Поиск генов, ассоциированных с шизофренией, является одной из приоритетных задач в фундаментальных психиатрических исследованиях. Связано это с необходимостью углубленного изучения патогенеза заболевания, что может дать ключ к обнаружению новых целей для медицинских вмешательств разного рода. Генетический риск заболевания объясняется генетическим полиморфизмом, т.е. различными вариантами структуры генов в геноме [1]. В известном генетическом исследовании выявлено более ста независимых ассоциаций, охватывающих 108 консервативно определенных локусов [2]. Небезосновательно считается, что шизофрения является высокополигенным заболеванием, что обусловлено сотнями или тысячами различных генетических локусов, задействованных на уровне популяций [3]. Из этого следует, что различные генетические варианты сами по себе не обладают высокой прогностической ценностью для рассматриваемой патологии. Длительное время в исследованиях приоритет отдавался генам-кандидатам, которые связаны с известными фармакологическими мишенями [4], такими как гены дофаминовых рецепторов. Однако было показано, что их прогностическая значимость не превосходит ценность взятых наугад других генов-кандидатов [5]. В целом однозначной генетической причины заболевания не установлено [6].
Также существуют проблемы методологического характера при поиске генетических маркеров заболевания. Например, было установлено, что 24 варианта 16 различных генов (APOE, COMT, DAO, DRD1, DRD2, DRD4, DTNBP1, GABRB2, GRIN2B, HP, IL1B, MTHFR, PLXNA2, SLC6A4, TP53 TPH1) могут иметь ассоциацию с заболеванием [7]. Однако анализ большого количества генов одновременно не позволяет делать столь однозначный вывод из-за необходимости выполнять коррекцию на множественное тестирование гипотез, что было продемонстрировано для генов COMT, DRD3, DRD2, HTR2A, NRG1, BDNF, DTNBP1 и SLC6A4 [8]. Ограничение размера выборки рассматривается как важнейшая проблема в исследованиях такого рода [2].
Низкая прогностическая сила генетических переменных значительно осложняет изучение данной проблематики. В исследовании L. Antonucci и соавт. [9] при оценке вероятности попадания в группу больных использовались когнитивные, средовые и генетические предикторы. Когнитивные факторы корректно отделяли норму от патологии в 88,7% случаев, тогда как генетические факторы обеспечивали корректное решение всего лишь в 55,5% случаев.
Несмотря на значительный массив накопленных данных, необходимо не только искать новые гены-кандидаты. Результаты уже выполненных исследований специфичны для конкретного набора данных (подмножество), но обобщать их на все данные (множество) в общем случае неверно [10]. Кризис воспроизводимости рассматривается как крайне серьезная научная проблема [11], которая не обошла биологическую психиатрию [12]. Таким образом, важно предпринимать попытки воспроизвести ранее полученные результаты. Недавняя публикация российских коллег была выполнена на пациентах молодого возраста, проживающих в Москве [13]. Выполнить схожее исследование в другом крупнейшем городе России представляется важным для описания естественной гетерогенности результатов [14].
Для возможного уточнения ассоциации полиморфизмов с шизофренией внимание было сосредоточено на двух широко изученных полиморфизмах и на полиморфизме, изучение которого началось сравнительно недавно. В качестве первого маркера был выбран полиморфизм rs6280 гена DRD3. Ген DRD3 кодирует дофаминовый рецептор 3-го типа, локализуется в 3-й хромосоме (бэнд q13.3) [15]. Аллель C кодирует аминокислоту глицин, аллель T — серин [16]. Данный рецептор рассматривается в качестве гена-кандидата в связи с его ролью в дофаминергической нейротрансмиссии [15]. Функциональная роль полиморфизма связана с изменением афинности рецептора к дофамину и внутриклеточного проведения сигнала [17]. Также у пациентов было обнаружено увеличение плотности DRD3 в области полосатого тела, накопление «усеченных форм» рецепторного белка, образующегося во время альтернативного сплайсинга [13].
