Психические расстройства относятся к одним из наиболее распространенных социально значимых заболеваний, оказывающих значительное влияние на систему здравоохранения во всем мире, приводя к серьезным последствиям для человека, общества и экономики. Согласно имеющимся данным, на долю психических расстройств приходится до 20% заболеваний лишь в Европейском регионе, и каждый 4-й житель Европы на том или ином этапе жизни сталкивается с проблемами психического здоровья [1]. Молекулярно-генетические исследования, предпринимавшиеся с целью выяснения этиопатогенеза психических расстройств, позволили идентифицировать изменения нуклеотидной последовательности генома, включающие как точечные модификации, так и вариации числа копийности его участков, а также эпигенетические изменения [2]. Тем не менее точные молекулярные механизмы, лежащие в основе развития многофакторных психических расстройств, остаются не до конца изученными.

Как известно, детальное изучение геномов различных организмов открывает широчайшие возможности для применения полученных знаний в биотехнологии и медицине. Разработка новых методов, позволяющих манипулировать ДНК в геномах, управлять экспрессией генов и работой регуляторных элементов, становится как никогда актуальной, поскольку данных лишь о нуклеотидных последовательностях геномов уже недостаточно для понимания функциональных взаимосвязей отдельных элементов геномов и их роли в формировании фенотипических признаков и патогенезе отдельных заболеваний [3]. По этой причине генетические инструменты для редактирования генома стали одними из самых востребованных в последние годы.

Для большинства психопатологий в настоящее время не существует лекарственных препаратов для полной редукции существующей клинической симптоматики, а всего лишь — для ее ослабления или незначительной коррекции. Кроме того, у применяемых лекарственных препаратов в области психиатрии есть существенные побочные эффекты. В связи с этим альтернативным подходом к лечению может быть использование технологии геномного редактирования, которая в настоящее время рассматривается в качестве актуального метода генной терапии при моногенной патологии [4]. С другой стороны, редактирование генома начинает широко использоваться для выявления молекулярных механизмов развития многофакторных заболеваний [5].

В настоящее время наибольшее распространение получили три метода редактирования генома: цинковопальцевые нуклеазы (Zinc-Finger Nucleases, ZFNs), TALE-ассоциированные нуклеазы (Transcription Activator-like Effector Nucleases, TALEN) и CRISPR/Cas (Clustered, Regularly Interspaced, Short Palindromic Repeats (CRISPR) — CRISPR-associated system (Cas)) [6]. Несмотря на то что они сопоставимы по ряду параметров, определяющих их эффективность, система CRISPR/Cas является наиболее распространенной в генно-инженерной практике [7].

В данном обзоре основное внимание будет сосредоточено на технологии и перспективах применения системы CRISPR/Cas (в частности, CRISPR/Cas9) как для использования в качестве генной терапии, так и для исследования молекулярно-генетических механизмов развития ряда психических расстройств.

Система геномного редактирования CRISPR/Cas

Как известно, CRISPR/Cas — это система адаптивного приобретенного иммунитета, направленная на уничтожение проникшей в клетку чужеродной плазмидной или вирусной ДНК [3, 6, 7]. Данная система состоит из CRISPR-кассет, представляющих собой кластер из коротких повторяющихся фрагментов геномной ДНК, разделенных уникальными последовательностями — спейсерами, по крайней мере, некоторые из которых происходят из чужеродной ДНК, и ассоциированных с ними генов Cas, кодирующих белковые компоненты эффекторного комплекса системы CRISPR/Cas [8].

