В настоящее время нарушения мозгового кровообращения, в частности ишемический инсульт, остаются одной из главных медико-социальных проблем здравоохранения. Установлено, что на 2019 г. инсульт занимает второе место в ряду основных неинфекционных причин смертности, уступая только ишемической болезни сердца/инфаркту миокарда. Ежегодно отмечается >6 млн случаев летального исхода от инсульта, при этом наблюдается значительный рост случаев первичной потери трудоспособности и инвалидности после инсульта. Согласно статистическим отчетам ВОЗ, нарушения мозгового кровообращения чаще регистрируются в странах со средним и средне-высоким уровнем дохода, в то время как при увеличении благосостояния населения и возможности получения квалифицированной и своевременной медицинской помощи заболеваемость инсультом значительно снижается, что подтверждают данные из стран с высоким уровнем дохода [1].
Высокая медико-социальная значимость ишемического инсульта диктует необходимость поиска новых путей лечения данного патологического состояния. Одной из таких относительно новых стратегий адъювантной терапии инсульта может являться нейропротекция. К числу нейропротекторов относятся средства различного химического строения: соединения природного происхождения, которые чаще всего представлены полифенолами: кверцетин, вербаскозид, аураптен, тимол, эпигаллокатехин галлат, куркумин [2]; половые гормоны, низкомолекулярные синтетические соединения, такие как соли молочной кислоты, ацетил-L-карнитин [3], антагонисты рецепторов ангиотензина II [4]. Также в нейропротекции все больше применяются методы наномедицины [5]. Таким образом, можно предположить, что целенаправленная разработка нейропротекторных средств является стремительно развивающимся направлением медицинской химии и фармакологии. Так, в последнее десятилетие были открыты несколько многообещающих нейропротекторов: мочевая кислота [6], отаплимастат (ингибитор металлопротеиназ) [7], дротрекогин-α (антикоагулянт, агонист PAR-1) [8], верапамил, неринетид (антиэксайтотоксический препарат) [9].
В качестве потенциальных нейропротективных средств можно выделить класс производных пиримидина, которые обладают обширным спектром фармакологической активности, включающей противоопухолевые, противовирусные, противовоспалительные свойства, гормонотропный, антибактериальный, противопротозойный и гербицидный виды [10]. Кроме того, S. Kumar и соавт. [11] было установлено, что ядро пиримидина может являться базовой структурой для целенаправленного синтеза нейроактивных веществ. Так, в данной работе было показано, что замещенные производные пиримидина оказывают антидепрессивное, противосудорожное и противопаркинсоническое действие. В ранее проведенных исследованиях было установлено, что применение некоторых дериватов пиримидина может способствовать восстановлению синтеза АТФ до его оптимального уровня, что может являться предпосылкой для наличия нейропротективного эффекта, реализуемого посредством нормализации нейронального метаболизма. В другом исследовании было показано, что для производных пиримидина характерно наличие антиоксидантной активности. Высокая фармакологическая активность производных пиримидина, а также потенциальные митохондрио-ориентированные свойства послужили основанием для проведения данного исследования [12, 13].
Цель исследования — оценить влияние 10 производных пиримидин-4-H1-OHa на изменение активности комплексов митохондриальной дыхательной цепи и ферментов цикла трикарбоновых кислот у крыс в условиях экспериментальной ишемии головного мозга.
Материал и методы
Исследование выполнено на 260 половозрелых крысах-самцах линии Wistar. Животные были получены из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская обл.) и на время проведения эксперимента содержались в условиях лабораторного вивария по 5 особей в клетке при температуре воздуха 20±2 °C, относительной влажности 60±5% и 12-часовом суточном цикле (12 ч день/12 ч ночь). До момента включения в работу крысы на протяжении 2 нед находились в карантинном помещении. Полнорационную сухокормовую диету (гранулированный корм) и воду водопроводную животные получали в свободном доступе.