Полиморфизм rs4680 гена COMT был выбран в качестве второго маркера. Ген COMT кодирует катехол-о-метилтрансферазу, локализуется в 22-й хромосоме (бэнд q11.21) [18]. Аллель G кодирует валин, аллель A — метионин [16]. Данный фермент играет ключевую роль в метаболизме катехоламинов, к которым относятся дофамин, норадреналин. С полиморфизмом rs4680 связана активность фермента, которая определяет уровень концентрации дофамина при передаче сигнала [18]. Кроме того, для европиодиной расы показан повышенный риск развития шизофрении в рамках аддитивной и рецессивной моделей [19].
Полиморфизм rs7322347 гена HTR2A был выбран в качестве третьего маркера. Ген HTR2A кодирует серотониновый рецептор 2a, локализуется в 22-й хромосоме (бэнд q11.21) [18]. Аллель G кодирует валин, аллель A — метионин [16]. Выбор полиморфизма обусловлен недавними публикациями российских коллег о его возможной ассоциации с заболеванием в российской популяции [13].
Цель исследования — поиск ассоциации генетических полиморфизмов rs6280 гена DRD3, rs4680 гена COMT, rs7322347 гена HTR2A с параноидной шизофренией.
Материал и методы
В выборку вошли 300 больных параноидной шизофренией, госпитализированных в СПб ГКУЗ «Городская психиатрическая больница №3 им. И.И. Скворцова-Степанова».
Критерии включения: возраст 18—50 лет, установленный диагноз «шизофрения, параноидная форма», давность психических нарушений не менее 5 лет.
Критерии невключения: острый психоз (общий балл по PANSS >120), выраженные соматические расстройства, затрудняющие повседневное функционирование, интенсивная фармакотерапия, снижающая внимание и способность воспринимать новую информацию. Диагноз «Параноидная шизофрения» верифицировался с использованием структурированного клинического интервью для DSM-5 [20]. Для характеристики частоты аллелей в здоровой популяции использовалась контрольная группа 290 наблюдений. Контрольная группа сформирована из добровольцев, сдававших кровь в ГБУЗ «Центр крови им. О.К. Гаврилова» (Москва).
Критерии исключения: положительный семейный анамнез (родственники первой степени родства) по психическим заболеваниям; злоупотребление психоактивными веществами; аномальные роды; фебрильные судороги. Все участники (основная и контрольная группы) относились к славянской этнической группе. Перед включением в исследование участники знакомились и подписывали добровольное информированное согласие. Исследование одобрено Локальным этическим комитетом ФГОБУ СЗГМУ им. И.И. Мечникова (протокол №4 от 04.04.18).
Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови с использованием роботизированной системы Qiagen QiaCube (набор QiAmp Blood Mini Kit, «Qiagen», ФРГ) и на магнитных микрочастицах (ООО «Синтол», Россия). После выделения проводили спектрофотометрический скрининг полученного материала с помощью спектрофотометра Nanoview («GE Healthcare», США). Далее производили нормализацию полученных образцов ДНК в ТЕ буфере до конечной концентрации 4 нг/мкл в формате 96-луночного планшета с использованием стандартных протоколов роботизированной станции QiAgility («Qiagen», ФРГ). Для определения генетических полиморфизмов использовали технологию идентификации однонуклеотидных полиморфизмов с применением TaqMan-MGB (TaqMan minor groove-binding (MGB) probes, «Applied Biosystems», Thermo Fisher, США) зондов на амплификаторе StepOne Plus («Applied Biosystems», США).
Для описания категориальных переменных использовались абсолютные значения и доли от целого — n (%). Переменные, имеющие непрерывный характер распределения, описывались средним и стандартным отклонениями (M (σ)), дискретные переменные и упорядоченные данные — медианой, 1—3м квартилем (Md [iqr]). Межгрупповое сравнение в случае двух групп осуществлялось при помощи критерия Манна—Уитни (U-статистика). Для оценки межгруппового распределения частот использовался критерий χ2 Пирсона (χ2-статистика). Соответствие распределений закону Харди—Вайнберга выполнено точным критерием (пакет genetics [21]) согласно рекомендациям, изложенным в специализированной литературе [22]. Модель логистической регрессии использовалась для комплексной оценки риска заболевания. В качестве независимых переменных использовались исследованные полиморфизмы, пол и возраст. Принадлежность к основной или контрольной группе выступала в качестве зависимой переменной. Коэффициенты регрессии представлены в виде отношения шансов и их 95% доверительного интервала. Селекция моделей осуществлялась на основе информационных критериев Акаике (AIC) и Шварца (BIC) при обратном пошаговом отборе (функция stepAIC). Модели характеризовались чувствительностью, специфичностью, площадью под кривой ошибок (AUC) [23], коэффициентом псевдодетерминации Tjur’s (R2) [24]. В случае множественного тестирования гипотез использовалась поправка Беньямини—Хохберга. Нулевые гипотезы отклонялись при p<0,05. Расчеты проводились на языке программирования R v3.6.1 [25].