В общем смысле механизм защиты бактериальных клеток системой CRISPR/Cas включает три основных стадии. На первой стадии, называемой «адаптация», происходит приобретение бактериальной клеткой информации об инфекции. Так, при проникновении вируса в клетку, снабженную системой CRISPR/Cas, белковые компоненты эффекторного комплекса (у всех систем это как минимум белки Cas1 и Cas2) встраивают в бактериальный геном фрагмент чужеродной ДНК, представленный в вирусном геноме в качестве протоспейсера [3, 7, 8]. Отличать протоспейсер от любой другой последовательности, в том числе от генома хозяина, позволяет фланкирующая его последовательность Protospacer Adjacent Motif (PAM) — трехбуквенный мотив, специфичный для конкретного вида бактерии, в частности у Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) это трехбуквенный мотив 5’-NGG-3’ и с гораздо меньшей эффективностью мотив 5’-NAG-3’ [3]. Встраивание протоспейсера в бактериальную CRISPR-кассету происходит всегда со стороны АТ-богатой лидерной последовательности, содержащей промоторные элементы и сайты посадки регуляторных белков, что затем приводит к формированию нового спейсера, комплементарному протоспейсеру. На второй стадии, транскрипции, вся CRISPR-кассета транскрибируется в полиспейсерный предшественник CRISPR-ассоциированной РНК (poly-spacer precursor crRNA, pre-crRNA), а затем подвергается процессингу с образованием CRISPR РНК (crRNA), происходящей из геномного локуса, хранящего фрагменты вирусных последовательностей. В ходе третьей стадии, называемой «интерференция», происходят узнавание последовательности протоспейсера за счет комплементарного взаимодействия со спейсером в составе crRNA и деградация Cas-белками [3, 8].

В настоящий момент CRISPR/Cas-системы подразделяются по происхождению и механизму действия на 6 основных типов и 33 подтипа, отнесенных к двум классам [8]. CRISPR/Cas система II типа S. pyogenes (Cas9) является наиболее изученной и широко используемой в геномной инженерии в силу ряда причин, важнейшая из которых — небольшое количество компонентов, необходимых для ее работы [3]. Так, для внесения двухцепочечного разрыва ДНК достаточно активности единственного белка Cas9 и присутствия комплекса из двух РНК — crRNA и транс-активирующей CRISPR РНК (trans-activating crRNA, tracrRNA), лицензирующей активность комплекса Cas9-РНК. При этом редактирование генома можно осуществлять с помощью crRNA и tracrRNA, транскрибируемых отдельно, однако их объединение в одну химерную молекулу гидовой РНК (single guide RNA, sgRNA) позволяет упростить систему, а также повысить эффективность всего комплекса в совокупности с подбором целевого сайта для внесения двухцепочечного разрыва ДНК [3, 6, 7, 9].

Методы доставки векторов, экспрессирующих компоненты системы CRISPR/Cas9, в культивируемые клетки человека достаточно разнообразны. Наиболее распространенными и эффективными являются такие способы, как липофекция, нуклеофекция, электропорация, доставка, опосредованная вирусами (аденоассоциированные вирусы, аденовирусы и некоторые лентивирусы, на основе которых разрабатываются методы адресной доставки in vivo), а также микроинъекции в эмбрион на ранних стадиях развития в экспериментах на модельных объектах животных [3, 7, 9].

В классическом методе геномного редактирования после узнавания и внесения двухцепочечного разрыва в целевом участке последовательности ДНК системой CRISPR/Cas9 происходит включение клеточных механизмов репарации двухцепочечных разрывов по одному из двух возможных механизмов: негомологичной и гомологичной рекомбинации. При негомологичной (Non-Homologous End Joining, NHEJ) рекомбинации (реже — микрогомологичном соединении концов, Microhomology-Mediated End Joining, MMEJ) может происходить потеря и/или вставка нуклеотидов (индел-мутации), а также нуклеотидные замены, так как лигирование двухцепочечных разрывов требует обработки свободных концов ДНК экзонуклеазами и заполнения одноцепочечных участков полимеразой [3, 7]. В случае гомологичной рекомбинации неповрежденный гомолог (в естественных условиях) служит матрицей для восстановления исходной структуры ДНК. Данный вариант происходит в клетке достаточно редко, но использование CRISPR/Cas9 позволяет повысить вероятность гомологичной рекомбинации. Если добавить к компонентам CRISPR/Cas9 искусственно синтезированную молекулу ДНК, имеющую гомологию с последовательностью нуклеотидов в месте разрыва, то она может служить матрицей для Homology-Directed Repair (HDR)-репарации, при которой небольшой фрагмент искусственной матрицы встраивается в целевой локус. С помощью HDR в целевой локус можно поместить сайт рестрикции, маркерную метку или же нуклеотиды для исправления таргетной последовательности ДНК. Однако HDR активно происходит только в делящихся клетках, и ее эффективность в значительной степени зависит от типа клетки, стадии клеточного цикла, а также целевого локуса генома и самой матрицы. Ввиду этих факторов репарация двухцепочечных разрывов ДНК в процессе редактирования генома в 10 раз чаще происходит по пути NHEJ, нежели HDR [3].

