Ангиогенез — многоступенчатый процесс образования новых кровеносных сосудов. В норме у взрослого человека ангиогенез встречается только во время заживления ран. Аномальный ангиогенез наблюдается при ряде хронических заболеваний, таких как сахарный диабет, ревматоидный артрит, псориаз, другие заболевания соединительной ткани и опухоли, и характеризуется формированием слепо заканчивающихся сосудов с повышенной проницаемостью и дезорганизацией архитектуры [1]. Особенно активный ангиогенез наблюдается в злокачественных опухолях. Существует несколько возможных путей для ангиогенеза, ассоциированного с опухолью:

1) секреция опухолевыми клетками эндотелиальных факторов роста, которые стимулируют рецепторы эндотелиальных клеток, например эндотелиального сосудистого фактора роста (VEGF) [2];

2) уменьшение активности естественных ингибиторов ангиогенеза [3];

3) ангиогенез, опосредованный циркулирующими CD34-позитивными предшественниками эндотелиальных клеток. Механизм пока неизвестен, но предполагается роль генетической регуляции [4].

Ангиогенез необходим для роста первичной опухоли, ее инвазии и формирования метастазов. Доказано, что опухоль не может вырасти до размера более 106 клеток (или 1—2 мм3) без адекватного ангиогенеза и образования интратуморальной сосудистой сети из-за нехватки кислорода и питательных веществ. Опухолевый ангиогенез состоит из двух фаз, отделенных «ангиогенным переключением». Аваскулярная фаза характерна для опухолей менее 1—2 мм в диаметре. Эти опухоли являются «спящими», так как процессы пролиферации и апоптоза находятся в равновесии. Некоторые из этих опухолей вступают во вторую, васкулярную, фазу, для которой характерен экспоненциальный рост опухоли и дисбаланс про- и антиангиогенных факторов [5].

Переключение с «неангиогенного» на «ангиогенный» фенотип может происходить в один этап при злокачественной трансформации или, что встречается чаще, увеличение ангиогенного потенциала происходит постепенно: от нормальной ткани к доброкачественной опухоли, а затем к злокачественной [6]. Запуск ангиогенеза включает в себя каскад реакций, приводящий к активации клеток эндотелия: ретракции перицитов, экспрессии новых белков клеточного цикла, секреции факторов роста (фактора роста фибробластов, инсулиноподобного фактора роста-1, интерлейкина-6, тромбоцитарного фактора роста), гиперэкспрессии одних генов и к подавлению экспрессии других [7]. Базальная мембрана и строма протеолитически деградируются металлопротеиназами, коллагеназами и плазмином, что приводит к пролиферации и миграции эндотелиальных клеток и формированию капиллярных трубок. Таким образом, сосуды в опухоли являются нестабильными, незрелыми, не имеют полноценной базальной мембраны и перицитов, межэндотелиальные поры значительно увеличены (рис. 1) [8]. В отличие от нормальных сосудов опухолевые сосуды не формируют венул, артериол и капилляров, а образуют хаотичную сеть из сосудов всех типов сразу. Сосудистая сеть в опухолях «негерметичная» и часто вызывает кровотечения, обусловленные избыточной выработкой VEGF [9, 10].

Достигнув определенного критического размера опухоль не может расти дальше без неоваскуляризации, хотя были показаны и неангиогенные пути прогрессирования рака молочной железы и немелкоклеточного рака легкого за счет захвата ранее существующих сосудов или сосудистой мимикрии [6].

Микрососудистая мимикрия (vasculogenic mimicry) — процесс формирования каналов из опухолевых клеток, пропускающих жидкость и обладающих высоким инвазивным потенциалом. Характеристиками микрососудистой мимикрии являются:

— выстилка канала опухолевыми, а не эндотелиальными клетками;

— обеспечение тока крови к опухоли;

— положительная реакция с реактивом Шиффа (PAS-реакция) и отрицательная с CD31;

— ремоделирование межклеточного матрикса;

— экспрессия мультипотентного фенотипа, подобного стволовым клеткам;

— ассоциация с плохим прогнозом и короткой 5-летней выживаемостью [12].

