Диффузные глиомы представляют собой важную проблему в нейроонкологии, поскольку, несмотря на относительно небольшую распространенность, характеризуются высокой смертностью и весьма ограниченным спектром лечения [1—4]. Особенно это касается анапластических глиом и глиобластом, и если последние являются предметом интенсивного изучения, то анапластическим астроцитомам (АА, астроцитомы grade 3 по классификации ВОЗ 2021 г., где термин «grade» отражает степень злокачественности новообразования) уделяется существенно меньшее внимание. Между тем они обладают собственными, во многом уникальными по сравнению с глиобластомами, молекулярными свойствами и патогенетическими особенностями, что находит отражение и в их биологическом поведении и, как следствие, в клинических проявлениях заболевания [4—7]. Поэтому прицельное изучение различных аспектов развития АА представляет научный интерес.
АА, как и глиобластомы, имеют диффузный характер роста. Это свойство имеет крайне важное значение в повышении степени агрессивности опухоли, поскольку позволяет глиоме быстро проникать в новые, ранее интактные зоны мозга. Опухолевая инвазия позволяет ей не только относительно быстро захватывать новые регионы, но и получать лучший доступ к кислороду и питательным веществам для поддержания своей жизнедеятельности и развития. Крайне любопытным аспектом инфильтративного роста, получившим определенное освещение при исследовании глиобластомы, стало участие нормальных нейромедиаторных систем мозга в процессе распространения новообразования, в том числе глутаматергической системы, представленной NMDA- и AMPA-рецепторами [8, 9]. NMDA-рецептор представляет глутаматный ионотропный рецептор на поверхности нейронов. Данная разновидность рецепторов играет существенную роль в обеспечении механизмов нейрональной пластичности [10, 11]. NMDA-рецепторы принимают участие в механизмах обучения и различных видов памяти [12—14]. AMPA-рецепторы также представляют ионотропные глутаматные рецепторы, которые аналогично NMDA-рецепторам играют роль в обеспечении механизмов синаптической пластичности [11].
В нейроонкологии в бóльшей степени изучены AMPA-рецепторы. В частности, показано, что на опухолевых клетках глиобластомы наблюдаются высокий уровень экспрессии и значительная плотность данных рецепторов [14, 15]. Кроме того, описано стимулирование опухолевыми клетками повышенной продукции нейронами перифокальной зоны мозга глутамата, который соединяется со своими рецепторами на клетках новообразования, что способствует усилению их подвижности и инвазивных свойств [16, 17]. Существует вероятность, что ключевой опухолевой клеточной популяцией, проявляющей наибольшую глутаматергическую и инвазивную активность, являются глиомные стволовые клетки. Также было показано, что как AMPA-, так и NMDA-рецепторы глутамата и глутаматергические системы сигналинга непосредственно участвуют в распространении клеток опухоли в интактном мозге и периферической зоне опухоли, причем несколько лучше механизмы подобного распространения изучены также для AMPA-рецепторов [18, 19]. Более того, опосредованная NMDA-рецепторами экспрессия EGR-1 фактора была связана с прогнозом общей выживаемости пациентов с глиобластомами [20].
Таким образом, глутамат в случае глиобластомы способствует повышению активности миграции опухолевых клеток, а также, возможно, выступает своеобразным хемоаттрактантом, способствующим продвижению клеток глиомы в нужном направлении. Исследование этих механизмов может стать основой для создания принципиально новых не только диагностических, но и лечебных подходов. С одной стороны, будучи важнейшим механизмом обеспечения инфильтративного роста опухоли, статус глутаматергических систем может стать весьма информативной мишенью для оценки общей степени агрессивности опухоли, а также ее злокачественного потенциала и потенциала дальнейшего рецидивирования. Тем более моделирование функционирования данного вида рецепторов, в том числе их ингибирование, не раз применялось в рамках клинических испытаний при лечении других, неопухолевых патологий, в частности болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и бокового амиотрофического склероза [21—23]. С другой стороны, блокада подобного механизма может оказаться эффективным способом борьбы с распространением диффузных глиом, позволяющим существенно повысить общую и безрецидивную выживаемость пациентов.