Таким образом, с помощью нуклеазы Cas9, а также синтеза по типу NHEJ и HRD можно осуществить генный нокаут из-за мутаций сдвига рамки считывания и образования стоп-кодонов ввиду делеции или инсерции нескольких нуклеотидов; встраивание фрагментов ДНК в таргетную последовательность; делеции, инсерции и транслокации участков ДНК при одновременном внесении нескольких двухцепочечных разрывов ДНК и др. В настоящий момент данные стратегии широко применяются в фундаментальных и прикладных исследованиях, важнейшей целью которых является разработка эффективных методов генной терапии. В этом ключе система CRISPR/Cas9 может использоваться как для создания клеточных моделей наследственных заболеваний человека, так и для коррекции мутаций, являющихся причинами развития наследственных заболеваний [5]. Однако существуют патологии, к генетическим факторам риска развития которых относятся мутации в более чем сотне генов, что создает определенные затруднения для геномного редактирования [9]. Здесь справедливо упомянуть психические расстройства, большинство из которых имеет сложную мультифакторную, полигенную природу. Очевидно, что ни одно из клинических испытаний, которые планируется начать как в России, так и за рубежом, в настоящий момент первостепенно не связано с применением технологии CRISPR/Cas9 в качестве терапевтического инструмента в отношении психических расстройств. Современное состояние науки позволяет предположить, что эту технологию в данный момент можно успешно использовать лишь для коррекции заболеваний человека, возникающих в результате мутаций одного гена, известных как моногенные заболевания. Тем не менее в ходе недавних доклинических исследований ученым удалось повысить целевую специфичность CRISPR/Cas9 и использовать системы, содержащие несколько гидовых РНК, для одновременного воздействия на несколько генов («мультиплексирование») [10]. Но ввиду сложной, в значительной степени не до конца изученной генетической архитектуры психических расстройств и, как следствие, неизвестности всех целевых участков для геномного редактирования, устранить все структурные аномалии, служащие причиной психопатологий, пока не представляется возможным. Несмотря на это, система CRISPR/Cas9 может быть использована для выявления уникальных молекулярных механизмов, лежащих в основе развития психических расстройств, и может сыграть важную роль в разработке методов лечения ряда психических заболеваний.

Применение CRISPR/Cas9 в психиатрии: обзор актуальных исследований

Важнейшей проблемой при изучении различных наследственных заболеваний, в том числе психопатологий, является недостаток релевантных модельных систем, которые охватывали бы весь спектр наблюдаемой клинической симптоматики на молекулярном и клеточном уровнях. Одним из потенциальных решений данной проблемы является получение клеточных моделей заболеваний. Мутации, которые являются причиной развития наследственной патологии, могут быть внесены в геном плюрипотентных клеток с помощью технологии CRISPR/Cas9. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) человека практически неограниченное время сохраняют свои свойства в культуре и дают в результате дифференцировки необходимые клеточные производные, представляющие собой универсальную модельную систему для выявления и анализа механизмов патогенеза заболеваний, а также для скрининга лекарственных препаратов [9].

