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и поступают в ЦНС [7]. В частности, масс-спектрометрический и биоинформационный анализы пептидной фракции препарата с молекулярными массами компонентов до 1500 Да показал, что в состав препарата входят биологически активные пептидные фрагменты фактора роста нервов (ФРН, пептиды GEFSV, NSYCTTT), энкефалины и динорфины (YGGFL, GGFLR, YGGFM), фрагменты орексина (пептид CCRQK) и галанина (пептид WWLNSAGY) [8].

Следует отметить, что многокомпонентный состав препаратов, включающих пептиды-миметики ростовых факторов, иногда порождает весьма вольные интерпретации механизмов действия этой группы препаратов. При анализе этих интерпретаций становится очевидным недопонимание фундаментальных свойств ростовых факторов, а также различий в фармакологических эффектах ростовых факторов и их пептидов-миметиков. В частности, есть мнение, что ростовые факторы способствуют возникновению и росту опухолей. Между тем данное мнение противоречит здравому смыслу — по такой логике получается, например, что в результате беременности, в ходе которой концентрации ростовых факторов весьма высоки, женщина подвергается высокому риску развития опухолей.

Активность ростовых факторов носит гораздо более комплексный и дифференцированный характер, чем просто стимулирование роста всех тканей, при любых условиях, особенно деления недифференцированных клеток. Во-первых, ростовые факторы, как правило, высокоспецифично воздействуют на различные типы тканей и клеток. Во-вторых, действие любого ростового фактора зависит от множества других условий (например уровней рецепторов данного фактора на поверхности соответствующего типа клеток, уровней регуляторных белков, опосредующих эффекты активации рецептора ростового фактора и др.). В-третьих, следует различать как минимум «зрелые» и «незрелые» формы ростовых факторов, биологические эффекты которых принципиально различаются [8].

Сформулированные выше фундаментальные особенности биологического действия ростовых факторов указывают на очевидную ложность мнения о том, что ростовые факторы «вообще» стимулируют возникновение и рост опухолей. Более того, имеющиеся данные показывают, что ростовые факторы, пептидные фрагменты которых входят в состав церебролизина, характеризуются выраженным противоопухолевым эффектом.

Так, входящий в состав церебролизина Мет-энкефалин играет важную роль в регулировании не только нейроэндокринной, но и иммунной систем. Связываясь с опиоидными рецепторами, Мет-энкефалин потенцирует противоопухолевую терапию [9]. В эксперименте Мет-энкефалин тормозит рост опухолей (в частности за счет модулирования активности регуляторных Т-клеток типа CD4+/Foxp3+, поддерживающих баланс между иммуносупрессией и иммунным реагированием) [10]. Иммунотерапевтические эффекты Мет-энкефалина также осуществляются за счет активации цитотоксических Т-лимфоцитов CD8+T, имеющих опиоидные рецепторы на клеточной мембране [11].

Лонгитудинальное исследование когорты женщин 50—60 лет (n=1929) показало, что низкие уровни про-энкефалина натощак ассоциированы с повышенным риском развития рака груди [12]. Следует подчеркнуть, что низкие уровни энкефалинов ассоциированы с депрессией — одним из факторов риска развития опухолевых заболеваний. Ранее было высказано предположение о целесообразности использования аугментационной терапии церебролизином в лечении пациентов с депрессивным расстройством (диагнозы F32, F33 по МКБ-10), резистентным к воздействию антидепрессантов [13].

Кроме Мет-энкефалина, противоопухолевые эффекты были установлены и для других нейротрофических факторов, пептидные фрагменты которых входят в состав церебролизина. Так, фактор роста нервов тормозит рост карциномы Эрлиха [14] и карциномы простаты [15]. Орексин-А стимулирует аутофагию опухолевых клеток (линия HCT-116, карцинома прямой кишки) за счет модуляции сигнального пути ERK, поддерживающего баланс между выживанием и апоптозом клеток [16]. Низкая активность рецепторов галанина (например при избыточном метилировании участков ДНК, кодирующих гены этих рецепторов) стимулирует рост опухолей головы и шеи [17, 18].

