Сердечно-сосудистые заболевания являются наиболее частой причиной преждевременной смерти в промышленно развитых странах, что составляет ежегодно 4,35 млн смертельных исходов в Европе [2]. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в клинической диагностике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний и метаболического синдрома (МС), именно атеросклероз (АТ) остается ведущим в заболеваемости и смертности не только в Молдове, но и во всем мире. В последние годы приобрела широкое признание концепция о ведущей роли воспаления в атерогенезе, что заставило нас переосмыслить представления об этапах формирования атеросклеротических бляшек. У пациентов с метаболическими расстройствами приток мастоцитов (тучных клеток) и моноцитов в стенку артерий на ранних стадиях АТ приводит к наиболее выраженным проявлениям сосудистого воспаления [1].

Данная статья является итогом многолетних исследований в области атерогенеза на кафедре патологической анатомии Государственного университета медицины и фармации им. Николае Тестемицану (Кишинев, Молдова) совместно с Научным центром по изучению ангиогенеза Университета медицины и фармации им. Виктора Бабеша (Тимишоара, Румыния), результаты которых были представлены на многих национальных, международных симпозиумах и конгрессах.

АТ представляет собой полиэтиологическое заболевание с многочисленными факторами риска, включая курение, злоупотребление алкоголем, гипертонию, сахарный диабет, дислипидемии, инфекции. Все эти факторы потенцируют сложные взаимодействия различных составляющих — воспаления, липидного обмена, системы свертывания крови, гипоксии, апоптоза, иммунного ответа. Нестабильность атеросклеротической бляшки является относительно независимым фактором риска развития ишемического инсульта [3—7].

В норме в стенках сосудов имеется микроциркуляторное русло, ограниченное адвентициальной оболочкой [8]. К. Кестер в 1876 г. впервые обратил внимание на связь неоваскуляризации и атеросклероза [цит. по 9]. В атеросклеротических бляшках ангиогенез способствует формированию новых микрососудов, их рост происходит в участках бляшки, склонных к разрыву и подвергающихся постоянным изменениям, реконструкциям [7]. Образование новых сосудов способствует росту атеросклеротических поражений и является ключевым фактором, приводящим к разрыву и дестабилизации бляшки [10, 11]. Некоторые из новообразованных сосудов являются незрелыми, похожими на те, что наблюдаются при неоваскуляризации солидных опухолей и, следовательно, могут способствовать развитию кровоизлияния в бляшку и ее нестабильности [6, 8, 12].

CD105 является компонентом трансформирующего фактора роста рецепторного комплекса TGF-β и проявляется в ангиогенных эндотелиальных клетках [13—17]. CD105 является гораздо более специфичным и чувствительным маркером для оценки новообразованных сосудов в атеросклеротических бляшках, чем CD31 или TGF-β1 [18, 19]. Определение уровня циркулирующих растворимых CD105-чувствительных антигенов позволяет точно определить присутствие нестабильных бляшек или их разрывы [20].

Три основных типа клеток: тучные клетки, макрофаги и Т-лимфоциты — входят в состав воспалительных клеточных инфильтратов в атеросклеротических бляшках и в межклеточном веществе, а также способствуют новообразованию сосудов [21, 22].

Иммунный ответ представлен тремя типами активированных воспалительных клеток, которые взаимодействуют одновременно [24]. Гранулы тучных клеток содержат ряд медиаторов, таких как нейтральные протеазы, триптаза, химаза, катепсин G, гистамин, гепарин, цитокины и хемокины, фактор некроза опухоли (TNF-α), интерлейкины (IL), факторы роста эндотелия сосудов (VEGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF) [23]. Инфильтрация клетками воспаления стенки сосуда, в частности интимы, играет важную роль в патогенезе АТ и, возможно, является основной причиной острых сердечно-сосудистых осложнений [24]. Активированные тучные клетки выделяют большое количество молекул хемотаксиса, активаторов воспалительных реакций. Возникает их связь с липопротеинами низкой плотности (ЛПНП), которые могут быть фагоцитированы макрофагами с последующей трансформацией в пенистые клетки — основной клеточный компонент атеросклеротических поражений [8].

Мастоциты имеют важнейшее значение в развитии атеросклеротической бляшки. Определение роли мастоцитов в атерогенезе позволяет интерпретировать клинические проявления, определять ранние диагностические перспективы, терапевтические мишени и индивидуальный прогноз у больных с МС, осложненным А.Т. Проявления различных стадий атеросклеротической бляшки в разных типах артериальных сосудов описаны неполно, и экспрессия маркеров, специфических для тучных клеток, не была полностью исследована до настоящего времени.

ИГХ-метод эффективен для определения мастоцитов в атеросклеротической бляшке и непосредственно отражает ферментативную активность мастоцитарных протеаз, раскрывая некоторые важные звенья атерогенеза у больных с М.С. Полученные данные могут служить основанием для дальнейших научных исследований с целью выявления новых методов ранней прижизненной диагностики, а также для терапевтических целей.