Различают два типа микрососудистой мимикрии. Первый тип, тубулярный, морфологически похож на кровеносные сосуды, выстланные эндотелиальными клетками. Второй тип, матриксный, не напоминает кровеносные сосуды ни морфологически, ни топологически. В подобном матриксе можно обнаружить ламинин, гепарансульфатпротеогликан и коллагены IV и VI типов. Данный тип мимикрии обнаружен в увеальной меланоме, меланоме кожи и слизистых оболочек, воспалительном и протоковом раке молочной железы, карциномах яичника и предстательной железы, а также в саркомах мягких тканей, включая синовиальную рабдомиосаркому и феохромоцитому [13]. Микрососудистая мимикрия, описанная в воспалительном раке молочной железы, наблюдается в 8% хирургически удаленных опухолей, не характерна для метастатических и является признаком неметастазирующих опухолей [14, 15].

Новообразованные кровеносные сосуды вокруг опухоли играют важную роль в развитии многих новообразований, так как обеспечивают адекватную оксигенацию и питание клеток. Гипоксия в микроокружении многих опухолей связана со структурными и функциональными особенностями сосудов, а также повышенным потреблением кислорода опухолевыми клетками ввиду их быстрой пролиферации. В новообразованиях, в которых можно измерить непосредственную оксигенацию опухолевой ткани с помощью микроэлектрода Эппендорфа, таких как рак шейки матки и саркома мягких тканей, тяжелая интратуморальная гипоксия (pO2 <10 мм рт.ст.; ~1,5% O2) ассоциирована с повышенным риском метастазирования и уменьшением как безрецидивной, так и общей выживаемости пациентов [16, 17].

Кровеносные сосуды могут быть выявлены с помощью иммуногистохимического окрашивания с использованием моноклональных антител к эндотелиальным клеткам (рис. 2).

CD34 — молекула адгезии, которая экспрессируется в клетках многих тканей, например пуповины, костного мозга, мезенхимальных стволовых, предшественниках эндотелиальных клеток и в самих эндотелиальных клетках кровеносных, но не лимфатических сосудов [11].

PECAM-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule-1, молекула адгезии тромбоцит-эндотелиальных клеток), или CD31, — член семейства молекул адгезии поверхностных гликопротеинов, вовлеченный в межклеточные взаимодействия, процессы эмбриогенеза и развития тканей. Недавние исследования показали, что PECAM-1 вовлечен в опухолевый ангиогенез и может быть маркером этого процесса [18].

Маркеры CD34 и CD31, несмотря на некоторые разногласия разных авторов, традиционно используются для выявления именно кровеносных сосудов и оценки плотности этих сосудов в ткани.

Плотность микрососудов (microvascular density) — параметр для оценки роста новых кровеносных сосудов, который широко исследуется при различных заболеваниях человека, особенно при злокачественных опухолях. Увеличение плотности микрососудов считается неблагоприятным фактором для многих опухолей, особенно при раке предстательной железы, молочной железы и злокачественных заболеваниях системы крови [19—21]. В исследовании A. Guidi и соавт. [22] сравнивалась плотность кровеносных сосудов внутри первичного опухолевого узла и метастатических очагов, а также оценивалась взаимосвязь плотности сосудов и выживаемости пациенток, получавших химиотерапию. Авторы отметили, что наличие увеличенной васкуляризации в метастазах, но не в самой опухолевой ткани, является прогностически неблагоприятным фактором.

Лимфангиогенез. Наряду с продукцией ангиогенных факторов, которые взаимодействуют с эндотелиальными сосудистыми клетками, раковые клетки продуцируют лимфангиогенные факторы, которые взаимодействуют с лимфатическими эндотелиальными клетками и стимулируют лимфангиогенез. Лимфатические сосуды отличаются по строению от кровеносных (табл. 1).