Расстройства аутистического спектра (F84.1, F84.2)

Расстройства аутистического спектра (РАС) — группа расстройств, характеризующихся качественными отклонениями в социальных взаимодействиях и показателях коммуникабельности, а также ограниченным, стереотипным, повторяющимся комплексом интересов и действий. В качестве одного из генов-кандидатов РАС рассматривается ген CHD8, который кодирует АТФ-зависимый фактор ремоделирования хроматина. Ранее было показано, что нокдаун гена CHD8 приводит к изменению транскрипционного профиля генов, вовлеченных в развитие РАС, а также к потенциальным нарушениям генных сетей, участвующих в развитии нервной системы [11]. Основываясь на этих данных, P. Wang и соавт. [12] применили технологию CRISPR/Cas9 для нокаута одной из двух копий гена CHD8 в ИПСК. В результате исследования транскрипционных профилей нейральных производных ИПСК с отредактированным геномом было показано нарушение экспрессии ряда генов, в том числе ответственных за формирование внеклеточного матрикса, нейрональную дифференцировку и развитие мышечной системы. Также было установлено, что CHD8 участвует в регуляции экспрессии не только генов, ассоциированных с развитием РАС, но и генов, ассоциированных с шизофренией и другими нейропсихическими расстройствами [9, 12].

В качестве другой причины развития РАС многие исследователи рассматривают вариации числа копий de novo (Copy Number Variations, CNVs). Эти CNVs, в частности делеции, были неоднократно обнаружены у индивидов с РАС и приводили к изменению экспрессии генов, вовлеченных в развитие нервной системы. Один из наиболее часто встречающихся CNV при РАС находится в хромосомном регионе 16p11.2, дупликации и делеции которого могут быть идентифицированы в 0,8% случаев РАС [13]. При этом делеции региона в 9 раз повышают риск развития РАС, а дупликации — как РАС, так и шизофрении [13, 14]. Известно, что регион 16p11.2 охватывает 29 генов, которые демонстрируют дозозависимую экспрессию в линиях лимфобластов носителей CNV, что приводит к дифференциальной экспрессии генов, участвующих в синаптической передаче и модификации хроматина. Особое значение среди этих генов отводится гену хинолинат фосфорибозилтрансферазы (QPRT). Ген QPRT кодирует фермент кинуренинового пути — основного пути катаболизма триптофана, который приводит к продукции никотинамидадениндинуклеотида (НАД⁺). Кроме того, это единственный фермент, катаболизирующий хинолиновую кислоту — мощный эксайтотоксин, связанный с активацией астроглии и гибелью нервных клеток, действующий как агонист рецептора N-метил-D-аспартата [13]. Значительное повышение уровня хинолиновой кислоты наблюдается в плазме крови детей с РАС по сравнению с контрольной группой [15]. Основываясь на этих данных, D. Haslinger и соавт. [13] использовали технологию CRISPR/Cas9 для нокаута гена QPRT в клеточных линиях нейробластомы SH-SY5Y. Было установлено, что снижение активности гена или его полное ингибирование оказывает влияние на процессы дифференцировки нейронов, формирования синапсов и развития мозга в целом, а также на активность генов GABRB3, SNTG2 и CNTNAP2, вовлеченных в процессы когнитивного функционирования. Помимо общеизвестных генов-кандидатов РАС, в исследовании было отмечено влияние нокаута гена QPRT на регуляцию генных сетей, которые ранее не изучались в контексте РАС (гены COX17, GUCA1A, COX17P1, VSTM2A, LINC01760 и ARHGAP20) [13].

Еще одним геном, располагающимся на коротком плече 16 хромосомы в регионе p11.2 является ген, содержащий домен тетрамеризации калиевого канала 13 (KCTD13). Ген KCTD13 является одним из пяти генов, которые были идентифицированы у пациентов с РАС, несущих делеции, содержащие критически важные экзоны для развития головного мозга [16, 17]. В исследовании V. Kizner и соавт. [18] с помощью никазы Cas9 был нокаутирован ген KCTD13 в ИПСК с целью идентификации возможных структурных и функциональных изменений во время дифференцировки нейронов коры больших полушарий головного мозга человека. В результате исследования транскрипционных профилей производных ИПСК с отредактированным геномом было обнаружено снижение экспрессии (до 18%) ряда генов, участвующих в регуляции клеточного цикла и репликации ДНК, а также отмечено увеличение уровня мРНК генов NDUFS2 и NDUFS4, кодирующих субъединицы фермента НАДН-дегидрогеназы (убихинона) в глутаматергических нейронах. Это укладывается в современные представления о том, что митохондриальная дисфункция является частым спутником различных нервно-психических расстройств, включая шизофрению [19].