В качестве исследуемых веществ в данной работе выступали производные пиримидин-4-H1-OHa, полученные на кафедре органической химии Пятигорского медико-фармацевтического института. Структуры соединений были подтверждены методом 1Н ЯМР-спектроскопии. Исследуемые соединения: 4-(6-этил-2-метил-4-оксо-5-фенилпиримидин-1(4Н)-ил)бензолсульфонамид — шифр PYrm1; 4-{2-[2-(2-Гидрокси-3-метоксифенил)-винил]-6-этил-4-оксо-5-фенил-4H-пиримидин-1-ил}-бензсульфамид — Pyrm2; 4-{2-[2-(3-Гидрокси-4-метоксифенил)-винил]-6-этил-4-оксо-5-фенил-4H-пиримидин-1-ил}-бензсульфамид — Pyrm3; 4-{2-[2-(3,4-дигидроксифенил)-винил]-6-этил-4-оксо-5-фенил-4H-пиримидин-1-ил}-бензсульфамид — Pyrm4; 4-(6-метил-2-этил-4-оксо-5-фенил-4H-пиримидин-1-ил)-бензсульфамид — Pyrm5; 1-[4-(4-аминобензсульфонил)-фенил]-6-метил-2-этил-5-фенил-1H-пиримидин-4-он — Pyrm6; 4-(2-метил-6-этил-4-оксо-5-фенил-4H-пиримидин-1-ил)-N-тиазол-2-ил-бензсульфамид — Pyrm7; 4-(6-метил-2-этил-4-оксо-5-фенил-4H-пиримидин-1-ил)-N-тиазол-2-ил-бензсульфамид — Pyrm8; 4-{2-[2-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-винил]-6-этил-4-оксо-5-фенил-4H-пиримидин-1-ил}-бензсульфамид — PYrm9; 1-[4-(4-аминобензсульфонил)-фенил]-2-метил-6-этил-5-фенил-1H-пиримидин-4-он — PYrm10. В качестве препарата сравнения использовали ацетил-L-карнитин (Элькар, «Пик-ФАРМА», Россия) в дозе 200 мг/кг (per os) [14]. Изучаемые соединения вводили в дозе 50 мг/кг (per os) [12].
Церебральную ишемию у крыс воспроизводили путем необратимой правосторонней окклюзии средней мозговой артерии по методу A. Tamura и соавт. [15]. В ходе эксперимента были сформированы следующие экспериментальные группы: ложнооперированные животные (ЛО); негативный контроль (НК), с воспроизведенной патологией, но лишенный фармакологической поддержки; группа животных, получавшая референтный препарат; группы крыс, которым вводили исследуемые соединения. Количество животных в группе равнялось 20 особям. Препарат сравнения и исследуемые вещества вводили через 30 мин с момента моделирования ишемии и далее ежедневно, однократно в сутки на протяжении 3 дней. На 4-й день у крыс производили забор биоматериала. У 10 крыс из группы оценивали изменение митохондриальной функции в мозговой ткани, у оставшихся 10 животных определяли изменение зоны некроза мозга.
В данной работе в качестве биоматериала использовали головной мозг животных. Крыс декапитировали (хлоралгидрат 350 мг/кг внутрибрюшинно), вскрывали черепную коробку и извлекали головной мозг. У 10 животных из группы мозг использовали для определения зоны некроза. У остальных 10 крыс мозг гомогенизировали в изолирующей среде (1 ммоль ЭГТА (этиленгликоль-бис (β-аминоэтиловый эфир) — тетрауксусная кислота)+ 215 ммоль маннита + 75 ммоль сахарозы + 0,1% раствор бычьего сывороточного альбумина + 20 ммоль HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), при pH 7,2). Для выделения митохондриальной фракции полученный гомогенат центрифугировали при 1100 g в течение 2 мин. Полученный супернатант в количестве 700 мкл переносили в пробирки Эппендорфа и наслаивали 75 мкл 10% раствора перколла. Далее смесь центрифугировали при 18 000 g в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в 1 мл изолирующей среды и центрифугировали в течение 5 мин при 10 000 g. Полученную фракцию удаляли для определения активности дыхательных комплексов и ферментов цикла трикарбоновых кислот [12].
