Боковой амиотрофический склероз (БАС) — это неуклонно прогрессирующее, фатальное нейродегенеративное заболевание, приводящее к тяжелой инвалидности с высоким уровнем летальности. Для БАС характерна вариабельность клинических проявлений и темпов прогрессирования [1]. Средняя ожидаемая продолжительность жизни с момента постановки диагноза составляет 3 года [2].

Фенотипическое разнообразие делает БАС трудным для диагностики заболеванием [3]. Его поздняя диагностика является серьезной проблемой, препятствующей эффективному поиску возможных методов лечения [4]. В среднем задержка между проявлением заболевания и постановкой диагноза составляет от 13 до 18 мес [5]. Изучение и внедрение специфичных биомаркеров может помочь в решении данной проблемы. Легкие и фосфорилированные тяжелые цепи нейрофиламента, рецептор нейротрофина p75 (p75NTR) и ряд микро-РНК являются наиболее изученными биомаркерами БАС на сегодняшний день [6].

Ряд исследований позволяет предположить, что ацетилхолинэстераза (АХЭ) может рассматриваться в качестве потенциального биомаркера БАС. АХЭ — это гидролитический фермент, катализирующий разрушение ацетилхолина в синаптической щели, что необходимо для прекращения синаптической передачи и мышечного сокращения. Помимо нервно-мышечного синапса (НМС), АХЭ также обнаруживается в плазме крови. Более ¹/₂ АХЭ плазмы крови происходит из холинергических периферических структур, к которым относятся НМС и вегетативные ганглии [7].

Основным источником АХЭ в НМС является скелетная мышца, а экспрессия АХЭ в мышце строго зависит от паттерна ее иннервации [8]. На животных моделях было показано, что денервация приводит к изменению экспрессии АХЭ в скелетной мышце, в НМС, а также к увеличению высвобождения АХЭ из синаптической щели [9]. В свою очередь БАС характеризуется развитием хронического денервационного процесса вследствие прогрессирующей гибели мотонейронов спинного мозга [10]. На животных моделях БАС было показано, что денервация скелетных мышц развивается уже на досимптомной стадии [11]. Таким образом, имеются теоретические предпосылки считать, что при БАС вследствие денервации могут изменяться содержание и активность АХЭ в плазме крови. Ранее уже проводились исследования, где было показано статистически значимое повышение активности АХЭ в плазме крови у пациентов с БАС в сравнении с контрольными группами [12—14]. Однако эти работы были выполнены до разработки и внедрения современных диагностических критериев БАС.

АХЭ также обнаруживается в слюне, и ее активность может быть измерена. Активность АХЭ слюны была измерена в исследованиях на пациентах с болезнью Альцгеймера (БА) и Паркинсона (БП) [15, 16]. Таким образом, было решено провести комплексное исследование активности АХЭ в плазме крови и слюне у пациентов с БАС и активности АХЭ плазмы у трансгенных FUS-мышей с моделью БАС на досимптомной и симптомной стадиях.

Материал и методы

В исследование включен 41 пациент, которые были распределены в 3 группы: 17 — с диагностированным БАС (группа БАС, 6 мужчин и 11 женщин, средний возраст 62,3±2,2 года), 9 — с заболеваниями, имитирующими БАС (неврологический контроль: 6 мужчин, 3 женщины, средний возраст 58,1±2,9 года), 15 здоровых лиц (здоровый контроль: 8 мужчин, 7 женщин, средний возраст 57,7±2,3 года).

Общими критериями включения было наличие добровольного согласия и возраст испытуемого от 18 до 80 лет.

Критериями невключения для всех групп являлись наличие тяжелого соматического или психического расстройства, системного заболевания, заболевания полости рта (аутоиммунные, инфекционные, травматические и т.д.) и кормление через зонд. Ни один из участников не получал лечения каким-либо препаратом, влияющим на слюноотделение или АХЭ.

Критерием включения в группу БАС было наличие диагноза «клинически достоверный БАС», «клинически вероятный БАС», «клинически вероятный — лабораторно подтвержденный БАС», «клинически возможный БАС» в соответствии с пересмотренными критериями El Escorial и Awaji [17, 18]. В группе БАС тяжесть заболевания оценивалась с помощью пересмотренной шкалы нарушений функций при БАС (ALS Functional Rating Scale Revised, ALSFRS-R) [19]. Для определения стадии БАС использовались шкала Королевского колледжа Лондона (King’s clinicals staging system) [20] и Милано-Туринская шкала (MiToS) [21]. Темп прогрессирования заболевания оценивался как количество потерянных баллов ALSFRS-R в 1 мес.