Результаты
Средний возраст в основной группе составил 35,9±10,1 года, что статистически значимо (U=26318,0, p<0,001) отличалось от среднего возраста контрольной группы (29,2±9,0 года). Исследуемые группы также различались по полу. В группе пациентов наблюдалось практически равное распределение мужчин (n=151, 50,3%) и женщин (n=149, 49,7%), в то время как в контрольной группе доля лиц мужского пола (n=245, 84,5%) преобладала над долей лиц женского пола (n=45, 15,5%).
Выраженность позитивной симптоматики по шкале PANSS в группе пациентов соответствовала 14,0 [11,0; 18,0] балла, негативной — 21,0 [17,0; 27,0] балла, других симптомов — 33,0 [27,8; 38,0] балла. С момента манифеста заболевания прошло 9,0 [6,0; 18,0] года. Количество госпитализаций варьировало от 1 до 8. Высшее или неоконченное высшее образование было у 150 (50,0%) участников исследования. Работали или учились 73 (24,3%) пациента, инвалидность имели 143 (47,7%). Большая часть больных в браке никогда не состояли (n=218, 72,7%), детей не имели (n=227, 75,7%).
В табл. 1 представлен анализ соответствия распределения аллелей закону Харди—Вайнберга в группах. Данных, свидетельствующих об отклонении наблюдаемых частот от теоретических, получено не было как в основной группе, так и в контрольной.
Таблица 1. Встречаемость аллелей и проверка соответствия распределений закону Харди—Вайнберга в основной и контрольной группах
| Полиморфизм | Основная группа n=300 (p скорректированное) | Контрольная группа n=290 (p скорректированное) | ||||
| rs6280 | T — 446 (74,3%) | C — 154 (25,7%) | p=1,000 | T — 442 (76,2%) | C — 138 (23,8%) | p=0,152 |
| rs4680 | A — 319 (53,2%) | G — 281 (46,8%) | p=1,000 | A — 307 (52,9%) | G — 273 (47,1%) | p=0,724 |
| rs7322347 | T — 359 (59,8%) | A — 241 (40,2%) | p=1,000 | T — 399 (68,8%) | A — 181 (31,2%) | p=0,622 |
В табл. 2 представлено сравнение распределений частот изучаемых генотипов между основной и контрольной группами. По полиморфизму rs6280 генотип TT имел сопоставимые доли между группами. Гетерозиготный вариант CT в основной группе встречался немного реже, а генотип CC — чаще по сравнению с контрольной группой. Несмотря на выявленную разницу в структуре распределений, гипотеза о равенстве частот не была отклонена (p=0,094). При анализе полиморфизма rs4680 установлено практически идентичное распределение частот генотипов в группах, в связи с чем сравниваемые выборки статистически не различались (p=0,963).