Активность комплексов дыхательной цепи митохондрий I, II, IV и V оценивали респирометрическим методом с применением системы лабораторного респирометра АКПМ 1-01Л («Альфа Бассенс», Россия) путем добавления в анализируемую среду соответствующих субстратов окисления: пируват 10 ммоль/мл; малат 1 ммоль/мл; сукцинат 10 ммоль/мл; аскорбат 2 ммоль/мл; аденозиндифосфат 1 ммоль/мл; тетраметил-1,4-фенилендиамин (TMPD) 0,5 ммоль/мл. Активность комплекса I исследовали по разнице в потреблении кислорода (OCR), когда в качестве субстратов для окисления использовали малат/пируват. Активность комплекса II исследовали по разнице в OCR при использовании сукцината в качестве субстрата окисления и добавлении олигомицина в среду. Активность комплекса IV определяли по разнице в OCR после добавления смеси ротенона+TMPD+аскорбат в качестве субстрата окисления. Активность комплекса V определялась по разнице в OCR после введения ротенона и АДФ в анализируемую среду. Активность комплекса III оценивали спектрофотометрически путем увеличения поглощения инкубационной среды 1 М раствором сукцината + 0,5 М раствором цитохрома C + 0,2 М раствором KCN + 10 ммоль раствора ротенона и 10 мкл анализируемого образца при 550 нм. Потребление кислорода определяли в промилле и выражали в пересчете на концентрацию белка в анализируемом образце. Содержание белка оценивали по методу Брэдфорда [16]. Активность α-кетоглутаратдегидрогеназы определяли путем измерения интенсивности реакции восстановления НАД+ при 340 нм в присутствии тиамин пирофосфата и α-кетоглутарата [17]. Активность аконитазы определяли спектрофотометрически при 340 нм путем регистрации НАДФН, образовавшегося в ходе сопряженной аконитаза-изоцитратдегидрогеназной реакции. Активность фермента рассчитывали по изменению оптической плотности, используя коэффициент экстинкции 0,0313µМ–1 [18]. Активность цитратсинтазы оценивали спектрофотометрической детекцией окрашенных продуктов реакции деградации 5,5’-ди-тиобис-(2-нитробензойной кислоты) в присутствии ацетил-КоА и оксалоацетата при 412 нм [19]. Активность ферментов выражалась в Ед/мг белка, концентрацию которого определяли методом Бредфорда. Размер зоны инфаркта мозга определяли трифенилтетразолиевым методом. Головной мозг извлекали, отсекали мозжечок и прилегающую к нему часть ствола мозга, разделяли полушария. Обе половины гомогенизировали и помещали в 1% раствор трифенилтетразолия хлорида (pH 7,4). Термостатировали на водяной бане на 20 мин при температуре 37 °C. Далее полученную смесь центрифугировали при 5000 об/мин. в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в 3 мл фосфатного буфера, встряхивали и добавляли 3 мл охлажденного хлороформа. Экстракцию формазана хлороформом проводили в течение 15 мин при 4 °C, встряхивая смесь каждые 5 мин по 30 с. Окрашенный хлороформ отделяли центрифугированием (в аналогичном режиме), и после предварительного разведения хлороформом в соотношении 1:5 измеряли оптическую плотность при длине волны 492 нм против чистого хлороформа [14].
Дизайн исследования и проводимые с животными манипуляции соответствовали международным этическим принципам работы с лабораторными животными, изложенными в руководстве ARRIVE 2.0. [20].
Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программного пакета Statistica 6.0. Результаты выражались в виде M±SEM (среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения). Сравнение средних проводилось методом ANOVA с post-hoc тестом Ньюмена—Кейлса в случае данных, подчиняющихся закону нормального распределения, и тестом Краскела—Уоллиса при распределении данных, отличном от нормального. Нормальность распределения проверялась с помощью теста Шапиро—Уилка. Различия между исследуемыми группами считались статистически значимыми при p<0,05.
Результаты
У НК группы крыс в сравнении с ЛО животными отмечено снижение активности митохондриальных комплексов (табл. 1), при этом активность комплекса I уменьшилась на 68,5% (p=0,043), комплекса II — на 61,7% (p=0,021), комплекса III — на 55,7% (p=0,047), комплекса IV — на 52,0% (p=0,036) и комплекса V — на 78,6% (p=0,027). У животных, получавших L-карнитин,, наблюдалось повышение активности комплексов митохондриальной дыхательной цепи относительно крыс НК группы: комплекса I — на 51,8% (p=0,012); комплекса II — на 67,9% (p=0,028); комплекса III — на 32,6% (p=0,041); комплекса IV — на 20,6% (p<0,05) и комплекса V — на 79,4% (p=0,033). Аналогичная тенденция изменений была получена при введении животным исследуемых соединений, при этом наиболее значимые изменения активности митохондриальных комплексов были отмечены на фоне применения веществ под лабораторными шифрами PYrm1; PYrm3 и PYrm10. Так, у животных, которым вводили PYrm1, активность комплексов I—V была выше аналогичной у НК группы крыс на 80,9% (p=0,042); 45,9% (p=0,034); 60,7% (p=0,045); 27,1% (p=0,024) и 76,5% (p=0,046) соответственно. В то же время при применении соединения PYrm3 активность комплекса I увеличилась по отношению к НК группе животных на 93,6% (p=0,03); комплекса II — на 43,9% (p=0,029); комплекса III — на 24,7% (p=0,024); комплекса IV — на 43,9% (p=0,037); комплекса V — на 88,2% (p=0,04). У крыс, получавших PYrm10, наблюдалось повышение активности дыхательных комплексов I—V в сравнении с НК группой животных на 108,9% (p=0,011); 59,4% (p<0,02); 40,4% (p=0,042); 27,1% (p=0,039) и 97,1% (p=0,017). Стоит отметить, что статистически значимых отличий между животными, которым вводили изучаемые производные пиримидина и референтный препарат, установлено не было.