Тем не менее роль глутаматергических механизмов в распространении и прогрессировании именно АА изучена недостаточно. Кроме того, сравнительно слабо охарактеризовано место в данных процессах NMDA-рецепторов глутамата.
Цель исследования — изучение связи активности экспрессии NMDA-рецепторов глутамата с пролиферативной активностью и генетическими свойствами АА, а также выживаемостью пациентов с данным заболеванием.
Материал и методы
На базе ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» проводилось ретроспективное исследование. В него были включены 62 пациента с АА (28 женщин и 34 мужчины, средний возраст 40,4 (от 26 до 57) года), намеренно отобранных из базы Центра таким образом, что у 50% из них опухоль имела мутацию в гене IDH1, а у 50% — нет. Все пациенты подверглись оперативному вмешательству в Центре в 2016—2020 гг.
Критерии включения: возраст старше 18 лет, первичное оперативное вмешательство по поводу новообразования головного мозга, отсутствие предшествующего лечения, в том числе хирургического, химиотерапевтического и лучевой терапии, отсутствие на момент операции других онкологических заболеваний и других подтвержденных заболеваний головного мозга.
В подавляющем большинстве случаев пациентам выполнена операция удаления опухоли — 57 (91,9%), в 5 (8,1%) случаях выполнена ее стереотаксическая биопсия (СТБ). Среднее значение индекса Ki-67, применяемого в патоморфологии в качестве наиболее достоверного маркера пролиферативных процессов, составило 10 (9,95±2,1)%.
В послеоперационном периоде все пациенты были консультированы на онкологическом консилиуме в Центре нейрохирургии, и им было рекомендовано проведение адъювантной терапии. По данным катамнестического исследования, лучевая терапия была проведена в 54 (87,1%) случаях, не проводилась в 5 (8,1%) и для 3 (4,8%) пациентов нет данных о ее проведении. Химиотерапия проводилась в 52 (83,9%) случаях, 7 (11,3%) пациентов не получили данный вид лечения по различным причинам и в 3 (4,8%) случаях не получено достоверных данных о проведении химиотерапии. Глубина катамнеза составила 56,7 мес. Достоверные данные о рецидиве опухоли доступны для 59 больных, он произошел у 27 (45,8%) из них.
К моменту окончания исследования (апрель 2022 г.) 36 (58,1%) пациентов из 62 были живы, 26 (41,9%) — скончались. Общая выживаемость составила 41,2 (от 21,58 до 50,13) мес.
Гистологическое исследование. После описания и ориентирования фрагментов опухоли в гистологической кассете осуществлялась проводка блоков по спиртам для обезвоживания и обезжиривания, пропитывание парафином. После этого проводилось удаление парафина со срезов в двух ксилолах, по 2 мин в каждом. Срезы отмывались от ксилола в двух абсолютных спиртах по 1 мин и в двух 96 °C спиртах по 1 мин. Затем срезы промывались в воде и опускались в гематоксилин для окраски ядер клеток на 5 мин (гематоксилин Майера, «Sigma-Aldrich», США). После обработки гематоксилином проводилось промывание срезов водой для удаления избытка красителя. Затем срезы погружались в 5%-ный эозин («Sigma-Aldrich», США) для окраски цитоплазмы клеток на 30 с и снова промывались водой для удаления избытка красителя. После чего проводилось обезвоживание срезов в двух 96 °C спиртах по 1 мин и просветление в растворе карбол-ксилола, отмывание стекла от карбол-ксилола в ксилоле. Препарат заключался под покровное стекло.