Важной составляющей потенциального противоопухолевого эффекта церебролизина является доказанное противовоспалительное действие препарата. В работе [5] исследовали действие церебролизина (0,1 мл на 1 кг массы тела, 10 инъекций через день) на ряд показателей аутоиммунитета (уровни FasL, Fas, металлотионеина-1) в группе из 20 новорожденных в возрасте 1 мес с ишемическими поражениями ЦНС и 20 здоровых детей. Применение церебролизина оказывало нормализующее действие на состояние Т-лимфоцитов (увеличение Fas, уменьшение FasL, p<0,001) и активировало антиоксидантную защиту через увеличение уровня мРНК металлотионеина-1 [5].

Таким образом, имеющиеся данные о пептидном составе церебролизина и данные о противоопухолевых эффектах соответствующих ростовых факторов указывают на возможное противоопухолевое действие препарата. В настоящей работе представлены результаты исследования различных дозировок церебролизина на рост карциномы легких Льюис. Данная модель является обязательным шагом при исследованиях потенциальных противоопухолевых и антиметастатических средств. Выбор модели обусловлен также и тем, что заболевания легких являются одними из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований в России. Например в 2014 г., как и в предшествующие годы, наиболее часто встречались новообразования кожи (14% от числа новых случаев рака), молочной железы (12%) и трахеи, бронхов, легкого (10%) [19].

Исследования были проведены на 60 самцах мышей-гибридов F₁ (CBA×C₅₇BL_6j) в возрасте 2—2,5 мес с массой тела 19—22 г. Животные были получены из питомника и имели ветеринарный сертификат. Содержались животные в клетках Т-3 в соответствии с нормами группового размещения [20] в условиях естественного освещения с принудительной 16-кратной вентиляцией, при температуре 18—20 °C и относительной влажности воздуха 40—70% на подстилке из простерилизованных древесных стружек. Животные имели свободный доступ к питьевой воде и корму и получали стандартный (ГОСТ Р50258−92) брикетированный корм ПК-120−1 (ООО «Лабораторснаб», Россия). Все работы с лабораторными животными были выполнены на основе стандартных операционных процедур, принятых в МРНЦ, соответствующих правилам Европейской Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для научных целей (ETS 123) [21].

Модель карциномы. В качестве опухолевой модели использована перевиваемая эпидермоидная карцинома легких Льюис (КЛЛ), относящаяся к списку опухолевых систем, обязательных к изучению при доклинических исследованиях потенциальных противоопухолевых и антиметастатических средств [22]. Штамм КЛЛ был получен из банка опухолевых материалов Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина и поддерживался на самцах мышей С₅₇BL_6j. Для перевивки опухолевую ткань, взятую на 14-е сутки роста, измельчали до гомогенной консистенции, гомогенат фильтровали с помощью нейлонового фильтра с порами 40 мкм, оценивали клеточность суспензии в камере Горяева под микроскопом Olympus (Япония) и доводили средой 199 (Пан-Эко, Россия) до концентрации 1,9·10⁷ кл/мл. Перевивку КЛЛ проводили путем подкожного введения 0,1 мл суспензии (1,6·10⁶ клеток) на внешней поверхности правого бедра, на которой предварительно депилировали шерстный покров.

Экспериментальные группы, способы введения и дозы препарата. После перевивки КЛЛ животных путем рандомизации распределили на три группы, по 20 особей в каждой — контрольную и две экспериментальные. С животными контрольной группы не проводили никаких действий. В экспериментальных группах со 2-го дня после трансплантации опухоли по 16-й ежедневно вводили церебролизин путем однократной внутрибрюшинной инъекции в дозах 524 и 1800 мг/кг (25 и 85 мкл фармакопейного раствора на 10 г массы тела), составляющих соответственно 5- и 20-кратную максимальную суточную дозу, рекомендуемую для человека [23]. В исследованиях церебролизин использован в фармакопейной форме раствора для инъекций (EVER Neuro Pharma GmbH, Австрия) с концентрацией 215,2 мг/мл. Препарат в ампулах темного стекла хранился в защищенном от света месте при температуре ниже 25 °C.

Оценка эффектов. Переносимость препарата оценивали путем ежедневного наблюдения за животными, при котором изучался неврологический статус (по характеру спонтанной двигательной активности, общей возбудимости и реакции на тактильные и звуковые раздражители), а также по пищевой активности и динамике прироста их массы тела.

Влияние изучаемого препарата на рост и метастазирование КЛЛ оценивали морфологическими методами. Для этого на 2, 5, 7, 9, 12, 16, 19-е и 21-е сутки после перевивки КЛЛ у всех животных проводили измерение линейных размеров опухолевых узлов в ортогональных плоскостях и рассчитывали их объемы в эллиптическом приближении.