Таблица 1. Изменение активности дыхательных комплексов в митохондриальной фракции
| Группа | Комплекс I, ppm/мг белка | Комплекс II, ppm/мг белка | Комплекс III, Ед/мг белка | Комплекс IV, ppm/мг белка | Комплекс V, ppm/мг белка |
| ЛО | 17,8±1,2 | 18,8±1,3 | 20,1±1,6 | 22,3±2,5 | 15,9±2,7 |
| НК | 5,6±1,4# | 7,2±2# | 8,9±1,6# | 10,7±2,5# | 3,4±1,9# |
| L-карнитин | 8,5±2,7* | 12,1±2,8* | 11,8±1,7* | 12,9±1,4* | 6,1±3* |
| PYrm1 | 10,1±2,8 | 10,51±1,1* | 14,3±1,8* | 13,6±1,5* | 6±1,1* |
| PYrm2 | 7,8±1,2 | 8,1±2,5 | 9,8±2,5 | 10,5±1,8 | 3,9±2,4 |
| PYrm3 | 10,8±2.0* | 10,3±2,1* | 11,1±2,1* | 15,4±2,3* | 6,4±2,9* |
| PYrm4 | 6,7±2.0 | 8,6±1,5 | 9,6±2,3 | 11,6±1,6 | 4,1±1,8 |
| PYrm5 | 6,3±2,3 | 8,2±2,2 | 9,1±2,9 | 10,1±2,4 | 6,3±2,7 |
| PYrm6 | 6,2±2,6 | 7,2±2,9 | 9,2±1,5 | 10,9±2,1 | 5,1±2,5 |
| PYrm7 | 5,8±2,3 | 7,9±2 | 8,4±2,4 | 11,3±2,4 | 5,4±2,9 |
| PYrm8 | 6,1±1,8 | 8,5±1,3 | 8,6,3±1,7 | 11,6±2,9 | 5,1±2,3 |
| PYrm9 | 6,5±3 | 8,9±2,6 | 9,4±1,1 | 9,2±2,3 | 4,4±2 |
| PYrm10 | 11,7±1,1* | 11,48±1,5* | 12,5±2,4* | 13,6±1,4* | 6,7±2* |
Примечание. Здесь и в табл. 2. # — статистически значимо относительно ЛО группы животных (критерий Ньюмена—Кейлса); * — статистически значимо относительно НК группы животных (критерий Ньюмена—Кейлса).
У НК группы крыс в условиях ишемии головного мозга в сравнении с ЛО группой животных наблюдалось снижение активности цитратсинтазы в 2,6 раза (p=0,015), аконитазы в 8,3 раза (p=0,035) и α-кетоглутаратдегидрогеназы на 64% (p=0,026) (табл. 2). На фоне введения животным L-карнитина отмечено увеличение активности цитратсинтазы, аконитазы и α-кетоглутаратдегидрогеназы по отношению к аналогичным показателям НК группы крыс на 53,6% (p=0,016); в 4,4 раза (p=0,012) и на 40,8% (p=0,041) соответственно. В ряду изучаемых веществ наиболее значимое влияние на изменение активности ферментов митохондриального происхождения оказало введение соединений PYrm3, PYrm10. Так, у крыс, получавших данные соединения, активность цитратсинтазы была выше аналогичного показателя у НК группы крыс на 47,4% (p=0,032) и 55,9% (p=0,014) соответственно. В то же время активность аконитазы при применении исследуемых производных пиримидина также имела тенденцию к увеличению, при этом на фоне введения животным соединения PYrm3 активность фермента возросла по отношению к НК группе в 5,2 раза (p=0,024); PYrm10 —в 4,1 раза (p=0,039). Активность α-кетоглутаратдегидрогеназы на фоне введения исследуемых веществ PYrm3 и PYrm10 увеличилась в сравнении с таковой у НК группы животных на 12,3% (p=0,028) и 20,4% (p=0,027) соответственно.