Далее каждый препарат оценивался тремя опытными патологами с компетенциями в нейропатологии. На основании диагностических критериев, рекомендованных ВОЗ в рамках классификации опухолей ЦНС 4-го пересмотра от 2016 г., а также Ассоциацией онкологов России, Ассоциацией нейрохирургов России и Российским обществом клинической онкологии в рамках клинических рекомендаций и утвержденных Минздравом России, устанавливался патогистологический диагноз [1, 24].
Проведение иммуногистохимического исследования. Из парафиновых блоков с фиксированными в них образцами опухоли изготавливали срезы толщиной 3 мкм, депарафинировали с использованием ксилола и повторно гидратировали с помощью различных концентраций этанола, срезы высушивали в термостате при 45 °C. Затем срезы инкубировали с кроличьими моноклональными антителами против антигена Ki-67 человека (CONFIRM anti-Ki-67, «Roche-Ventana», США) и после этого конъюгировали с антикроличьими мышиными IgG антителами против пероксидазы хрена. Сайты связывания антител визуализировали с использованием тетрагидрохлорида 3,3’-диаминобензидина («Ventana Medical Systems», США), ядра клеток окрашивали гематоксилином. Подсчет индекса мечения Ki-67 осуществляли по стандартной методике в виде процента клеток с позитивной экспрессией данного маркера.
Проведение иммунофлюоресцентного исследования. Из парафиновых блоков с фиксированными в них образцами тканей изготавливали серийные срезы толщиной 3 мкм. Сначала образцы депарафинировали и регидратировали, последовательно погружая предметные стекла в ксилол, 100, 95, 70, 50%-ный этанол, деионизированную воду. Срезы высушивали в термостате при 45 °C. Затем срезы инкубировали с первичными моноклональными антителами к NMDA-рецепторам глутамата («Sigma-Aldrich», США) с метками зеленого цвета, разведенными в 1%-ном растворе PBS при комнатной температуре в течение 1—2 ч. Затем образцы в течение ночи инкубировали при 4 °C во влажной камере. После этого срезы дважды промывали с 1%-ным раствором PBS-T в течение 10 мин. Далее добавляли флюоресцентную метку конъюгированного вторичного антитела, разведенного в 1%-ном растворе PBS, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1—2 ч. Далее срезы дважды промывали с 1%-ным PBS-T в течение 10 мин. Затем наносили краситель DAPI. После инкубации с красителем слайды промывали 1 раз в течение 5 мин с PBS. Далее препараты подвергались конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с использованием конфокальной микроскопической системы Aperio VERSA («Leica», Германия).
Проведение ПЦР-исследования. Сначала проводили выделение тотальной РНК из всех образцов опухоли с применением набора RNeasy FFPE Kit («Qiagen», Германия) согласно рекомендациям производителя. Тотальную РНК растворяли в 10 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, и 1 мкг каждого образца РНК подвергали обратной транскрипции (ОТ) в кДНК с помощью набора RT EasyTM II (первая цепь кДНК для ПЦР в реальном времени) («Qiagen», Германия). ОТ-ПЦР выполняли с использованием набора EasyTM-SYBR Green I для ПЦР в реальном времени («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Условия состояли из начальной стадии денатурации при 95 °C в течение 2 мин, за которыми следовали 40 циклов из 30-секундных шагов денатурации при 95 °C, 30-секундной стадии отжига при от 53,5 °C до 56,5 °C и 1-минутной стадии удлинения при 72 °C. Также была проведена заключительная стадия удлинения продолжительностью 5 мин при 72 °C. Продукты амплификации ПЦР анализировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Все результаты ПЦР были получены с номером цикла, дающим сигнал на линейной части кривой амплификации. В качестве прямого праймера применяли 5′-CTTGAAGGCAATGAGCGCTAT-3′, в качестве обратного праймера — 5′-ACCCACAATGTTTGGCGATT-3′. Ген β-актина использовали в качестве внутреннего стандарта, данные выражали как отношение мРНК NMDA-рецепторов глутамата к мРНК β-актина.