Таблица 2. Сравнительная характеристика частот генотипов между группами
| Полиморфизм | Генотип | Основная группа (n=300 ) | Контрольная группа (n=290) | Статистика критерия (p скорректированное) |
| rs6280 | CC | 23 (7,7%) | 10 (3,4%) | χ2=5,5 (2), p=0,094 |
| — | CT | 108 (36,0%) | 118 (40,7%) | — |
| — | TT | 169 (56,3%) | 162 (55,9%) | — |
| rs4680 | AA | 85 (28,3%) | 83 (28,6%) | χ2=0,1 (2), p=0,963 |
| — | AG | 149 (49,7%) | 141 (48,6%) | — |
| — | GG | 66 (22,0%) | 66 (22,8%) | — |
| rs7322347 | AA | 50 (16,7%) | 25 (8,6%) | χ2=11,1 (2), p=0,012 |
| — | AT | 141 (47,0%) | 131 (45,2%) | — |
| — | TT | 109 (36,3%) | 134 (46,2%) | — |
Выявлена разница (p=0,012) при сравнении генотипа по полиморфизму rs7322347 между группами. Гетерозиготный вариант (AT) имел сопоставимую частоту (45—47%) в группах. В ходе дополнительного анализа остатков установлено, что разница в распределении обусловлена низкой встречаемостью генотипа AA и большим удельным весом генотипа TT в контрольной группе при сравнении с основной группой (8,6% против 16,7%, p=0,020; 46,2% против 36,3%, p=0,045 соответственно).
Далее выполнялся регрессионный анализ. Исходная модель (Модель 1) включала все заявленные полиморфизмы, а также пол и возраст в качестве ковариат. Полученная модель подвергалась оптимизации путем уменьшения целевого значения AIC. Уменьшение было достигнуто за счет исключения полиморфизма rs4680 из модели (Модель 2). Далее было выполнено объединение статистически не отличающихся друг от друга категорий внутри полиморфизмов, что также привело к снижению AIC (Модель 3). Результаты моделирования представлены в табл. 3.
Таблица 3. Модели ассоциации между полиморфизмами генов DRD3 (rs6280), COMT (rs4680), HTR2A (rs7322347) и риском шизофрении
| Параметр | Модель 1 (ОШ (95% ДИ)) | Модель 2 (ОШ (95% ДИ)) | Модель 3 (ОШ (95% ДИ)) |
| Константа | 1,72 (0,51; 5,89) | 1,97 (0,61; 6,62) | 0,77 (0,26; 2,31) |
| rs6280: | — | — | — |
| CC | 1,00 | 1,00 | — |
| CT | 0,25 (0,10; 0,59) | 0,26 (0,11; 0,60) | — |
| TT | 0,31 (0,13; 0,71) | 0,32 (0,13; 0,74) | — |
| rs7322347: | — | — | — |
| AA | 1,00 | 1,00 | — |
| AT | 0,65 (0,35; 1,17) | 0,66 (0,36; 1,19) | — |
| TT | 0,38 (0,21; 0,69) | 0,39 (0,21; 0,71) | — |
| rs4680: | — | — | — |
| AA | 1,00 | — | — |
| AG | 1,30 (0,84; 2,03) | — | — |
| GG | 1,29 (0,76; 2,20) | — | — |
| Пол | — | — | — |
| женский | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| мужской | 0,18 (0,12; 0,28) | 0,19 (0,12; 0,28) | 0,19 (0,12; 0,28) |
| Возраст, годы | 1,07 (1,05; 1,10) | 1,07 (1,05; 1,09) | 1,07 (1,05; 1,09) |
| rs6280: | — | — | — |
| [CT TT] | — | — | 1,00 |
| CC | — | — | 3,37 (1,50; 8,03) |
| rs7322347: | — | — | — |
| TT | — | — | 1,00 |
| [AT AA] | — | — | 1,83 (1,25; 2,68) |
| Характеристики модели | |||
| AIC | 678,96 | 676,46 | 675,60 |
| R2 | 0,240 | 0,238 | 0,233 |
| Площадь под кривой (AUC (95% ДИ)) | 78,1 (74,5—81,8) | 78,0 (74,3—81,6) | 77,5 (73,8—81,2) |
| Чувствительность | 55,0 (49,3—60,3) | 56,7 (51,0—62,0) | 55,7 (50,3—61,0) |
| Специфичность | 87,9 (84,1—91,4) | 86,6 (82,4—90,3) | 87,6 (83,8—91,4) |
Согласно Модели 3, генотип CC полиморфизма rs6280 статистически значимо (в 3,37 (1,50; 8,72) раза) увеличивал риск шизофрении, тогда как генотип TT полиморфизма rs7322347 риск снижал в 1,83 (1,25; 2,68) раза.