Справедливо упомянуть, что геномное редактирование также активно используется и при создании животных моделей заболеваний, которые могут позволить провести фармакологические испытания и изучить нейронные механизмы психических расстройств. В этом ключе широко используемыми моделями РАС и умственной отсталости являются рыбки Danio rerio и грызуны. Так, например, CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут генов, играющих важную роль в когнитивном функционировании и синаптогенезе (PGRN, SHANK3, SHANK3B), на данных моделях приводил к укорочению аксонов в двигательных нейронах и впоследствии к нарушению двигательной активности и стереотипному поведению животных. Подобные данные могут иметь прогностическую ценность благодаря проводимым поведенческим тестам и определенному параллелизму симптомов у животных и человека [20].

Шизофрения (F20)

Шизофрения обычно характеризуется существенными искажениями мышления и восприятия, а также неадекватным аффектом. В большинстве случаев шизофрения проявляется в результате взаимодействия как генетических, так и психологических факторов, а также определенных условий внешней среды. Однако генетические факторы, безусловно, играют определяющую роль в предрасположенности к шизофрении. Как и РАС, шизофрения является полигенным заболеванием. В обзоре J. Gatt и соавт. [2], основанном на обобщении результатов проведенных метаанализов, было показано, что из 97 изученных полиморфных вариантов генов наиболее выраженная ассоциация с шизофренией подтверждена для генов нейронального развития, дофаминергической, глутаматергической, серотонинергической и иммунной систем. Предполагается, что технология CRISPR/Cas9 позволит расширить данный список генов-кандидатов. Так, например, уже в исследовании N. Schrode и соавт. [21] путем интеграции технологий геномного редактирования CRISPR/Cas9, репрессии (CRISPRi с использованием ферментативно неактивного белка dCas9) и активации (CRISPRa с использованием белка-активатора транскрипции, «пришитого» к dCas9) [22] был проведен анализ экспрессии ряда генов в ИПСК человека. Установлено, что редактирование всего лишь одного SNP rs4702, расположенного в 3’-некодирующей области гена FURIN, приводит к значительным транскриптомным и клеточным изменениям. Аллельная конверсия rs4702*AA→*GG способствовала снижению уровней мРНК гена FURIN в 7-дневных NGN2-возбуждающих нейронах, уменьшению длины нейритов и снижению скорости синаптической передачи [21].

Как и в случае с РАС, многие исследования генетических причин, лежащих в основе шизофрении, указывают на важность изучения ряда CNV, оказывающих специфическое влияние на гены, вовлеченные в развитие нервной системы. В основном внимание исследователей было сосредоточено на CNV, расположенных в хромосомных регионах 1q21.1, 2p16.3, 3q29, 7q11.23, 15q11.2, 15q11.2—13.1, 15q13.3, 16p11.2, 16p13.1 и 22q11.2 [23], некоторые из которых уже упоминались нами ранее в контексте РАС [13, 14, 17]. С помощью технологии CRISPR/Cas9 D. Tai и соавт. [23] смогли успешно создать реципрокные CNV в регионах 16p11.2 (делеция 740 kb) и 15q13.3 (делеция 2 Mb) в ИПСК, что открыло возможные пути для введения или коррекции редких и крупных патогенных CNV как в клеточных линиях, так и на модельных объектах для изучения заболеваний.