Статистический анализ данных проведен с помощью языка статистического программирования и среды R (версия 3.6.1) в IDE RStudio (версия 1.2.1335). Распределение непрерывных и дискретных количественных переменных в выборке представлено как среднее арифметическое и стандартное отклонение (M±SD) для нормально распределенных случайных величин, медиана и квартили (Me [Q1; Q3]) для величин, распределение которых отличается от нормального. Категориальные показатели представлены как абсолютное число и процентное соотношение (n (%)). Соответствие выборки нормальному распределению определялось с помощью теста Шапиро—Уилка. Тестирование статистических гипотез о различии в распределении количественных переменных в независимых выборках проводили с помощью метода Манна—Уитни. Корреляцию между количественными величинами оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена. Задача определения клинических, рентгенологических и морфологических факторов прогноза общей и безрецидивной выживаемости решалась с помощью одномерного анализа влияния исследуемых признаков на продолжительность жизни и безрецидивного периода с последующим многомерным моделированием с помощью регрессии Кокса. Нулевую гипотезу в статистических тестах отклоняли при уровне значимости p<0,05.
Результаты
Среднее значение активности экспрессии NMDA-рецепторов в опухолевых образцах составило 53,46±17,2 (варьировало от 16,24 до 94,24) (рис. 1, а, б, на цв. вклейке). При сравнении этого показателя в группах IDH-позитивных (IDH+) и IDH-негативных (IDH–) АА стало очевидно, что для IDH+ опухолей значение NMDA достоверно (p<0,001) ниже, чем для IDH– АА: 44,49±15,5 против 62,42±13,9 (рис. 1, в, г, на цв. вклейке). Ожидаемо распределение мРНК NMDA также было достоверно выше в группе IDH– опухолей (6,81 [6,14, 8,46] против 4,54 [3,20, 5,43], p<0,001).
Рис. 1. Сравнение выраженности экспрессии NMDA-рецепторов в диффузных глиомах с наличием и отсутствием мутаций в гене IDH1.
а — результаты иммунофлюоресцентного исследования в астроцитоме IDH+, зеленым цветом флюоресцируют NMDA-рецепторы, увеличение ×400; б — результаты иммунофлюоресцентного исследования в астроцитоме IDH–, зеленым цветом флюоресцируют NMDA-рецепторы, увеличение ×400; в — средние значения выраженности экспрессии NMDA-рецепторов в зависимости от группы — IDH+ АА и IDH– АА; г — средние значения выраженности экспрессии мРНК NMDA-рецепторов в различных группах.
Анализ зависимости распространенности опухоли не продемонстрировал связи между вовлечением в опухолевый процесс нескольких долей мозга и значением активности NMDA-экспрессии в опухолевых клетках: 50,05 [37,79; 62,78] для пациентов с поражением одной доли против 55,16 [44,62;68,47] — с поражением 2 долей и более.
Значение индекса Ki-67 для IDH– АА составило 10,29, для IDH+ — 9,61, различия не достигли статистической значимости. Корреляционный анализ показал, что связь между экспрессией NMDA-рецепторов и значением индекса Ki-67 статистически значима (p<0,001, коэффициент корреляции составил 0,88). Ожидаемо распределение мРНК NMDA также продемонстрировало статистически достоверную связь с индексом Ki-67 (p<0,001, коэффициент корреляции составил 0,81).
При анализе общей выживаемости было установлено, что ее медиана составила 65,1 мес (рис. 2, а). Сравнение показателей общей выживаемости в зависимости от принадлежности к мужскому или женскому полу не выявило статистически достоверных различий. В то же время фактор возраста оказался статистически значимым по результатам применения трех различных статистических методов (Wald test, Likelihood ratio test, Score (logrank) test) — с увеличением возраста на момент диагноза продолжительность периода общей выживаемости снижалась. Количество вовлеченных в опухолевый процесс долей мозга также достоверно оказывало влияние на показатель общей выживаемости — с увеличением количества пораженных опухолевым процессом долей мозга срок общей выживаемости снижался (p=0,009). Вид хирургического вмешательства также оказывал влияние на продолжительность общей выживаемости — у пациентов, перенесших СТБ опухоли, этот показатель был статистически достоверно ниже, чем у больных после микрохирургического удаления опухоли (p=0,029).
