Универсальным механизмом повреждения клеток является избыточная неконтролируемая продукция активных форм кислорода (АФК) и интенсификация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), протекающих на фоне снижения концентрации и активности естественных систем антиоксидантной защиты [1-3]. Процесс интенсификации свободнорадикального окисления и развитие окислительного стресса в настоящее время признаны универсальным общебиологическим механизмом при развитии любого вида патологии. Биохимические изменения в тканях, вызванные интенсивной генерацией АФК имеют общие закономерности. Некоторые отличительные особенности можно выявить только на начальных стадиях. Так, при воспалительных процессах пусковым фактором интенсификации свободнорадикальных процессов является «дыхательный взрыв», при гипоксии - нарушение системы тканевого дыхания, при химических поражениях - активация системы микросомального окисления. Таким образом, причины, вызывающие интенсификацию свободнорадикальных процессов, могут быть разными, но изменения на молекулярном уровне носят однотипный характер и процессы генерации АФК тесно связаны между собой. Общим для всех заболеваний является усиление свободнорадикальных процессов и снижение буферной емкости антиоксидантной защиты, нарушение ее мобилизации в ответ на повышение активности прооксидантной системы (ПОС) [2, 4].

В этих условиях очень важна своевременная антиоксидантная защита, которая участвует в снижении уровня реакционноспособных соединений и тем самым препятствует их токсическому действию, например - введение препаратов, обладающих способностью тем или иным способом снижать выраженность свободнорадикальных реакций. Несмотря на то что история изучения процессов ПОЛ при различных патологических состояниях составляет более 30 лет, перечень антиоксидантных препаратов, вышедших за рамки экспериментальных и доклинических испытаний и использующихся в клинической практике, остается крайне немногочисленным [5, 6].

При определении показаний для назначения этих препаратов целесообразно оценивать состояние антиоксидантной системы, а также выраженность свободнорадикальных реакций в организме пациента [7-9] и учитывать, что не существует универсального соединения, блокирующего все пути генерации АФК и способного обрывать все виды реакций ПОЛ и окислительную модификацию белков [8-10].

Многочисленные результаты экспериментальных и клинических работ свидетельствуют о большей терапевтической эффективности комплексного применения нескольких антиоксидантов с различными механизмами действия [5, 6, 10, 11]. Так, одни лекарственные формы участвуют в качестве ловушек радикальных соединений, действие вторых связано с торможением процессов, с которыми сопряжена интенсивная генерация самих АФК и других радикальных соединений. Разделение это условное, так как различные препараты могут обладать довольно широким спектром антиоксидантной активности [12, 13].

Антиоксидантное действие цитофлавина и винпоцетина связано со способностью гасить генерируемые радикальные соединения и повышать буферную емкость ферментативной антиоксидантной защиты (АОЗ), кроме того, они способствуют нормализации энергетического обмена путем увеличения транспорта глюкозы через гематоэнцефалический барьер, интенсификации насыщения кислородом гемоглобина, активации системы тканевого дыхания и увеличения образования АТФ, что в той или иной степени снижает образование АФК [2, 14]. Кроме того, эти препараты способны восстанавливать отдельные компоненты антиоксидантной защиты нейронов. В частности, цитофлавин способствует повышению активности системы глутатиона, влияя на активность ее ферментов - глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [2, 4, 15-17].

Таким образом, для сохранения нормальной и сбалансированной жизнедеятельности клеток важен не только уровень антиоксидантных компонентов, но и уровень самих АФК, в настоящее время меняется подход к назначению антиоксидантной терапии, что проявляется в индивидуальной оценке выраженности параметров окислительного стресса и активности эндогенных антиоксидантов у каждого конкретного больного [2, 4, 16, 18]. Необходимо учитывать, что в условиях длительного окислительного стресса при измененном метаболическом фоне в связи с проявлением токсического действия свободных радикалов действие препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами, не проявляется сразу и в полной мере. Для достижения положительного антиоксидантного эффекта требуется длительное комбинированное применение антиоксидантных препаратов с широкими фармакологическими свойствами [4, 16].

Целью исследования было изучение в эксперименте in vitro антиоксидантной и антирадикальной активности цитофлавина актовегина, винпоцетина и этилметилгидроксипиридинасукцината.

В эксперименте in vitro было проведено исследование антиоксидантной и антирадикальной активности 4 препаратов, наиболее часто применяемых в неврологической практике: цитофлавин (ООО «Полисан»), актовегин («Nycomed»), винпоцетин (кавинтон, «Гедеон Рихтер») и этилметилгидроксипиридина сукцинат (мексидол, ООО «НПФ Фармасофт»).