Цель исследования — провести анализ гистотопографического распределения новообразованных сосудов, степени дегрануляции мастоцитов, экспрессии маркеров макрофагов в различных типах бляшек на разных стадиях и в разных артериальных сосудах у пациентов с АТ, а также у пациентов с МС, осложненным АТ, и установить роль мастоцитов и макрофагов в развитии стадий АТ наряду с их диагностическим и прогностическим значением.

Изучены результаты аутопсии 34 умерших от АТ (n=17) и осложнений МС (n=17). Среди них были представители всех возрастных групп; степень поражения увеличивалась с возрастом, который варьировал от 44 до 83 лет (медиана 62,8 года). Всего было 14 (41,2%) женщин и 20 (58,8%) мужчин. При вскрытии взяты для исследований фрагменты средних мозговых, сонных, коронарных, почечных, подвздошных, позвоночных артерий, грудной и брюшной аорты.

Определение типа и стадии бляшек основывалось на морфологической классификации АНА (American Heart Association, 1995) [25] с учетом макроскопической и микроскопической картины. Применяли окраски гематоксилином и эозином, орсеином, а также импрегнацию серебром. ИГХ-реакции проведены на парафиновых срезах (табл. 1).

Для определения ИГХ-экспрессии маркеров эндотелия новообразованных сосудов применяли выявление CD105 (Endoglin), для мастоцитов — анти-MCT (anti-mast cell tryptase), для макрофагов — CD68. Использована автоматизированная система Dako Autostainer Plus («Dako Cytomation», Дания). Для количественного анализа использовали метод «hot spots», ранее примененный I. Van der Auwera и соавт. (2006) для денситометрии лимфангиогенеза в опухолях [26]. Исследование проводили при помощи оптического микроскопа при увеличении 200, что соответствует 0,74 мм² поверхности среза. Все ИГХ-исследования были произведены в Научном центре по изучению ангиогенеза (Тимишоара, Румыния). Оценка результатов основана на определении плотности распределения окраски и интенсивности окончательной реакции, отраженной в количественном соотношении в различных зонах атероматозных бляшек. Мастоциты выявлены во многих типах атеросклеротических бляшек, особенно в адвентиции, а также в непосредственной близости от бляшек и в субэндотелиальных слоях. Для статистического анализа использовали коммерческое программное обеспечение SPSS19.0 и Microsoft Office 2013 (Microsoft Excel Worksheet), а также тест χ2.

Клинические данные и результаты прижизненных лабораторных анализов из историй болезни пациентов приведены в табл. 2.

При оценке результатов для выявления корреляции между экспрессией тучных клеток, макрофагов и новообразованных сосудов, их гистотопографической локализации и гистопатологических типов атеросклеротических бляшек изначально применили обычную гистопатологическую классификацию в соответствии с рекомендациями ВОЗ. Для оценки интенсивности реакций мы использовали принцип, основанный на количестве положительно окрашенных клеток и сосудов: отрицательная (0), слабоположительная, менее 10% окрашенных клеток, (1+); умереннo положительная, 11—50% окрашенных клеток, (2++); сильно положительная, более 50% окрашенных клеток, (3+++).

Гистопатологический анализ выявил существование следующих трех основных (условных) типов атеросклеротических поражений в двух исследуемых группах: промежуточное поражение — ПП, фиброзная бляшка (сформированная) — ФБ, фиброзная кальцинированная бляшка (и/или осложненная) — ФКБ во всех исследуемых сосудах. Гистопатологическая оценка с определением микроскопической стадии и типа атеросклеротических бляшек отражены в табл. 3.

Конечная, положительная, ИГХ-реакция на триптазу мастоцитов (анти-МСТ) проявлялась окрашиванием в виде гранулированного цитоплазматического узора, ограниченного тучными клетками (некоторые из них с дегрануляцией). Соотношение экспрессии триптазы мастоцитов и CD68-макрофагов с гистотопографическим распределением в бляшке представлены на рис. 1, 2; различные изменения количества мастоцитов в атеросклеротических бляшках — на рис. 3, 4, экспрессия CD105 в новообразованных сосудах в атеросклеротической бляшке — на рис. 5, 6.

В данном исследовании показано существование дифференцированной экспрессии CD68 и CD105 и изменение количества тучных клеток (реакция с анти-МСТ на триптазу мастоцитов) в различных типах атеросклеротических поражений и в разных артериях во взаимосвязи с их гистотопографическим распределением. Полученные сведения подтверждают современные представления о механизмах атерогенеза. Для сравнения, по-видимому, можно использовать ангиогенез при опухолевых процессах, при которых тучные клетки и макрофаги так же, как и при формировании атеросклеротических бляшек, участвуют в новообразовании сосудов. Это допустимо только при обсуждении общих механизмов и звеньев патогенеза.

Реакция с анти-МСТ и определение экспрессии CD68 являются селективными маркерами для тучных клеток и макрофагов, которые являются важными компонентами иммунных процессов, участвуя в их инициировании, пролиферации и дифференцировке клеток в атеросклеротических поражениях. Наряду с Т-лимфоцитами и макрофагами также участвуют и другие иммунные эффекторные клетки. Лимфоциты и макрофаги в количественном отношении преобладают над тучными клетками. Все вместе они выполняют важную функцию в атерогенезе, что объясняется выработкой протеаз, в том числе тех, что производятся макрофагами с их накоплением в области некротического ядра бляшки.