Рис. 2. Кривые Каплана—Мейера общей (а) и безрецидивной выживаемости (б).
При сравнении сроков общей выживаемости в зависимости от распределения активности экспрессии NMDA-рецепторов, а также интенсивности экспрессии мРНК NMDA-рецепторов не было выявлено статистически достоверных различий при использовании какого-либо из 3 вышеназванных тестов.
Наличие IDH1-мутации являлось фактором, определяющим более благоприятный прогноз лечения (увеличивало продолжительность общей выживаемости, p=0,04). Адъювантная терапия в зависимости от вида оказывала различное влияние на показатель общей выживаемости в исследуемой группе: проведение лучевой терапии достоверно повышало этот показатель (p<0,001), в то время как химиотерапия на оказывала статистически значимого влияния.
При проведении регрессионного Cox-анализа наиболее значимыми неблагоприятными предикторами, влияющими на выживаемость, оказались мужской пол, принадлежность к старшей возрастной группе, локализация опухоли в теменной или островковой доле, отсутствие IDH-мутации, высокий показатель мРНК NMDA-рецепторов.
Медиана безрецидивной выживаемости составила 45,7 мес (рис. 2, б). При анализе различных факторов было установлено, что половая принадлежность не оказывала влияния на показатель безрецидивной выживаемости, в то время как возраст дебюта заболевания четко коррелировал с продолжительностью безрецидивного периода (обратная зависимость). Размер опухоли, косвенно оцениваемый по количеству вовлеченных долей мозга, оказывал статистически значимое влияние на безрецидивную выживаемость. Вид операции (СТБ против удаления) продемонстрировал различия на границе статистической достоверности (p=0,005), а значения индекса Ki-67 не оказывали влияния на безрецидивную выживаемость. Интересно, что экспрессия NMDA-рецепторов и соответственно мРНК NMDA четко коррелировала с безрецидивной выживаемостью (p=0,033 по трем различным тестам), хотя, как сказано выше, этот показатель не коррелировал с общей выживаемостью. Фактор наличия мутации IDH1, как и для общей выживаемости, не оказывал влияния на этот показатель. Наиболее сильная корреляция отмечена между фактом проведения лучевой терапии и длительностью периода безрецидивной выживаемости (p<0,001); при этом проведение химиотерапии достоверно не оказывало влияния на него.
Наиболее значимыми неблагоприятными предикторами, влияющими на риск рецидива, являлись возраст дебюта заболевания, вид хирургического вмешательства, отсутствие лучевой терапии в структуре адъювантного лечения и уровень экспрессии NMDA-рецепторов.
Обсуждение
Результаты исследования показали, что наблюдается очевидная и довольно сильная прямая связь активности экспрессии NMDA-рецепторов на как протеомном, так и транскриптомном уровнях с двумя важнейшими молекулярными маркерами степени биологической агрессивности диффузных глиом, а именно мутационным статусом генов IDH1/2, а также пролиферативным индексом мечения Ki-67. Мутации в генах IDH1/2 выступают в роли ранних молекулярных событий при возникновении и прогрессировании диффузных глиом, направляя их развитие в случае возникновения точковой мутации в относительно более доброкачественное русло. При этом, как показано в нашей работе, подобная более доброкачественная трассировка сопровождается и более низкими значениями экспрессии NMDA-рецепторов глутамата.
Будучи связанной с прогнозом выживаемости пациентов с диффузными глиомами, пролиферативная активность опухолей представляет собой важнейший молекулярный диагностический параметр. По представленным нами данным, выраженность клеточной пролиферации тем выше, чем выше продукция в клетках NMDA-рецепторов глутамата. Таким образом, из приведенных результатов следует, что активация глутаматергической нейромедиаторной системы посредством NMDA-рецепторов может служить важным механизмом повышения степени биологической агрессивности опухоли и злокачественности ее течения.