Таблица 2. Изменение активности митохондриальных энзиматических систем в мозговой ткани
| Группа | Цитратсинтаза, Ед/мг белка | Аконитаза, Ед/мг белка | α-кетоглутаратдегидрогеназа, Ед/мг белка |
| ЛО | 40,1±4,397 | 6,9±0,401 | 1221,2±42,828 |
| НК | 15,2±2,233# | 0,83±0,073# | 745,3±51,346# |
| L-карнитин | 23,3±3,331* | 3,7±0,815* | 1049,7±67,558* |
| PYrm1 | 19,3±2,7 | 4,5±0,9 | 935,8±75,3 |
| PYrm2 | 18,1±4,1 | 4,5±1,2 | 919,5±72,8 |
| PYrm3 | 22,4±2,5* | 4,3±1,1* | 837,5±68,5* |
| PYrm4 | 20,2±2,8 | 3,7±0,9 | 867,1±70,4 |
| PYrm5 | 24,9±4,1 | 3,9±0,9 | 841,6±51,2 |
| PYrm6 | 18,4±2,5 | 4,9±0,9 | 937,1±54,2 |
| PYrm7 | 22,6±2,7 | 4,6±1,2 | 878,3±71,6 |
| PYrm8 | 20,8±3,9 | 3,3±0,9 | 916,2±64,6 |
| PYrm9 | 18,5±3,2 | 3,9±1,1 | 996,4±62,4 |
| PYrm10 | 23,7±3,2* | 3,4±0,9* | 897±71,9 |
Стоит отметить, что применение L-карнитина, соединений PYrm3 и PYrm10 способствовало уменьшению зоны некроза головного мозга по отношению к НК группе животных на 22,3% (p=0,04); 21,7% (p=0,047) и 24,4% (p=0,043) соответственно (см. рисунок). При этом статистически значимых отличий между группами животных, получавших референтный препарат и исследуемые соединения PYrm3 и PYrm10, установлено не было.
Изменение зоны некроза головного мозга.
* — статистически значимо относительно НК группы животных (критерий Ньюмена—Кейлса).
Обсуждение
На сегодняшний день установлено, что митохондриальная дисфункция является неотъемлемой составляющей «ишемического каскада», она непосредственно связана с другими его элементами, такими как окислительный стресс, нейровоспаление, апоптоз, нарушение проницаемости гематоэнцефалического барьера и эксайтотоксичность. В связи с этим восстановление функциональной активности нейрональных митохондрий может являться перспективным направлением нейпропротективной терапии. В ряде экспериментальных работ было показано, что основные метаболические сдвиги, ответственные за развитие дисфункции митохондрий, наблюдаются либо при недостатке восстановительных эквивалентов, поступающих из цикла трикарбоновых кислот, либо связаны с разобщением активности митохондриальных дыхательных комплексов или проявляются по совокупности данных патологических процессов [21]. В связи с этим было проведено исследование, посвященное изучению влияния 10 новых производных пиримидин-4-H1-OHa на изменение активности митохондриальных комплексов и ферментов цикла трикарбоновых кислот у крыс в условиях ишемии головного мозга, которое показало, что применение исследуемых производных пиримидина под шифрами PYrm3 и PYrm10 позволило скорректировать возникшую митохондриальную дисфункцию, при этом наблюдались как стабилизация работы дыхательных комплексов, так и повышение активности ферментов митохондриального происхождения. При этом увеличение активности цитратсинтазы может являться свидетельством повышения митохондриогенеза de novo. Известно, что аконитаза — железо-серный кластерный фермент, чрезвычайно чувствительный к недостатку кислорода, при нехватке которого отмечается увеличение Fe-зависимого образования активных форм кислорода (АФК) [22]. В связи с этим восстановление функциональной активности аконитазы, наблюдаемое на фоне введения животным изучаемых соединений, предполагает наличие у изучаемых производных пиримидин-4-H1-OHa, содержащих в боковой цепи сопряженную двойную связь и замещенный фенол, влияния на окислительный метаболизм и процесс генерации свободных радикалов. Кроме того, снижение генерации АФК может лежать в основе восстановления активности митохондриальных дыхательных комплексов и α-кетоглутаратдегидрогеназы [23].
Заключение
В ходе исследования было установлено, что применение производных пиримидин-4-H1-OHa под шифрами PYrm3 и PYrm10 в условиях экспериментальной ишемии головного мозга у крыс способствовало восстановлению активности комплексов митохондриальной дыхательной цепи, а также ферментов цикла трикарбоновых кислот: аконитазы, цитратсинтазы и α-кетоглутаратдегидрогеназы, что в совокупности приводило к уменьшению зоны некроза головного мозга. Таким образом, производные пиримидина PYrm3 и PYrm10 являются перспективными объектами для дальнейшего изучения и создания нейропротективных средств метаболического действия.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.