Выделены иммуногистохимические маркеры лимфатических эндотелиальных клеток (табл. 2), которые играют большую роль в опухолевом лимфангиогенезе. VEGF-R3 — один из четырех типов рецепторов VEGF; после органогенеза экспрессируется эндотелиальными клетками лимфатических сосудов, хотя в некоторых опухолях может выявляться и в эндотелиальных клетках кровеносных капилляров. Подопланин, LYVE-1 и PROX-1 обнаружены исключительно в зрелых эндотелиальных клетках лимфатических сосудов и являются маркерами лимфатических сосудов. LyP-1 в нормальных лимфатических сосудах не присутствует, но экспрессируется в лимфатических сосудах опухолей [23].

Для оценки лимфангиогенеза по аналогии с ангиогенезом определяется плотность лимфатических сосудов с помощью иммуногистохимического окрашивания с антителами к подопланину.

Подопланин — муциноподобный трансмембранный гликопротеид, содержащий 162 аминокислоты. В норме подопланин содержится в подоцитах почек, плаценте, легких, скелетных мышцах, миофибробластах молочной и слюнной желез, в остеобластах, мезотелиальных клетках, базальных слоях эпидермиса и эндотелии лимфатических, но не кровеносных сосудов [24, 25]. На первом международном конгрессе по методологии оценки лимфангиогенеза в солидных опухолях (first international consensus on the methodology of lymphangiogenesis quantification in solid human tumours) подопланин был принят как наиболее достоверный маркер лимфатических сосудов [26]. У подопланиндефицитных мышей наблюдаются лимфедема и расширенные нефункциональные лимфатические сосуды: животные умирают сразу после рождения от дыхательной недостаточности [27]. Гомолог подопланина активируется у мышей при воздействии канцерогенами, что свидетельствует о его роли в канцерогенезе. Экспрессия подопланина индуцируется геном Prox-1 и специфическим эндогенным рецептором, обнаруженным на тромбоцитах, возможно, поэтому подопланин вызывает агрегацию тромбоцитов [24].

Замечено, что подопланин сильнее экспрессируется в опухоли по сравнению с нормальной тканью [28]. Особенно выраженная экспрессия подопланина отмечена в агрессивных опухолях с высоким инвазивным и метастатическим потенциалом, ввиду чего он рассматривается как терапевтическая мишень для лимфоваскулярных и опухолевых клеток. Экспрессия подопланина замечена во многих типах злокачественных опухолей, например плоскоклеточном раке гортани, легких, ротовой полости, шейки матки, пищевода и кожи, сосудистых опухолях, мезотелиоме, опухолях центральной нервной системы, плоскоклеточных карциномах. Однако в работе B. Agarwal не обнаружено увеличения плотности лимфатических сосудов при неопластической трансформации, наоборот, внутри опухоли плотность лимфатических сосудов была ниже по сравнению с доброкачественными опухолями и карциномами in situ [29]. Согласно другому мнению, подопланин экспрессируется в тех случаях, когда инвазия опухолевых клеток в лимфатические сосуды массовая (неединичная) и зависит от микроокружения. На экспрессию подопланина влияет эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, фактор некроза опухоли и брадикинин [25].

В норме подопланин выявляется не только в нормальном эндотелии лимфатических сосудов, но и в миоэпителиальных клетках долек и протоков молочной и предстательной желез; однако реакция имеет не линейный характер, как в эндотелии, а гранулярный, с неровным краем (granular, branching membranous), чаще всего умеренная или выраженная [19].

Иммуногистохимическое исследование с антителами к подопланину все чаше используется для оценки плотности лимфатических сосудов, которая определяется путем подсчета количества позитивно-окрашенных сосудов на увеличении в 200 раз в 5 полях зрения. Во многих работах оценивается общая плотность лимфатических сосудов [19, 28], однако в ряде работ отдельно учитывается интратуморальная и перитуморальная плотность (по периферии, на расстоянии 2 мм от инвазивного компонента опухоли) [30]. Отмечается, что лимфатические сосуды в центре опухоли обычно мелкие, неправильной формы и спавшиеся, в то время как по периферии большего размера и расширенные [31]. Разделение на интратуморальную и перитуморальную плотность связано с разным прогностическим потенциалом.