Факторы, вырабатываемые мастоцитами и макрофагами, способствуют разрушению межклеточного матрикса и вызывают дополнительную модификацию ЛПНП. В большинстве изученных сосудов положительные реакции с анти-MCT и CD68 выявлялись на уровне эндотелия, в самой атеросклеротической бляшке, в средней оболочке и адвентиции, а также на уровне vasa vasorum.

Эндотелиальные клетки, мастоциты, макрофаги и лимфоциты, очевидно, являются эффекторными клетками, участвующими в атерогенезе, с развитием бляшек у пациентов с АТ и MС. Мастоциты регулируют поведение гладкомышечных клеток (ГМК), очевидно, посредством секретируемых ими медиаторов. Коллагеновые волокна, производимые ГМК, могут предотвращать разрывы атеросклеротических бляшек. Однако химаза угнетает пролиферацию тучных клеток и синтез коллагена ГМК, тем самым уменьшая стабильность бляшки. Действие мастоцитарных провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, индуцирует экспрессию протеазы ГМК. TNF-α-положительные мастоциты, ММР-цистеин, катепсинположительные протеазы ГМК совместно с макрофагами предполагают регуляторную роль в экспрессии клеточных медиаторов, протеаз тучных клеток, в активации ГМК в зонах разрывов атеросклеротических бляшек. Локализация мастоцитов и макрофагов в стенке сосудов (периваскулярная и на уровне интимы) играет важную роль в патогенезе АТ и, возможно, является одним из основных факторов развития острых сердечно-сосудистых заболеваний (в частности, инфаркта миокарда и инсульта).

Роль ангиогенеза в развитии АТ, вероятно, является комплексной и зависит от стадии патологического процесса. Развитие микрососудов в атероматозных бляшках является результатом неоваскуляризации, новообразованные микрокапилляры являются хрупкими и подвержены разрывам с последующими кровоизлияниями в бляшку. Отложения фибрина в бляшке, образование гемосидерина и начало иммунного воспаления являются доказательствами кровотечения внутри атероматозных поражений. Значение ангиогенеза в дестабилизации и разрушении атеросклеротической бляшки остается нерешенным вопросом, но некоторые недавние суждения о первопричинах нестабильности бляшки могут привести к новой перспективной интерпретации атерогенеза в целом.

Закономерности развития (стабильность и нестабильность) атеросклеротической бляшки в значительной степени зависят от ангиогенеза. Наши результаты показывают, что сравнительный ИГХ-метод с применением сосудистых маркеров демонстрирует важные патогенетические аспекты в формировании атеросклеротической бляшки. Мастоциты и макрофаги, а также другие иммунокомпетентные клетки играют важную роль в развитии атеросклеротических бляшек и не в последнюю очередь в процессе ангиогенеза. Возникает вопрос, может ли ингибирование ангиогенеза быть терапевтической мишенью при АТ и как это можно использовать при лечении МС?

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что антиангиогенная терапия может иметь потенциальное влияние на развитие неоинтимы при атеросклеротических поражениях, а побочные эффекты и воздействие вредных факторов, вероятно, ингибируют функцию эндотелия и его регенерацию. Указанные утверждения поддерживаются научными данными большого числа лабораторий, демонстрирующими, что VEGF оказывает защитное действие на эндотелий артерий. Недавние клинические исследования антител ингибитора VEGF при применении бевацизумаба и авастина для терапии злокачественных опухолей показали, что до 5% всех пациентов, получавших авастин, могут иметь повышенный риск тромбоэмболии, а также острых инсультов, инфаркта миокарда и флеботромбоза. Эти данные позволяют предположить, что эндогенный VEGF может играть определенную атеропротективную роль. Множество биологически важных функций VEGF и сохранность эндотелия сосудов являются вескими аргументами, которые в настоящее время ограничивают любые антиангиогенные подходы к лечению сердечно-сосудистых заболеваний.

Таким образом, CD105 является чувствительным маркером новообразованных эндотелиальных клеток, эффективным показателем активации и пролиферации микрососудов в атеросклеротических бляшках. Процесс неоваскуляризации в бляшках зачастую начинается с интимы, прогрессирует и приводит в дальнейшем к их дестабилизации (интрамуральные кровоизлияния, разрывы и др.). Применение окраски анти-MCT (Anti Mast Cell Tryptase) для выявления мастоцитов и CD68 для макрофагов позволяет выяснить важные закономерности развития атеросклероза и его осложнений у пациентов с метаболическими нарушениями.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: М.Р., Е.Г.З.

Сбор и обработка материала: М.Р., А.И.М.

Статистическая обработка: А.И.М.

Написание текста: А.И.М., Е.Г.З.

Редактирование: А.И.М., Е.Г.З.

Конфликт интересов отсутствует.