В группу неврологического контроля отбирались пациенты из числа поступающих в неврологическое отделение с предварительным диагнозом «болезнь двигательного нейрона?», у которых в ходе тщательного обследования диагностировалось альтернативное заболевание. В итоге в данную группу были включены 5 пациентов со спондилогенной миелопатией, 1 — с сирингомиелией, 1 — с атипичной хронической воспалительной димиелинизирующей полинейропатией, 1 — со спиноцеребеллярной дегенерацией с сенсорно-моторной полинейропатией, 1 — с дистрофической миотонией 1-го типа.

Забор венозной крови у пациентов проводился путем пункции локтевой вены в пробирку с гепарином. Слюна собиралась в стерильную пластиковую пробирку без содержания каких-либо веществ методом «сплевывания» (пациент совершал несколько глотательных движений, после чего собирал слюну в полости рта не более 1 мин и сплевывал в пробирку). Перед сбором слюны пациент дважды полоскал рот чистой водой. Образцы крови и слюны собирались утром натощак между 8 и 11 ч. С вечера предыдущего дня исключались курение, прием любых напитков, за исключением воды.

Кровь и слюну пациентов центрифугировали при температуре 4 °C при 8000 об/мин 8 мин. Полученные образцы плазмы крови и слюны замораживали при –80 °C. Активность АХЭ в плазме крови определяли с помощью колориметрического метода Эллмана [22], в слюне — с помощью модифицированного метода Эллмана [23]. Суть метода заключается в том, что тиохолин, восстановленный из ацетилтиохолина АХЭ, с DTNB (5,5’-дитиобис-(2-нитробензойная кислота) образует соединения, придающие реакционной смеси характерный желтый цвет. Активность АХЭ определяется измерением оптической плотности раствора при длине волны 412 нм, пропорциональной гидролизованному ацетилтиохолину. Активность АХЭ была определена как количество мкмоль ацетилтиохолина, гидролизованного АХЭ в течение 1 мин, в 1 мл образца, нормированная на концентрацию белка — U/мг белка.

В качестве экспериментальной модели БАС в данном исследовании использовались трансгенные мыши генотипа ΔFUS(1-359) с эктопической нейроспецифической экспрессией укороченного человеческого гена FUS на генетическом фоне CD1 [24]. Первые симптомы в виде парезов у этих мышей развиваются в возрасте от 2,5 до 4,5 мес, а в течение 2 нед развивается тетраплегия. Трансгенные мыши были приобретены в Институте физиологически активных веществ Российской академии наук (Московская область, Черноголовка, Россия). В исследовании было использовано 24 трансгенных FUS-мыши, разделенные на две группы: 1-я — трансгенные FUS-мыши на досимптомной стадии заболевания без каких-либо клинических проявлений БАС в возрасте от 7,28 до 8,71 нед (средний возраст 8,57±0,13 нед, n=15); 2-я — трансгенные FUS-мыши на симптомной стадии заболевания с плегией обеих задних конечностей в возрасте от 14,71 до 19,57 нед (средний возраст 16,1±0,61 нед, n=9). Исследуемые группы сравнивались с группами контроля — мышами дикого типа генотипа CD1 в возрасте от 7,42 до 9,85 нед (средний возраст 8,89±0,28 нед, n=15) и от 17,14 до 19,71 нед (средний возраст 18,6±0,4 нед, n=10).

У анестезированных мышей после стернотомии проводили пункцию левого желудочка и собирали 1,5—2,0 мл крови в стерильный эппендорф. После центрифугирования отделяли плазму, которую хранили при температуре –80 °C до проведения анализа.

Исследование было одобрено локальным Этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета (протокол №3 от 23 марта 2021 г.). Все участники дали информированное согласие. Эксперименты проводились в строгом соответствии с общепринятыми этическими нормами.

Статистический анализ был проведен с использованием статистического пакета OriginPro-8. Достоверность различий между группами оценивалась с использованием U-критерия Манна—Уитни и H-критерия Краскела—Уоллиса. Корреляционный анализ проводился с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Большинство (70,6%) пациентов имели классический вариант БАС. Преимущественное поражение верхнего мотонейрона/первичный боковой склероз выявлено у 2 (11,8%) больных, преимущественное поражение нижнего мотонейрона/прогрессирующая мышечная атрофия — у 3 (17,6%). Клинически достоверный БАС был диагностирован у 7 (41,19%) больных, клинически вероятный — у 5 (29,4%), клинически вероятный — лабораторно подтвержденный — у 2 (11,76%), клинически возможный — у 3 (17,65%). У ¹/₃ (n=6, 35,3%) пациентов первые симптомы начались с бульбарного уровня. Спинальное начало БАС (шейно-грудная и пояснично-крестцовая формы) отмечено у 11 (64,7%) больных. Возраст пациентов составил от 31 до 71 года (медиана 65 лет [61; 66]), мужчин было 6 (35,3%). Длительность заболевания на момент включения в исследование и забор материала составляла от 3 до 60 мес (медиана 10 мес [6; 18]). Тяжесть заболевания по шкале ALSFRS-R варьировала от 27 до 46 баллов (медиана 40 баллов [34; 43]). Скорость прогрессирования БАС у пациентов составляла от 0,067 до 1,91 балла в 1 мес (медиана 0,83 [0,45; 1,22]). Стадии БАС по King’s были представлены следующим образом: 1 — 4 больных (23,5%), 2B — 6 (35,3%), 3 — 7 (41,2%).