Депрессивные расстройства (F32, F33)

Депрессия — это одно из наиболее распространенных многофакторных психических расстройств, которое характеризуется патологически сниженным настроением, торможением интеллектуальной и моторной деятельности, а также снижением витальных побуждений. Несмотря на многочисленные исследования по изучению этиологии депрессивных расстройств [24], использование метода CRISPR/Cas9 позволяет предложить конкретные молекулярные механизмы, предполагающие участие определенных генетических локусов в развитии данного заболевания. В частности, в одном из таких исследований с помощью технологии CRISPR/Cas9 была подтверждена функциональная значимость таких SNP, как rs3101339 и rs2050033, приводящих к высокой транскрипционной активности в нейрональных клетках. С использованием пары гидовых РНК была осуществлена делеция участка в размере 586 п.н., содержащего SNP rs3101339, с последующим анализом экспрессии гена. По сравнению с контролем, в отредактированных клетках наблюдалось снижение экспрессии гена NEGR1, что указывает на то, что экспрессия гена регулировалась геномной последовательностью, содержащей SNP rs3101339 [25]. В дополнение к rs3101339 авторами также был исследован регуляторный эффект SNP rs2050033 гена MEI1, кодирующего белок, ответственный за формирование двухцепочечных разрывов ДНК во время мейотического деления, аллельные различия в котором потенциально нарушали связывание с транскрипционным фактором CTCF. Аналогичная делеция последовательности, содержащей SNP rs2050033, при помощи технологии CRISPR/Cas9 также позволила обнаружить изменения в экспрессии генов CSDC2, POLR3H, MEI1 и NPH2L1 в отредактированных клетках по сравнению с контролем, свидетельствуя о регуляции этих генов геномной областью, содержащей SNP rs2050033.

Интересным представляется эксперимент по интраназальной доставке конструкции, содержащей белок Cas9 и гидовую РНК, с помощью аденоассоциированного вируса для нокаута гена рецептора серотонина (HTR2A) у мышей, участвующего в развитии тревожных и депрессивных расстройств [26]. Результаты этого исследования демонстрируют, что даже низкий процент отредактированных клеток уже способствует значительному снижению тревожных проявлений, а неинвазивная доставка в обход гематоэнцефалического барьера обеспечивает основу для разработки инновационных терапевтических стратегий для широкого спектра неврологических расстройств и когнитивных дисфункций.

Биполярное аффективное расстройство (F31)

Биполярное расстройство (БР) — это психическое заболевание, характеризующееся чередованием эпизодов гипомании и депрессии, в терапии которого используются препараты лития [27]. Данная терапевтическая стратегия эффективно предотвращает рецидивы БР у 40—60% пациентов, что указывает на высокую степень вариабельности клинического ответа. Механизм, лежащий в основе терапевтического действия лития, в настоящее время не до конца ясен, но имеющаяся гипотеза свидетельствует о том, что литий усиливает нейрогенез у взрослых индивидов путем стимуляции пролиферации нервных клеток-предшественников подобно некоторым антидепрессантам [28]. В одном из последних исследований [27] для выявления генетических маркеров, определяющих эффективность пролиферации клеток с помощью лития, был проведен анализ нервных клеток-предшественников человека, полученных из тканей головного мозга плодов после добровольного прерывания беременности на 14—21-й неделях, с последующей обработкой литием и полногеномным анализом ассоциаций. Наибольший эффект был показан для локуса в регионе 3p21.1, который уже обсуждался исследователями в контексте БР, шизофрении и интеллектуальных способностей, а также локализованного в нем гена GNL3, экспрессия которого менялась в ответ на обработку литием. Кроме того, экспериментальная регуляция экспрессии гена GNL3 с помощью CRISPRi/a продемонстрировала, что повышение экспрессии гена приводило к усилению пролиферации, тогда как снижение экспрессии подавляло индуцированную литием пролиферацию. Таким образом, в будущем для индивидов со сниженной экспрессией гена GNL3 и, следовательно, с более низкой эффективностью терапии литием можно будет предложить альтернативную стратегию лечения с минимальным количеством побочных эффектов.