Обсуждение
Исследование продемонстрировало, что полиморфизм гена DRD3 (rs6280) статистически значимо ассоциирован с расстройством при помощи логистической регрессии, тогда как классический подход к анализу (с учетом коррекции на множественное тестирование гипотез) такой вывод не поддерживает. С аналогичной проблемой для rs6280 исследователи уже сталкивались [26]. Данные по ассоциации полиморфизма с шизофренией противоречивы. В метаанализе K. Utsunomiya и соавт. [27] доказать ассоциацию полиморфизма для японской популяции не удалось (ОШ 1,16 (0,97; 1,39)). Отсутствие ассоциации между рассматриваемым полиморфизмом и заболеванием продемонстрировано в ходе другого крупного метаанализа (ОШ 0,95 (0,85; 1,06)) [15]. Однако для российской популяции была показана слабая связь (p=0,030, ОШ 1,34 (1,04; 1,72), аллель C) между данным полиморфизмом и заболеванием [13]. Также выявлено протективное влияние аллели T для восточно-азиатской популяции (ОШ=0,74 (0,56; 0,98)), но не для европейской (ОШ=1,05 (0,92; 1,20)) [28].
Для генотипа GG полиморфизма rs4680 гена COMT не выявлено никакой ассоциации между заболеванием при помощи как логистической модели, так и классического статистического анализа. Это согласуется с результатами, полученными на российской популяции (p=0,420, ОШ 0,91 (0,73; 1,14), аллель A) [13]. На сформированной в Греции выборке также не удалось выявить ассоциацию с шизофренией как в рамках классического частотного анализа, так и при помощи моделирования [29]. Результаты согласуются с метаанализом, выполненным на европейских и азиатских данных, по данным которого не удалось выявить связь между болезнью и генотипами/аллелями rs4680 [30]. Однако в недавнем исследовании коллег из Японии были получены результаты, прямо указывающие на ассоциацию аллели A с расстройством (ОШ 1,24 (1,06; 1,46)) [31]. В то же время для генотипа GG показана связь с повышенным риском развития шизофрении только у представителей европеоидной расы (ОШ=1,21 (1,11; 1,32)) [19]. Кроме того, сообщалось о значимой ассоциации аллели G с заболеванием только у лиц женского пола (p<0,001) [13].
Информация о значимых различиях (p<0,001, ОШ 0,63 (0,50; 0,80), аллель T) по частотному распределению аллелей между больными шизофренией и группой контроля полиморфизма rs7322347 гена HTR2A показана недавно московскими коллегами [13]. Исследований из других регионов России и государств с использованием рассматриваемого полиморфизма в качества маркера заболевания нами обнаружено не было.
Ограничения исследования. В качестве ограничения выступает относительно маленький размер выборки основной и контрольной групп. В исследование включены только лица славянской этнической группы, потому результаты могут не подходить для других этносов. Данные по основной и контрольной группам собраны в крупнейших городах России, поэтому крайне важно проведение аналогичных исследований в других регионах России, в том числе малонаселенных.
Заключение
С учетом рассмотренных ограничений возможно сделать следующие выводы. Генотип CC полиморфизма rs6280 чаще встречался у больных параноидной шизофренией (ОШ 3,37 (1,50; 8,03)). Генотип T/T полиморфизма rs7322347 реже встречался у больных (ОШ 1,83 (1,25; 2,68)). Генотипы C/T и T/T полиморфизма rs6280 статистически значимо чаще встретились в группе контроля, тогда как генотипы A/T и A/A полиморфизма rs7322347 значимо чаще встретились в группе шизофрении. Данные проведенного анализа подтвердили гипотезу об ассоциации генетических полиморфизмов rs7322347 и rs6280 с заболеванием. Гипотеза об ассоциации полиморфизма rs4680 с риском развития заболевания не подтверждена.
Исследование выполнено в рамках проекта РФФИ №17-29-02173 «Оценка влияния средовых патопластических факторов на клинические проявления шизофрении с учетом генотипа пациента».
The study was conducted within the RFBR project 17-29-02173 «Assessment of the influence of environmental pathoplastic factors on the clinical manifestations of schizophrenia, taking into account the patient’s genotype».
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.