Изначально была обнаружена взаимосвязь интратуморальной плотности и наличия метастазов в лимфатических узлах при раке поджелудочной железы, плоскоклеточных карциномах головы и шеи, папиллярном раке щитовидной железы [32—34]. M. Scobe продемонстрировал связь повышения уровня VEGF-C в раке молочной железы с увеличенным интратуморальным лимфангиогенезом и увеличением количества метастазов в легких и регионарных лимфатических узлах [35]. T. Padera определил повышение количества метастазов в отсутствие обнаруженных интратуморальных лимфатических сосудов и впервые предположил, что функциональных лимфатических сосудов по периферии опухоли вполне достаточно для метастазирования [36]. В эксперименте на модели рака предстательной железы также отмечалось большое количество метастазов в лимфатических узлах при отсутствии интратуморальных лимфатических сосудов [37]. Аналогичные результаты получены P. Bono, Y. Zhao и соавт., показавшими, что в перитуморальных лимфатических сосудах чаще обнаруживаются инвазия и опухолевые эмболы. Поэтому считается, что именно перитуморальный лимфангиогенез ассоциирован с агрессивностью опухоли [31, 38]. Ряд ученых отмечают взаимосвязь плотности лимфатических сосудов и наличия метастазов в лимфатических узлах без указания зоны исследуемых сосудов [19, 20, 28, 30].

Большинство авторов сходятся во мнении, что плотность лимфатических сосудов не коррелирует с клинико-морфологическими данными, такими как размер и тип опухоли, степень злокачественности [19, 20, 30]. Однако в исследовании Y. Zhao показана достоверная связь интратуморальной плотности лимфатических сосудов с размером опухолевого узла: большие опухоли имели меньшую плотность лимфатических сосудов [31]. Авторы объясняют это тем, что опухолевые лимфатические сосуды разрушаются разрастающимися опухолевыми клетками или высоким интерстициальным давлением, создаваемым разрастающейся опухолевой массой [39].

Отдельно оценивается связь плотности лимфатических сосудов с прогнозом. Отмечается, что высокая перитуморальная плотность сопряжена с плохим прогнозом при колоректальном раке, раке предстательной железы, легкого и молочной железы [31, 40, 41]. При этом связи между инвазией в лимфатические сосуды и общей и безрецидивной выживаемостью не наблюдалось [31]. Для данного феномена существует несколько возможных объяснений. Во-первых, гистологическое выявление лимфатических сосудов с инвазией на определенных участках опухоли и срезах может не соответствовать реальному числу вовлеченных лимфатических сосудов. Во-вторых, вовлечение лимфатических сосудов не обязательно приводит к поражению лимфатических узлов, поэтому мы можем наблюдать инвазию в лимфатические сосуды и малое количество пораженных лимфатических узлов. Следовательно, инвазия в лимфатические сосуды — ненадежный маркер для определения прогноза [31].

Вопреки всеобщему убеждению, что в злокачественных новообразованиях плотность лимфатических сосудов выше, чем в нормальных тканях или в доброкачественных опухолях, в работе Y. Zhao данная корреляция обнаружена для перитуморальной плотности лимфатических сосудов, но не для интратуморальной [31].

Большинство авторов сходятся во мнении, что подопланин экспрессируется в агрессивных опухолях с высоким инвазивным и метастатическим потенциалом. Однако прогностическая значимость этого маркера до конца не определена. Также остается открытым вопрос, в какой зоне оценивать плотность лимфатических сосудов, выявленных с помощью антител к подопланину. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для выявления различий в экспрессии подопланина в нормальных и патологических тканях.

Кроме того, необходимо помнить об относительной специфичности ИГХ-маркеров. Так, сиаломуцин CD34, маркер эндотелия кровеносных сосудов, в небольшом количестве экспрессируется подопланинпозитивными эндотелиальными клетками лимфатических сосудов опухоли более чем в 60% опухолей толстой кишки, молочной железы, легких и кожи [42].