Проблемы использования системы CRISPR/Cas9

Несмотря на то что технология CRISPR/Cas9 демонстрирует хорошие перспективы в разработке моделей заболеваний и лечении моногенных, в том числе, неврологических расстройств, нецелевые эффекты вследствие ошибочного спаривания гидовой РНК с ДНК-мишенью по-прежнему представляют собой серьезную проблему, которая может привести к нарушению нормальной функции генов или вызвать геномную нестабильность [20, 29]. Одним из способов снижения процента нецелевых эффектов может послужить модифицирование Cas9 нуклеаз фактически в никазы с помощью внесения мутаций в один из каталитически активных доменов Cas9 (RuvC или HNH). В таком варианте Cas9 может вносить только одноцепочечный разрыв ДНК, а для двухцепочечного разрыва понадобится сразу пара Cas9 никаз, что сведет вероятность неспецифических эффектов к минимуму [3, 30]. Также снизить процент нецелевых эффектов потенциально могут изменение длины гидовой РНК, использование гидовой РНК с укороченным спейсером и др. [3, 29].

Проведение высокоточного геномного редактирования также затрудняет тот факт, что репарация двухцепочечных разрывов ДНК значительно чаще происходит по пути NHEJ, нежели HDR, а это, как правило, сопровождается нуклеотидными заменами, инсерциями или делециями, что приводит фактически к нокауту гена, а не к направленному изменению последовательности мутантного гена. Для последнего необходима репарация двухцепочечных разрывов по пути HDR, но поскольку это происходит редко, актуальной представляется разработка новых подходов к исправлению точечных мутаций без HDR. Одним из таких методов является Prime Editing, использующий вирусную обратную транскриптазу, синтезирующую «правильную» последовательность ДНК, но и его использование сопряжено с трудностями доставки и размером генетических кассет [31].

Другой проблемой могут являться тканеспецифичная реакция и иммунный ответ на введение терапевтической конструкции, основанной на CRISPR/Cas9. В этом плане большое значение имеет способ введения и доставки данной конструкции, возможность преодоления гематоэнцефалического барьера. Кроме того, клеточные линии и модельные объекты животных, хотя и являются актуальными инструментами при проведении исследований по геномному редактированию, но лишь в определенной степени могут объяснять те или иные особенности поведения у человека, а полученные результаты следует экстраполировать с большой осторожностью [20].

Помимо методологических и практических проблем геномного редактирования на основе CRISPR/Cas9, существует ряд этических и моральных вопросов в потенциальной клинической практике [10, 20]. Наиболее общими среди таковых являются: риск передачи возникших нецелевых эффектов потомству и соблюдение границы между повышением благополучия человека с помощью геномного редактирования и возрождением евгенического движения [10]. Текущие исследования демонстрируют серьезную обеспокоенность общественности по поводу генетической конфиденциальности и безопасности, учитывая исторические случаи нарушения прав индивидов с психическими расстройствами [32].

Заключение

В настоящий момент в психиатрии существует большая потребность в новых методах лечения, и технология CRISPR/Cas9 является привлекательным инструментом в качестве как терапевтического, так и исследовательского инструмента в будущем. Результаты доклинических исследований с применением систем CRISPR/Cas9 позволяют предположить, что эта технология может быть успешно использована для лечения моногенных заболеваний человека уже в ближайшие годы. При этом лечение полигенных заболеваний, к которым относятся психические заболевания, на данный момент не представляется возможным с помощью систем CRISPR/Cas9, учитывая высокую степень их полиморфизма, структурную и физиологическую сложность строения головного мозга, его относительную недоступность для прямого изучения и минимальную регенеративную способность, а также нерешенные этические и юридические вопросы. Тем не менее использование метода CRISPR/Cas9 при моделировании психопатологий различного характера представляется перспективным методом для выявления их генетических основ, предоставляя более эффективные средства генной инженерии для лучшего понимания функционального значения генетических локусов, вовлеченных в этиопатогенез психических расстройств.

Исследование выполнено при финансовой поддержке мегагранта Правительства Республики Башкортостан (соглашение №1 от 2.12.2022) и мегагранта Правительства Российской Федерации (проект №075-15-2021-595).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict interest