В ходе исследования получены значения активности АХЭ плазмы крови и слюны в каждой группе испытуемых (табл. 1). Медиана активности АХЭ плазмы крови у пациентов с БАС составила 0,589 U/мг белка плазмы крови и значимо не отличалась от значений активности АХЭ плазмы крови в группе здорового контроля (p=0,514). В сравнении со значениями группы неврологического контроля достоверной разницы также выявлено не было (p=0,63) (рис. 1). Различия в активности АХЭ плазмы крови между контрольными группами оказались статистически незначимыми (p=0,905).

Таблица 1. Активность АХЭ в плазме крови и слюне в обследованных группах

Рис. 1. Активность АХЭ плазмы крови.

U — количество мкмоль ацетилтиохолина, гидролизованного в течение 1 мин в 1 мл образца плазмы.

При измерении активности АХЭ слюны было выявлено достоверное ее повышение у пациентов группы БАС в сравнении со здоровым контролем (p=0,0305). В то же время значения активности АХЭ слюны пациентов с БАС достоверно не отличались от значений неврологического контроля (p=0,5047) (рис. 2). Между контрольными группами достоверных различий также выявлено не было (p=0,16).

Рис. 2. Активность АХЭ слюны.

* — p<0,05.

Далее было решено разделить группу БАС на две подгруппы на основании формы заболевания (бульбарная или спинальная). В группу с бульбарной формой БАС вошли 6 человек, в группу со спинальной формой БАС — 9 (1 пациент с БАС с преимущественным поражением верхнего мотонейрона и 1 — с первичным боковым склерозом не вошли в эти группы, так как у них отсутствовали клинические данные поражения нижних мотонейронов на бульбарном или спинальном уровне). Медиана активности АХЭ слюны у пациентов с бульбарной формой БАС составила 0,073 U/мг белка слюны и оказалась статистически значимо выше, чем у пациентов со спинальной формой БАС (p=0,022), а также выше, чем у здорового контроля (p=0,035) (табл. 2). У пациентов с бульбарной формой БАС активность АХЭ слюны также оказалась выше, чем у неврологического контроля, однако различия не достигли статистической значимости (p=0,175).

Таблица 2. Данные активности АХЭ плазмы крови и слюны в зависимости от формы БАС

Примечание. * — H-критерий Краскела—Уоллиса.

Далее была выполнена оценка корреляции между значениями активности АХЭ плазмы крови и слюны и другими клиническими параметрами в группе БАС: возраст, длительность болезни, темпы прогрессирования, тяжесть неврологического дефицита по шкале ALSFRS-R, стадия болезни по King’s и MiToS (табл. 3). Для это применялся коэффициент ранговой корреляции r Спирмена, так как значения не подчинялись нормальному распределению. Между большинством показателей не было выявлено корреляционной связи. Умеренная сила корреляции выявлена между активностью АХЭ плазмы крови и тяжестью неврологического дефицита БАС по шкале ALSFRS-R, темпами прогрессирования, стадией БАС по шкале MiToS, однако корреляция оказалась незначимой (p>0,05).

Таблица 3. Корреляция активности АХЭ с клиническими параметрами пациентов с БАС

В ходе исследования на трансгенных мышах, у FUS-мышей с моделью БАС на досимптомной стадии активность АХЭ плазмы крови составила 0,726+0,057 U/мг белка, у мышей дикого типа соответствующего возраста — 0,886+0,154 U/мг белка. У FUS-мышей на симптомной стадии активность АХЭ плазмы крови составила 0,889+0,065 U/мг белка, у мышей дикого типа соответствующего возраста — 0,706+0,069 U/мг белка. Значимых различий между исследуемыми группами мышей выявлено не было (рис. 3).

Рис. 3. Активность АХЭ плазмы крови трансгенных FUS-мышей и их контроля.