Специфическое влияние церебролизина на опухолевый процесс изучали по динамике роста и активности метастазирования КЛЛ. Для этого с 7-го дня опыта, по достижению опухолями измеряемого размера, каждые 2—3 дня у всех животных проводили калипером измерение двух диаметров опухолевых узлов: L — максимальный диаметр узла; W — диаметр, ортогональный к L. Расчет объемов узлов проводили в приближении V=(L·W2)·(p/6), которое надежно коррелирует с данными магнитно-резонансной томографии (МРТ) [24]. Влияние церебролизина на рост КЛЛ оценивали путем статистического сравнения объема опухолевых узлов в контрольных и подопытных группах при разных сроках наблюдения, по длительности задержки роста опухоли и индексу торможения роста (ТРО): ТРО=(V_K—V_O)/VK·100%; где V_K и V_O — средние объемы узлов в контрольной и опытной группах [25]. На 21-е сутки роста карциномы животных выводили из опыта путем цервикальной дислокации под эфирным наркозом, выделяли легкие, фиксировали их 24 ч в жидкости Буэна и далее проводили подсчет числа крупных и мелких легочных метастазов. Влияние церебролизина на процессы метастазирования и рост метастазов оценивали путем статистического сравнения числа метастазов в контрольных и опытных группах.

В дальнейшем строили кривые опухолевого роста, рассчитывали индексы торможения роста опухоли (ТРО), индексы их роста (ИР), индексы ингибирования метастазирования (ИИМ) при разных сроках наблюдения:

V_K–V_O

TPO= ·100%;

ИР= ·100%;

f_O V_K–V_O

ИИМ= · ·100%,

f_K V_K

где V_Kи V_O — средние объемы опухоли в контрольной и опытной группах при определенном сроке наблюдени; f_O, f_K — доля животных с метастазами в опытной и контрольной группах; M_O, M_K — среднее число метастазов во всех группах [25]. По экспоненциальным кривым роста оценивали длительность задержки роста новообразований, по которым судили о противоопухолевом действии [25].

Статистическую обработку проводили путем рангового дисперсионного анализа Крускала—Уоллиса с использованием критерия Данна, t-теста, а также с использованием непараметрических критериев А.Н. Колмогорова и Н.В. Смирнова. Для применения t-теста проводилась проверка нормальности распределения исследуемых переменных с использованием критерия Колмогорова. Во всех случаях различия считали достоверными при p<0,05.

Развитие КЛЛ в контрольной группе в целом имело типичный для этой опухолевой системы характер, т. е. к 7-м суткам после перевивки опухолевый узел объемом 50—70 мм³ определялся у всех животных.

Введение церебролизина в дозах 524 мг/кг и 1800 мг/кг переносилось животными легко и не вызывало у них каких-либо изменений в неврологическом статусе и пищевой активности. Во всех 3 экспериментальных группах в данном опыте отмечалась типичная для данной опухолевой модели 5—15% летальность на поздних сроках наблюдения (т.е. 19—20-е сут после трансплантации КЛЛ). Ежедневное внутрибрюшинное введение образцов препарата не сопровождалось какими-либо симптомами интоксикации и изменениями в общем состоянии, возбудимости и двигательной активности.

Были установлены эффекты воздействия церебролизина на изменение массы тела животных, проявившиеся после отмены препарата (рис. 1). До отмены препарата статистически достоверных различий между тремя группами не наблюдалось. После отмены препарата (16-е сут) установлено достоверное замедление скорости (критерий Данна, p<0,05) роста массы тела на 21-е сутки.

Достоверность различий по массе тела на 21-е сутки была подтверждена и другим статистическим тестом — непараметрическим тестом А.Н. Колмогорова. Значение максимального уклонения (D) между распределениями, построенными для групп «случай» и «контроль», на 21-е сутки составило D=0,30 (что соответствовало достоверным различиям, p=0,053) (рис. 2).

Следует отметить, что применение церебролизина было также ассоциировано с возрастанием разброса значений массы тела, о чем свидетельствуют данные стандартных отклонений массы тела в динамике исследования (рис. 3). При этом возрастание разброса значений массы тела в группах от начала исследования к концу исследования зависело от дозы: данный эффект наблюдался при более низкой дозе церебролизина (524 мг/кг). Таким образом, нейропептиды в составе церебролизина стимулируют индивидуальное развитие организма.