Полученные данные согласуются с ранее опубликованными результатами исследований. В частности, было показано формирование синаптических контактов между пресинаптическими нейронами мозговой ткани и постсинаптическими клетками глиомной ткани. Эти нейроглиальные синапсы имеют типичную синаптическую ультраструктуру, расположены на опухолевых микротрубках и продуцируют постсинаптические токи, опосредованные AMPA-глутаматными рецепторами. В функциональном отношении рассматриваемые процессы приводят к усилению инвазивности опухолевого роста, а также повышают жизнеспособность и подвижность опухолевых клеток [17—19]. По всей видимости, происходит своеобразное репрограммирование глутаматергической нейромедиаторной системы нормального мозга для обеспечения распространения глиомных клеток в мозговой ткани и дальнейшего прогрессирования патологического процесса.
Нами впервые показано, что подобное патогенное перепрофилирование нейрохимических сетей головного мозга осуществляется также и посредством NMDA-рецепторов глутамата. В то же время было бы резонно ожидать, что подобные результаты найдут свое непосредственное и довольно однозначное отражение в клинической плоскости. Тем не менее наши результаты продемонстрировали, что, хотя связь активности экспрессии NMDA-рецепторов на протеомном и транскриптомном уровнях и течения опухолевого процесса статистически значима, влияние глутаматергического фактора на общую выживаемость не достигало уровня статистической значимости, хотя оказывало статистически значимое влияние на безрецидивную выживаемость.
Это может быть связано с наличием разных механизмов и причин, определяющих потенциальный прогноз общей и безрецидивной выживаемости пациентов. Патогенетическими факторами, в которые глутаматергическая система вносит наибольший вклад, как было показано выше, являются инвазивность и подвижность опухолевых клеток, за счет псевдоконнектомного взаимодействия посредством глутаматных рецепторов производится трассировка наиболее эффективного пути опухолевых клеток для улучшения условий существования. Роль данного механизма в обеспечении возникновения рецидивов очевидна, поскольку инвазивные свойства на ранних этапах формирования повторного очага опухолевого роста имеют большое значение [19]. В то же время общую выживаемость, наряду с инвазивнными свойствами, обеспечивают в целом большее количество различных факторов, вклад которых, по-видимому, в статистическом отношении оказывается более значимым.
Тем не менее это не умаляет патогенетической роли глутаматергической системы и NMDA-рецепторов глутамата, поскольку данный механизм продолжает функционировать и поддерживать потенциал злокачественности опухоли на протяжении всего периода эволюции патологического процесса. Перестройка в локальных, а возможно, и глобальных масштабах коннектома мозговой ткани не только формирует необходимое условие в обеспечении инвазивных потенций диффузной глиомы, но также неблагоприятно влияет на функциональное состояние собственно мозговой ткани, внося свой существенный вклад в снижение функциональных возможностей высшей нервной деятельности. Поэтому весьма актуальной задачей является дальнейшее разностороннее изучение проблемы взаимодействия нейромедиаторных систем головного мозга и глиомных клеток как в аспекте особенностей патогенной перестройки нейросетей, так и в плоскости дифференциации взаимодействия механизмов воздействия на данный процесс различных опухолевых клеточных популяций с отслеживанием их потенциальных патогенетических последствий. Решение данных задач позволит сформировать более полное и комплексное представление о взаимодействии опухоли и мозговой ткани в целом, и месте в этом процессе глутаматергической системы в частности, что создаст прочную основу для создания новых и кардинального улучшения существующих диагностических и лечебных подходов.
Финансирование: Научно-исследовательский центр мирового уровня «Цифровой биодизайн и персонализированное здравоохранение», Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, Москва, Россия.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственной поддержки создания и развития НИЦ мирового уровня «Цифровой биодизайн и персонализированное здравоохранение» №075-15-2020-926.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.