FUS Presymp — трансгенные мыши FUS на досимптомной стадии. FUS Symp — трансгенные мыши FUS на симптомной стадии. CD1 p40—60 — мыши дикого типа, контрольная группа для FUS Presymp. CD1 — p100—150 — мыши дикого типа, контрольная группа для FUS Symp.

Обсуждение

В исследованиях, проведенных еще в конце XX века, было выявлено значительное изменение активности АХЭ плазмы при БАС. Так, B. Festoff и H. Fernandez [12] показали достоверное повышение активности АХЭ плазмы крови у пациентов с БАС в сравнении со здоровым контролем. Позже еще в двух работах также было показано статистически значимое повышение АХЭ плазмы крови у пациентов с БАС в сравнении со здоровым и неврологическим контролем [14, 15]. Противоположные изменения были выявлены в биоптатах скелетных мышц. Так, значительное снижение содержания АХЭ в скелетной мышце было показано у пациентов с БАС [25]. Было предположено, что прогрессирующая денервация и усиленное высвобождение АХЭ из НМС являются причиной выявленных изменений АХЭ в плазме и мышцах. Это было подтверждено в двух исследованиях, проведенных на животных денервационных моделях [10].

Однако в нашем исследовании не наблюдалось какого-либо повышения активности АХЭ плазмы у пациентов с БАС в сравнении с контрольными группами. Нами также не выявлено достоверной корреляции между значениями активности АХЭ и клиническими параметрами болезни. В нашей работе отбор пациентов с БАС осуществлялся с использованием современных диагностических критериев (пересмотренные критерии El-Escorial revisited и Awaji) в отличие от предыдущих исследований. Также при статистическом анализе для оценки достоверности различий был использован U-критерий Манна—Уитни, в то время как в предыдущих — t-критерий Стьюдента. Данные отличия в методологии работы могут быть причиной имеющихся различий в полученных результатах.

При анализе литературы нами не найдено данных по активности АХЭ в различных моделях БАС, чтобы можно было сравнить полученные данные. На основании наших результатов можно сделать вывод, что развитие и прогрессирование заболевания в FUS-модели БАС не приводят к заметным изменениям в активности АХЭ плазмы крови.

В данной работе впервые было проведено исследование активности АХЭ слюны при БАС. Было обнаружено, что она значительно повышается в группе БАС в сравнении со здоровым контролем. Как и в случае АХЭ плазмы крови, достоверной корреляции с параметрами заболевания обнаружено не было. В ходе дальнейшего анализа группа БАС была разделена на подгруппы БАС с бульбарным и спинальным началом. Здесь нами было выявлено повышение активности АХЭ слюны у пациентов с бульбарным началом БАС при сравнении с пациентами со спинальным началом БАС и лицами из здорового контроля.

Причиной выявленных нами изменений активности АХЭ слюны может быть вовлечение в патологический процесс слюнных желез и/или иннервирующих их структур у пациентов с бульбарной формой БАС. Однако в литературе данных о патоморфологических изменениях слюнных желез или вегетативных ядер ствола мозга при БАС обнаружено не было. В свою очередь подобные изменения были выявлены у пациентов с БА и БП. У данных пациентов также было показано повышение активности АХЭ в слюне [16, 17]. У пациентов с БА выявляются отложения бета-амилоида и агрегатов тау-белка в биоптатах слюнных желез [26]. У пациентов с БП в свою очередь выявляются отложения альфа-синуклеина в поднижнечелюстной слюнной железе [27].

Помимо моторных проявлений, при БАС отмечается развитие вегетативной дисфункции в виде нарушения регуляции сердечно-сосудистой системы и желудочно-кишечного тракта, нарушения слюноотделения и слезоотделения [28]. При сцинтиграфии слюнных желез у пациентов с БАС отмечается нарушение захвата радиоактивного вещества, не связанное со структурными изменениями желез, наличием дисфагии и гиперсаливации [29]. При исследовании спектрального анализа вариабельности сердечного ритма у пациентов с бульбарной формой БАС было выявлено более выраженное нарушение парасимпатической регуляции сердца [30]. Таким образом, выявленное нами повышение активности АХЭ слюны у пациентов с бульбарной формой БАС может быть обусловлено более грубым нарушением парасимпатической иннервации слюнных желез.

Заключение

В нашей работе не было выявлено достоверных изменений активности АХЭ плазмы крови у пациентов с БАС. При этом нами было выявлено достоверное повышение активности АХЭ слюны у пациентов с бульбарной формой БАС, что делает данное исследование более чувствительным методом и может быть использовано в диагностических и прогностических целях.

Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 23-15-00438.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.