Анализ динамики роста КЛЛ в разных группах показал, что церебролизин в обеих использованных дозах вызывал умеренную, но статистически достоверную задержку начального роста карциномы, проявившуюся 30—40% торможением роста экспериментальной неоплазии.

Анализ пучка индивидуальных кривых скорости роста опухолей подтвердил достоверные различия (критерий Данна, p<0,05), наблюдавшиеся между опытной и контрольной группами в 7—16-й дни, до отмены в/б введения церебролизина. Достоверное снижение интенсивности роста опухолей наблюдалось с 7-го по 16-й день терапии церебролизином (рис. 4). При исследованных дозировках церебролизина достоверные различия между опытными и контрольной группами исчезали через 3 дня после отмены препарата (на 19-й день). Таким образом, в рамках настоящего эксперимента противоопухолевое действие церебролизина наблюдалось в период воздействия препарата.

Сравнение кривых усредненных по группам значений объема опухолевых узлов подтвердило достоверные различия между опытной и контрольной группами до дня отмены церебролизина (рис. 5). Достоверное снижение интенсивности роста опухолей наблюдалось только до 16-го дня включительно, достоверности различий в значениях объемом в опухолевых узлов не наблюдалось в 19-й и 21-й дни.

Достоверность различий объемов опухолей с 7 по 16-й день была подтверждена и другим статистическим методом — непараметрическим тестом. Например, для дозы церебролизина 524 мг/кг значения максимальных уклонений (D) между распределениями, построенными для групп «случай» и «контроль» в период с 7 по 16-й день, находились в интервале D=0,35 … 0,42 (что соответствовало достоверным различиям, р=0,027 … 0,033, рис. 6). Сходные значения были получены и для дозы церебролизина 1800 мг/кг.

В целом церебролизин при парентеральном введении в дозах 524 и 1800 мг/кг животным с моделью КЛЛ, вызывал умеренную статистически достоверную задержку роста карциномы. Значение индекса ТРО достигало 30—40% (p<0,05). По всей видимости, ингибирующий эффект церебролизина наблюдался только во время введения препарата. После прекращения введения церебролизина на 16-й день достоверных различий между контролем и опытными группами установлено не было.

В настоящей работе в контрольной группе была установлена статистически достоверная корреляция между объемом опухолевого узла и числом крупных легочных метастазов на 21-й день эксперимента (коэффициент корреляции r=0,54, p=0,01). В соответствии с корреляционным уравнением (рис. 7) число крупных метастазов составляет приблизительно 0,0084 от объема опухолевого узла. Соответственно средний объем метастаза составил ~120 мм³ (т.е. 1/0,0084).

Поскольку церебролизин способствует снижению объемов опухолевых узлов, то можно ожидать, что препарат также должен стимулировать снижение числа крупных легочных метастазов. Действительно, число крупных метастазов статистически значимо снижалось на 30—50% с повышением дозы церебролизина (коэффициент корреляции r=0,45, p=0,01, рис. 8). Это позволяет предположить, что церебролизин тормозит формирование и интенсивность роста крупных метастазов или же процесс слияния малых метастазов в более крупные.

Церебролизин назначается группам пациентов с неустойчивым противоопухолевым иммунитетом (дети, пациенты с инсультом, деменцией, депрессией и др.). Действительно, у детей иммунитет еще не вполне сформирован, а в пожилом возрасте иммунитет ослаблен (особенно на фоне деменции и цереброваскулярной патологии). Поэтому нейротрофические препараты должны отвечать требованиям не только эффективности, но и противоопухолевой безопасности. Данный момент особенно важен при долговременной терапии нейротрофическими препаратами. Фактор роста нервов, энкефалины, галанин, орексин и др., фрагменты которых входят в состав препарата Церебролизин, характеризуются отчетливым противоопухолевым действием. В настоящем исследовании показано, что церебролизин действительно обладает противоопухолевым эффектом и тормозит развитие модели карциномы легких Льюис, статистически достоверно снижая объем опухолевого узла и число крупных метастазов. Таким образом, церебролизин не просто характеризуется высокой противоопухолевой безопасностью, но и обладает определенным противоопухолевым действием.