Для этого были использованы следующие модельные системы: система генерации АФК в цельной гепаринизированной крови за счет активации нейтрофилов форболмеристатацетатом (ФМА). Образующиеся АФК регистрировали методом хемилюминесценции [6]; система определения стабильного радикала α-α-дифенил-β-пикрилгидразина (ДФПГ) для выявления антирадикальной активности [3]; система генерации супероксидного анион-радикала за счет аутоокисления кверцетина [15].

Влияние исследуемых препаратов на уровень генерации активных форм кислорода (О₂^–., ОН^., ¹О, Н₂О₂, HClO) изучали методом индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) с использованием цельной гепаринизированной крови доноров и больных, перенесших ишемический инсульт 1-1,5 года назад [19]. Генерацию АФК инициировали форболмеристатацетатом (ФМА, конечная концентрация в реакционной смеси 1,6 мкМ), который является неспецифическим индуктором фагоцитирующих клеток крови, главным образом нейтрофилов. Концентрацию исследуемых соединений соизмеряли с 1-кратной дозой, создаваемой в организме при введении препаратов внутрь, и добавляли в реакционную среду, содержащую буфер ХЭНКС с 0,1% раствором глюкозы (рН 7,2), люминол (конечная концентрация в реакционной смеси 2×10^–5 М) и гепаринизированную кровь. Общий объем реакционной смеси составлял 1 мл. Температура проведения реакции 37 ^оС. Измерения проводили на люминометре «LKB 1251» (Швеция). Уровень генерации АФК нейтрофилами цельной крови оценивали по интегральному показателю фотоэмиссии за 30 мин в милливольтах (мВ) с использованием программы Multi Use, Финляндия. По изменению характера ХЛ при добавлении препарата в модельную систему, генерирующую АФК, судили о действии вещества на процессы свободнорадикального окисления. Число измерений для каждого препарата составило 10.

Принцип метода анализа антирадикальной активности основан на восстановлении стабильного хромоген-радикала α-α-дифенил-β-пикрилгидразина (ДФПГ) молекулой предполагаемого антиоксиданта, результатом чего является изменение оптической плотности среды при 517 нм [20]. Использовали 7% растворы исследуемых препаратов. Препаратом сравнения являлась аскорбиновая кислота. Полученные показатели оптической плотности выражали в процентах ингибирования ДФПГ. Число измерений для каждого препарата составило 10.

Антиоксидантную активность препаратов оценивали по их способности тормозить аутоокисление кверцетина [21]. Использовали готовые тест-системы (ТУ РБ 100117887.023−200). За единицу активности принимали такое количество препарата, которое ингибирует окисление кверцетина на 50%. Число измерений для каждого препарата составило 10.

Цитофлавин, винпоцетин и этилметилгидроксипиридина сукцинат подавляли вспышку кривой ХЛ как в крови здоровых, так и больных, что свидетельствует об их способности блокировать процесс активации фагоцитарных клеток (табл. 1). Препарат актовегин не проявил антиоксидантной активности в данной модельной системе.

Проведенные исследования показали, что 100% антирадикальной активностью обладали только цитофлавин и винпоцетин (табл. 2). В то же время актовегин проявил слабую антирадикальную активность. У этилметилгидроксипиридина сукцината антирадикальная активность отсутствовала.

Полученные методом определения антиоксидантной активности по отношению к супероксидному анион-радикалу результаты свидетельствуют о наибольшей выраженности неспецифической супероксиддисмутазной активности у цитофлавина и винпоцетина, менее - у актовегина и этилметилгидроксипиридина сукцината (табл. 3).

Проведенное исследование препаратов показало их разноплановое действие на генерируемые свободнорадикальные продукты в опытах in vitro: наиболее выраженной антиоксидантной и антирадикальной активностью обладал препарат цитофлавин, что связано с его способностью восстанавливать энергетический обмен и, как следствие, снижать генерацию АФК, связанную с нарушением системы дыхательных ферментов. Незначительно менее активным оказался винпоцетин, что, возможно, связано с его влиянием на метаболические процессы головного мозга и, в первую очередь, с интенсивным поступлением и усвоением мозгом глюкозы и кислорода, с влиянием на реологические свойства крови. Низкая неспецифическая супероксиддисмутазная активность выявлена у актовегина, что, возможно, обусловлено присутствием в составе препарата примесей низкомолекулярных антиоксидантов.

Вместе с тем выявленная неспецифическая активность препаратов является недостаточной для быстрой нормализации свободнорадикальных процессов у пациентов в состоянии выраженного хронического окислительного стресса, в связи с чем для достижения положительного антиоксидантного эффекта требуется их применение длительными курсами.