CD31 экспрессируется в эндотелиальных клетках как кровеносных сосудов, так и малых лимфатических сосудов, хотя не является специфическим маркером лимфатической системы.

Часто используется одновременно иммуногистохимическая реакция с антителами к подопланину и CD34/CD31. Поскольку экспрессия CD34 и CD31 очень вариабельна в опухолевых сосудах, наличие опухолевых комплексов в сосудах с положительным подопланином классифицируется как инвазия в лимфатические сосуды независимо от уровня экспрессии CD34 и CD31 [42]. В случае экспрессии обоих маркеров (CD34 и CD31) и в отсутствие экспрессии подопланина сосуды считаются кровеносными [43].

Ретракционные щели — пустые пространства вокруг опухолевых гнезд без эндотелиальной выстилки, достаточно часто наблюдаемые в гистологических препаратах (рис. 3). Ранее они считались артефактом и следствием неправильной фиксации препарата, однако в 2007 г. G. Acs и соавт. обнаружили, что ретракционные щели чаще встречаются вокруг клеток рака молочной железы по сравнению с доброкачественными протоками и их количество резко возрастает при наличии метастазов в подмышечных лимфатических узлах. В связи с этим была выдвинута гипотеза о том, что ретракционные щели — не артефакт, а звено лимфоваскулярной инвазии. Гипотеза подтвердилась, когда была обнаружена корреляция между наличием ретракционных щелей и лимфатической инвазией, выявленной иммуногистохимическим окрашиванием с антителами к подопланину. Также отмечалась связь между размером и типом опухоли, количеством метастазов и общей и безрецидивной выживаемостью [44]. Позже было показано, что ретракционные щели чаще всего встречаются в карциномах молочной железы неспецифического типа и являются «прелимфатическими каналами», которые под действием факторов роста, секретируемых опухолью, могут эндотелизироваться и стимулировать лимфангиогенез, ассоциированный с опухолью [45]. Следует дифференцировать ретракционные щели и опухолевые эмболы в лимфатических сосудах по наличию эндотелиальной выстилки.

Другим исследованием, проведенным на материале рака желудка, является работа M. Senchukova и M. Kiselevsky. Авторы предполагают новый способ образования сосудов — «полостной тип ангиогенеза», который схематично можно представить тремя этапами: 1) формирование полостных структур в опухоли и слизистой оболочке; 2) выстилка полости эпителиальными клетками; 3) проникновение в сосудистое русло органа. Полости в свою очередь могут возникают тремя способами: 1) отслойка эпителия (как нормального, так и опухолевого) от базальной мембраны и их десквамация в просвет облитерированных желез желудка; 2) дилатация желез желудка и истончение их стенок; 3) формирование полости непосредственно из собственной пластинки или опухолевой стромы. Также было отмечено снижение 3-летней выживаемости и положительное воздействие антибактериальных препаратов на прогноз у пациентов с 1-м типом образования полостей [46].

Вопросы ангиогенеза в опухолевой ткани представляют, несомненно, большой интерес особенно в связи с разработкой методов антиангиогенной терапии. В то же время, несмотря на большое количество публикаций по данной теме, остаются неясными способы образования новых сосудов, влияние плотности внутриопухолевых сосудов на общую и безрецидивную выживаемость в карциномах in situ и инвазивных новообразованиях. Работ, в которых изучаются ретракционные щели в опухолевой ткани, крайне мало. Однако полученные корреляции свидетельствуют о возможном участии пустот вокруг опухолевых клеток в лимфангиогенезе и соответственно образовании метастазов в лимфатических узлах, что неблагоприятно сказывается на прогнозе. Ввиду этого изучение ретракционных щелей, механизмов их образования, влияние на развитие лимфатических сосудов и возможная таргетная терапия представляются интересными и перспективными направлениями.

Конфликт интересов отсутствует.